OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用
【专利摘要】本发明涉及OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用。本发明首次发现OsMADS47基因具有直接调控水稻籽粒长度的功能，通过在水稻中过量表达OsMADS47基因，从而增加转基因水稻的籽粒长度，且OsMADS47基因的表达量与籽粒长度显著相关。为增加水稻籽粒长度及改良水稻粒型提供了重要的基因资源及思路，为OsMADS47基因直接应用于水稻籽粒长度的改良提供了理论支持。对于加快水稻育种进程，提高水稻产量方面具有重要意义。
【专利说明】
0sMADS47基因在调控水稻粒型中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程及遗传育种领域，具体地说，设及0SMADS47基因在调控水稻 粒型中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上重要的农作物之一，其产量性状是育种家关屯、的重要农艺性状，而 水稻粒型性状是决定水稻产量的重要因素之一。近年来，大量控制水稻巧粒大小的QTL被鉴 定出来，而其中一些在育种工程中被广泛选择或只存在于部分优良品种中，还有一些QTL仅 在一定的品种中有所应用。因此运些QTL虽然在决定巧粒大小中具有重要功能，但其调控粒 型的功能机制还不是很清楚，因此发掘新的粒型相关基因并阐述其功能机制对水稻产量的 提高具有重要意义。
[0003] 巧粒大小及其他器官大小是由各种植物激素如生长素、细胞分裂素及油菜素内醋 所控制。大量研究表明，油菜素内醋(Brassinoste;roid，BR)在拟南芥、水稻及其他一些物种 的种子发育中起重要的作用。水稻dll突变体显示出典型的BR缺失表型，表现为矮化、叶片 直立及小圆粒。D11编码细胞色素 P450(CYP724B1)，它与BR合成中的几个酶具有相当高的同 源性。与此相一致，喷施BR可恢复dll突变体的表型，运表明D11在BR合成中具有重要的作 用。拟南芥BR缺失突变体det2与dl 1突变体相似，也表现为种子减小。进一步分析发现BR可 W直接参与一系列种子大小调控基因的表达。在水稻BR信号转导途径中，BR受体基因 D61/ BRASSIN0STER0ID发生突变或BR信号转导途径的负调控因子GSK2超表达后均会导致巧粒变 小。SRS5(SMA化AND ROUND SE邸5)编码一个α-化bulin蛋白，该基因发生突变后影响细胞 的伸长进而导致巧粒变小，d61 sr巧双突变体显示出比双亲更小的巧粒表型，然而SRS5调 控BR信号转导途径的机制还不是很清楚。脚1 (BRASS IN0STER01D UPREGULATED1)基因是受 BR诱导的一个基因，编码一个1161;[义-100口-1161;[巧专录因子，作为131?反应的正向调控因子处 于D61/0SBRI1的下游。水稻中超表达脚1产生典型的BR表型包括大巧粒的形成。
[0004] 通过对水稻巧粒大小突变体进行遗传筛选，已鉴定出几个突变体，并对它们对应 的野生型等位基因进行了分析。多数被鉴定出的基因是通过BR信号转导途径介导细胞分裂 及细胞扩张正向调控巧粒大小。然而DLT(DWARF AND L0W-TILLERING)/D62/GS6基因编码一 个GRAS家族的转录因子正向调控BR信号途径及GA代谢过程，但该基因却是巧粒大小的负调 控因子，该表型与其他BR反应的正向调控因子缺失表型是截然相反的。DLT/D62/GS6由GSK2 直接憐酸化，GSK2是负调控BR途径的蛋白激酶，超表达GSK2会产生与BR突变体相似的小且 圆的巧粒。考虑到巧粒增大的表型对于gs6等位变异是特异的，与dlt和d62等位变异相比具 有很大的边际效应，且在水稻育种过程中化T/D62/GS6基因在梗稻中受到强烈选择，因此 gs6等位变异控制巧粒大小可能是通过不依赖于BR信号转导途径的未知机制。
[0005] 值得指出的是，大多数BR突变体除巧粒大小的表型外，还显示出明显的生长缺陷， 因此巧粒大小的改变可能是相关突变的二级效应。最近对于qGL3/q化3.1/OsPP化1的研究 部分解释了该问题。qGL3/qGL3.1/0sPPKLl基因编码一个憐酸化酶蛋白，特异的影响水稻粒 长。OsPPKLl与OsPP化3处于一个小基因家族的同一个分支，OsPPKL2与拟南芥的同源基因 BSUUBRI1洲PPRESS0R 1)处于另一个分支。B洲1与它的同源基因 BSL(BSU1-1化e)直接使 GSK3样激酶BIN2(BR-insensitive 2)去憐酸化，是位于下游BIN2活性的抑制因子，而正调 控BR信号转导途径。0SPPKL2可能与BSU1和B化功能相似而正调控BR信号转导途径，而 OsPPKLl和0SPPKL3可能在BR信号转导途径中起相反的作用，q化3/qGL3.1/0sPPKLl可能通 过调控BR信号转导途径特异的控制巧粒大小。BIN2直接憐酸化生长素信号转导途径的负调 节因子ARF2,而被认为是BR和生长素信号途径的节点蛋白，然而BIN2控制拟南芥巧粒大小 的具体机制尚不清楚。
