一种来源于菊芋的抗逆基因及其编码蛋白与应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于菊芋的抗逆基因LEA14及其制备方法和应用。菊芋抗逆LEA14基因碱基序列如SEQ ID NO1；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在85％以上的基因。LEA14编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明利用聚合酶扩增技术从菊芋块茎中克隆抗逆基因LEA14的基因序列，所获得的基因能用于植物遗传转化，提高植物对干旱、高盐等多种非生物胁迫的抗性，在植物抗逆改良研究与应用中具有极高的价值。
【专利说明】
-种来源于菊芋的抗逆基因及其编码蛋白与应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种来源于菊芋的抗逆基因 LEA14及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 菊芋俗称洋姜或鬼子姜，是一种可在盐碱地上种植的经济植物。与其它经济植物 相比，菊芋具有耐盐碱、耐旱、耐寒W及抗病虫害等抗逆特点。菊芋自身具有的多重抗逆性 状使其在基因特异性方面的开发潜力非常大，对菊芋抗逆基因进行研究，对于理解菊芋的 抗逆机制，W及进一步进行基因资源利用具有重要意义。
[0003] 胚胎晚期发生丰富蛋白（Xate embiyogenesis油undant protein,LEA)在减少环 境胁迫对植物伤害中起到重要的作用。在自然条件下LEA蛋白一般在种子发育晚期积累， 并能响应干旱、寒冷、高盐和ΑΒΑ等信号，对多种非生物胁迫具有很强的抵抗能力。LEA蛋 白通过保持细胞渗透压、保护细胞膜结构、作为分子伴侣保护其它蛋白等方式维持植物正 常的代谢反应。基于LEA蛋白的运种特性，通过基因工程技术使植物过表达内源或外源的 LEA蛋白，可W培育出抗旱、抗寒、耐盐的作物品种，在植物育种方面具有重要应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种来源于菊芋的抗逆基因及其制备方法和应用。
[0005] 一种来源于菊芋的抗逆基因，菊芋抗逆LEA14基因碱基序列如SEQ ID NO 1 ;
[0006] 或，与SEQ ID NO :1所示碱基序列同源性在85% W上的基因。
[0007] 菊芋抗逆LEA14基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2。
[0008] 本发明LEA14基因由750个核巧酸组成。本发明LEA14基因编码的蛋白质为胚胎 晚期发生丰富蛋白，由153个氨基酸组成。
[0009] 一种权利要求1所述的抗逆基因的制备，包括如下步骤：
[0010] 选取菊芋块茎提取总RNA，W总RNA为模板，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA ;
[0011] 设计两条引物，W上述cDNA为模板，结合5'建库引物进行PCR扩增，获得菊芋抗 逆LEA14基因片段；
[0012] 上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得SEQ ID NO 1所示菊芋抗逆基因 LEA14。
[0013] 所述引物为：
[0014] 3，-LEAP-1:5,-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3，；
[0015] 3 ' -LEAP-2:5'-ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'。
[0016] 一种抗逆基因的应用，所述抗逆基因在制备抗逆的转基因植物中的应用。
[0017] 所述抗逆基因在制备抗盐碱胁迫的转基因植物中的应用。所述抗逆基因在制备抗 旱的转基因植物中的应用。
[0018] 本发明实现的有益效果：
[0019] 本发明从菊芋中克隆获得抗逆蛋白编码基因 LEA14,属于胚胎晚期发生丰富蛋白 基因，与木本棉LEA基因序列相似性最高，但其序列相似性仅为67%。所获得的基因能用于 植物遗传转化，提高植物对干旱、高盐等多种非生物胁迫的抗性，在植物抗逆改良研究与应 用中具有极高的价值。为了进一步分析该基因在盐、干旱逆境中的作用与功能，采用本发明 获得基因可见，野生型拟南芥和本发明转LEA14基因的拟南芥在抗逆性上有明显的差异， 转LEA14基因的拟南芥比野生型的植株有明显的抗盐、抗干旱能力，可见LEA14基因的转入 提高了拟南芥植株的抗盐抗旱能力。通过本发明菊芋LEA14基因的获得，可W用于植物遗 传转化，提高植物对干旱、高盐等多种非生物胁迫的抗性，在植物育种方面具有重要应用价 值。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例提供的琼脂糖电泳鉴定总RNA产物图谱。
[002。 图2为本发明实施例提供的琼脂糖电泳鉴定cDNA产物图谱。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过具体实施例对本发明做进一步详述，W下实施例只是描述性的，不是限 定性的，不能W此限定本发明的保护范围。
[0023] 本发明利用聚合酶扩增技术从菊芋块茎中克隆抗逆基因 LEA14的基因序列，所获 得的基因能用于植物遗传转化，提高植物对干旱、高盐等多种非生物胁迫的抗性，在植物抗 逆改良研究与应用中具有极高的价值。
[0024] 所述抗逆LEA14基因，是通过W下方法获得的：
[002引 1.菊芋cDNA文库的构建
[0026] 本发明取生长健壮的成熟期菊芋块茎，用天根生化科技有限公司植物总RNA提取 试剂盒提取总RNA，W总RNA为模板，参照Clontech公司cDNA文库构建试剂盒说明，在反转 录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。
[0027] 2.引物的设计
[0028] 本发明设计两条特异性引物 3' -LEAP-1:5' -CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3' ；3' -LEA P-2:5' -ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'，结合cDNA文库构建试剂盒提供的5'建库引物扩增 菊芋LEA14基因。
[0029] 3.利用PCR方法获得LEA14基因片段
[0030] 本发明W合成的高质量cDNA双链为模板，利用正反向引物扩增LEA14基因序列。 PCR 条件为：① 95°C，4min ;② 95°C，30s ;58°C，30s ;72°C，lmin ;30 个循环；③ 72°C，10min。
[0031] 4.克隆鉴定与序列测定
[003引扩增片段采用北京百泰克公司DNA回收试剂盒回收纯化后，克隆连接到PMD19-T 载体中，转化D册α感受态细胞进行克隆鉴定和序列测定。
[003引 5.序列分析
[0034] 本发明通过核巧酸序列测定分析，最终获得抗逆相关基因 LEA14,其核巧酸序列信 息如SEQ ID NO 1所示，进而可得其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0035] 本发明所述的抗逆基因 LEA14能用于植物遗传转化，在提高抗逆性（抗盐、抗干 旱）植物中的应用。
[0036] 实施例1
[0037] 菊芋cDNA文库构建
[0038] 1. RNA 提取
[0039] 取50~lOOmg新鲜菊芋块茎组织，加入液氮后迅速充分研磨，匀浆后移至1. 5血 EP管，选用天根公司RNA提取试剂盒，提取总RNA。
[0040] 用1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA，产物见图1。图中28S和18S rRNA两条带清 B析，比例约为2:1，表示提取到的总RNA未降解，质量较高。
[0041] 2. cDNA文库构建
[0042] W总RNA为模板，参照Clontech公司cDNA文库构建试剂盒说明，在反转录酶和聚 合酶的作用下合成cDNA双链。
[004引用1%的琼脂糖凝胶电泳检测合成的cDNA，产物见图2。图中cDNA呈现出均匀分 布的弥散状条带，且片段大于l(K)bp，表明合成的