[0006] 现有研究表明，大多数短营养期（sho;rt vegetative地ase)SVP-类MADS-box基因 控制分生组织的生成及开花时间，其中水稻0SMADS47便属于该类基因，是BR信号转导途径 的负调控因子，但有关0SMADS47对于水稻粒型的调控并未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供0SMADS47基因在调控水稻粒型中的应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明从水稻日本晴中分离克隆到含有MADS-box结构域的 0SMADS47基因，该基因在水稻中过量表达后，转基因阳性植株的巧粒长度极显著高于野生 型，可比野生型提高23%-30%。因此，在水稻中过量表达0SMADS47对增加水稻巧粒长度增 加具有重要意义，为水稻产量的提高提供了重要的基因资源。
[0009] 本发明提供0SMADS47基因在调控水稻粒型中的应用，其中0SMADS47基因的CDS序 列为：
[0010] i)SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列；或
[0011] ii)SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核巧酸且 表达相同功能蛋白质的核巧酸序列;或
[0012] iii化严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核巧酸 序列，所述严格条件为在含0.1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0013] iv)与i)、ii)或iii)的核巧酸序列具有90%W上同源性且表达相同功能蛋白质的 核巧酸序列。
[0014] 前述的应用，在水稻中过表达0SMADS47基因 W增加转基因水稻的巧粒长度。
[0015] 前述的应用，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，WcDNA为模板进行PCR扩增获得 0SMADS47基因的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物双元表达载体中，转化水稻，筛选阳 性转基因水稻植株。
[0016] 本发明优选使用植物双元表达载体PCAMBIA1305.1-APFHN。将0sMADS47基因的CDS 序列插入具有潮霉素抗性的载体PCAMBIA1305.1-APFHN的酶切位点SaU和化II之间，构建 得到携带有目的基因的重组表达载体。
[0017] 携带有目的基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII'Academy Press，New York,第411-463页；Geiserson和 Corey, 1998,Plant Molecular Biology,2"*^ Edition)〇
[0018] 本发明中采用农杆菌介导的转化方法，W水稻成熟胚愈伤组织作为受体材料，进 行水稻的转化。利用潮霉素筛选转基因水稻植株。
[0019] 前述的应用，采用PCR法鉴定阳性转基因水稻植株，PCR扩增所用引物为：
[0020] 正向引物：5 ' -GATCCTACCCATACGATGTTCC-3 '
[0021] 反向引物：5'-TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3'。
[0022] 前述的应用，转化的水稻品种优选日本晴'Nipponbare'。
[0023] 本发明还提供一种转基因水稻的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将携带 0SMADS47基因 CDS序列的植物双元表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的 AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和 移栽，筛选转基因水稻植株。
[0024] 前述的方法，所述携带0SMADS47基因 CDS序列的植物双元表达载体的构建方法如 下:采用基因重组（Infusion)的方法，将0SMADS47基因的CDS序列插入具有潮霉素抗性的植 物双元表达载体PCAMBIA1305.1-APFHN的酶切位点Sail和化II之间。
[0025] 本发明首次发现0SMADS47基因具有直接调控水稻巧粒长度的功能，通过在水稻中 过量表达0SMADS47基因，从而增加转基因水稻的巧粒长度，且0SMADS47基因的表达量与巧 粒长度显著相关。为增加水稻巧粒长度及改良水稻粒型提供了重要的基因资源及思路，为 0SMADS47基因直接应用于水稻巧粒长度的改良提供了理论支持。对于加快水稻育种进程， 提高水稻产量方面具有重要意义。
【附图说明】
[0026] 图l为本发明实施例l中重组表达载体pCAMBIA1305.1-APFHN::0sMADS47的结构示 意图。
[0027] 图2为本发明实施例2中口〔418141305.1-4口。歴：：〇3]^0547转化水稻日本晴后可显 著增加巧粒长度。其中，（A)0sMADS47转基因水稻的PCR检测；（B)阳性转基因株系种子形态； 0SMADS47转基因水稻巧粒长度(C)、宽度(D)及厚度化)的统计分析。
[002引图3为本发明实施例3中PCAMBIA1305.1-APFHN: :0sMADS47转基因水稻中0sMADS47 基因(A)及蛋白（B)表达水平。
[0029] 图4为本发明实施例4中口〔418141305.1-4口。歴：：〇3]^0547转基因水稻中粒长相关 基因的表达情况。
【具体实施方式】
[0030] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratoiy Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031] 实施例1 0SMADS47基因植物表达载体的构建及遗传转化
[0032] 利用TRIzol提取液提取日本晴水稻叶片总RNA，具体操作步骤如下：取lOOmg新鲜 植物组织在液氮中快速充分研磨，研磨过程中要保持研鉢中始终有液氮;将研磨成粉末的 样品转入预冷的1.5ml RNase打ee离屯、管中，加入1ml TRIZ化提取液震荡摇匀；室溫放置 5min后，加入0.5ml的氯仿，剧烈摇动离屯、管5min，在4°C条件下，12000;rpm离屯、lOmin，收集 滤液于收集管;溶液分为两层，下层为酪-氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离屯、管，加 入0.5ml异丙醇在15~30°C条件下，沉淀10min;4°C条件下，12000rpm离屯、10min，RNA沉淀管 壁和底部；去掉液体部分，加入1ml 75%酒精洗2次;风干后，加入25μ1 DEPC处理过的水溶 解RNA，储藏于-80 °C冰箱备用。DNa S e I消化，在RNaS e打e e的0.5m 1离屯、管中配制下列反应 液： RNA 2 帖 10 X DNase I Buffer 2 μ!
[0033] DNase I (?υ/μ1) 1 μ1 RNA.se inhibilOr (4〇υ/μΙ) 2 μ1 DEPCMr樹ted dtfflbO 补至总体积20 μ1
[0034] 于37°C反应30-40min。向体系中加入2.化 1 0.5mol/L EDTA，80°C恒溫2min;加入 10μ1 3M醋酸钢和250μ1的冰乙醇，-80°C放置20min;4°C条件下，12000巧m离屯、lOmin，弃上 清;干燥沉淀后，用适量的RNase free此0溶解，电泳检测，确认基因组中无 DNA污染。利用 反转录酶将其反转成cDNA。在RNase打ee离屯、管配制下列混合液：
[0035] 模板 RNA 化 g
[0036] 01ig〇(dT)i8(50yM/ml) 2μ1
[0037] DEPC-treated (1地2〇 补至总体积 10山
[0038] 70°C保溫5min后迅速在冰上急冷2minW上，离屯、数秒使混合液聚集于管底部。加 入W下反转录反应试剂： M-MLV 民everse Transcriptase (2001.1) 1 μ1 M-MLV 5 X React ion Buffer 4 μ1
[0039] Recombiiiat RNase inhibitor (4〇υ/μ!) 0.5 μ1 dNTPs(10mM/i) 2 μL 施ase-ftee ddHsO 补至总体积20 μ1
[0040] 于42 °C解育化。然后，70°C解育15min。冰上冷却，得到的cDNA溶液稀释1-100倍后 用于PCR扩增。
[0041] 采用基因重组（Infusion)的方法进行载体与目的片段之间的连接。W反转录获得 的日本晴叶片cDNA为模板，用引物5 '-TATCGATACCGTCGACATGGCTGGCGGCGGCGGTG-3 ' 和5 ' - GTCACCAATTCACACGTGTCACTTGGAGCTGAAGAGTG-3 ' 扩增获得0sMADS47基因的CDS序列（SEQ ID N0:1)，该基因编码区长度为747bp，编码一个含有248个氨基酸的MADS-box转录因子（SEQ ID NO: 2)。将扩增获得的0SMADS47基因 CDS序列插入具有潮霉素抗性的双元表达载体 PCAMBIA1305.1-AP即N的SaU和化11之间。构建好的重组表达载体PCAMBIA1305.1-AP即N:: 0SMADS47的结构如图1所示，用电击法转入农杆菌EHA105。利用水稻日本晴种子诱导愈伤作 为受体材料，用农杆菌介导的转化方法进行水稻的转化。水稻转化的具体操作步骤如下：
[0042] (1)水稻成熟胚愈伤组织的准备:水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满无菌斑的种子放 入烧杯中，用7〇%酒精消毒2111111。倒去酒精，加入25%(￥八化曰(：10溶液消毒3〇111111。倒去 化CIO溶液，用无菌水清洗3-5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min。倒去无菌水，将种子放在 无菌滤纸上吸干，胚朝上植入NsBs培养基中，28 °C暗培养3-4周。在超净工作台上打开培养 皿，用綴子选取胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则），置入梗稻继代培养基中，28 °C光培养 5-7天，长出淡黄色、质地坚硬呈颗粒状的胚性愈伤组织即可用于侵染。
[0043] (2)水稻愈伤组织的转化:愈伤组织的预培养及农杆菌的活化，侵染前将愈伤组织 转至新鲜的NsBs培养基上培养4天。挑取农杆菌单克隆接种到5ml LB液体培养基中（含50mg/ L利福平和50mg/L卡那霉素），28°C 220巧m培养至对数生长期晚期(约培养18-24h)。将活化 的农杆菌菌液按1%接种量转接50ml新鲜的LB液体培养基中（含50mg/L利福平和50mg/L卡 那霉素），28°C 22化pm培养至0〇6日日值为0.5左右（约培养化）。将菌液转入80ml离屯、管，4°C 4000g离屯、5分钟，弃上清，悬浮于添加有100μΜ乙酷下香酬(As)20ML的AMM液体培养基中。将 预培养的胚性愈伤组织浸入上述AMM(AS)菌液，侵染20分钟，缓慢摇动。用无菌吸水纸将愈 伤组织吸干，置于NsBs培养基上(培养基上铺一层无菌滤纸），26 Γ暗培养2-3天。共培养后的 愈伤组织用NsBs液体培养基或无菌水(含500mg/L头抱霉素)洗涂8次，用无菌吸水纸吸干后 置于工作台惊30min。将愈伤组织转至NsB日S1筛选培养基(含25mg/L潮霉素，400mg/L头抱霉 素），26°C暗培养2周。将愈伤组织转至NsB日S2筛选培养基(含50mg/L潮霉素，300mg/L头抱霉 素），26°C暗培养，每2周继代一次，筛选4周。将生长旺盛的抗性愈伤组织转至铺有3层滤纸 的干燥培养皿内，26 °C干燥2-3天。将干燥的愈伤组织转至MS分化培养基上，26 °C暗培养1 周，转变培养条件(28°C 12加寸光照/25°C 8小时黑暗）。每2周继代一次，至产生再生苗。将 再生的抗性苗转至新鲜的MS培养基生根。待再生苗长至10cm左右，打开封口膜，炼苗2-3天， 将再生苗移至溫室或大田中。
[0044] 实施例2 0SMADS47转基因水稻巧粒长度增加
[0045] 为了研究0SMADS47的功能，对转基因水稻植株和野生型水稻植株的巧粒表型进行 了分析。首先对所获得的两个T3代转基因纯合株系0E-U0E-2进行PCR鉴定，所用引物为正 向引物5 ' -GATCCTACCCATACGATGTTCC-3 ' 和反向引物5 ' -TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3 '，其中 一条引物位于载体上，另一条引物位于连入载体的0SMADS47基因上。结果显示，所获得的转 基因纯合株系0E-U0E-2的各个单株均具有目的大小片段，与之相比，野生型对照中无该片 段（图2A)。运说明目的载体已插入转基因纯合株系0E-U0E-2基因组中，为阳性株系。进一 步分析了 0E-U0E-2纯合转基因株系的巧粒表型，发现0E-U0E-2两个转基因株系的巧粒长 度极显著的高于野生型（图2B)。进一步对巧粒的粒长、粒宽及厚度进行了测定，统计结果见 图2C、2D和沈。野生型巧粒长度为4.93mm，而0sMADS47基因超表达株系0E-1和0E-2的巧粒长 度则分别为6.08mm和6.44mm，分别比野生型增加了23%和30%。同时0E-1和0E-2的巧粒宽 度较野生型极限著降低，而巧粒厚度与野生型相比无显著变化。运说明0SMADS47基因对水 稻巧粒长度具有正向调控作用。
[0046] 实施例3转基因水稻中0SMADS47转录水平及蛋白水平上表达分析
[0047] 为了进一步确认转基因株系0E-1和0E-2巧粒长度增加的表型是由0SMADS47超表 达所致，进一步对转基因水稻中0SMADS47的转录水平及蛋白水平上进行了分析。利用 TRIzol提取液提取野生型日本晴及转基因株系0E-1和0E-2水稻叶片总RNA，DNAase消化 DNA，反转录成cDNA作为模板。用表1中的引物进行Real-time PCR扩增，分析转基因株系中 0SMADS47基因的表达量。结果如图3A所示，在转基因株系0E-1和0E-2中，0SMADS47基因相对 表达量极显著的高于野生型对照，分别是野生型对照的112倍和193倍。由于植物双元表达 载体pCAMBIA1305.1-APFHN所连入基因的N段融合有Flag和HA标签序列，因此可W用Flag或 HA的抗体检测外源蛋白0SMADS47的表达情况。提取野生型、转基因株系0E-1和0E-2的总蛋 白进行western blot检测，结果如图3B所示。野生型中没有外源OsMADS47表达的信号，而转 基因株系0E-1和0E-2的各个单株均可W检测到外源0SMADS47的表达，并且0E-2转基因株系 的0SMADS47蛋白表达量高于0E-1株系，运与其0SMADS47基因的转录水平相一致。同时转基 因株系0E-2的巧粒长度也高于株系0E-1，因此0SMADS47的表达水平与巧粒长度具有正相关 性，即0SMADS47基因的表达水平越高，巧粒长度越长。
[004引表1 Real-time PCR扩增所用引物（5'一3'）
[0049]
[0050] 实施例4 0SMADS47转基因水稻中巧粒长度相关基因的表达情况分析
[0化1] 由于0sMDS47基因编码一个含有MADS-box结构域的转录因子，为了分析0sMADS47 基因调控水稻巧粒长度的分子机制，进一步利用Real-time PCR技术分析了0sMADS47超表 达对粒长相关基因的影响，所用引物见表2。在0E-1和0E-2转基因株系中油菜素内醋相关基 因 OsBRIl、Dll及化T等基因的表达量均极限著降低，运些基因位于油菜素内醋信号转导途 径中并参与对巧粒大小的调控。另外，OsPPKLl和OsPP化2在0E-1和0E-2转基因株系中的表 达量也极显著的低于野生型对照。W往研究表明，qGL3/qGL3.1/0sPPKLl编码一种含有两个 Kelch功能域的丝氨酸/苏氨酸憐酸酶，是PP化蛋白家族成员之一。细胞周期蛋白切clin- Τ1;3是其底物，OsPPKLl能够直接对切clin-Tl;3进行去憐酸化，通过调节切clin-Tl;3的憐 酸化状态来控制颖壳细胞分裂快慢进而调控巧粒大小。OsPPKLl与OsPP化3处于一个小基因 家族的同一个分支，对油菜素内醋信号转导途径起负调控作用，超表达OsPP化1和OsPP化3 均会导致粋位变短。在0sMADS47基因超表达的株系中，0sPPKLl、0sPPKL3、0sBRIl、Dll及DLT 的表达量降低，运暗示它们可能是0SMADS47转录因子调控的下游基因，进而影响巧粒大小。 (图4)
[0化2] 表2 Real-time PCR扩增所用引物（5'一3'）
[0化3]
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. OsMADS47基因在调控水稻粒型中的应用，其中OsMADS47基因的⑶S序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在水稻中过表达0sMADS47基因以增加转基 因水稻的籽粒长度。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，以cDNA 为模板进行PCR扩增获得0sMADS47基因的⑶S序列，并将所述⑶S序列构建到植物双元表达 载体中，转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体为pCAMBIA1305.1-APFHN〇5. 根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，用农杆菌介导的转化方法，以水稻成熟 胚愈伤组织作为受体材料，进行水稻的转化。6. 根据权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，采用PCR法鉴定阳性转基因水稻 植株，PCR扩增所用引物为： 正向引物：5 ' -GATCCTACCCATACGATGTTCC-3 ' 反向引物：5 '-TCCAGTCCATCGATCTCATCC-3 '。7. 根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，转化的水稻品种为日本晴 'Nipponbare'。8. 转基因水稻的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将携带0sMADS47基因 CDS序列的植物双元表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行 转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基 因水稻植株。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述携带0sMADS47基因 CDS序列的植物双 元表达载体的构建方法如下:采用Infusion法，将0sMADS47基因的⑶S序列插入具有潮霉素 抗性的植物双元表达载体PCAMBIA1305.1-APFHN的酶切位点Sail和Pmll之间。10. 根据权利要求8和9所述的方法，其特征在于，利用潮霉素筛选转基因水稻植株。
【文档编号】A01H5/00GK106011146SQ201610421531
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】李学勇, 房静静
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所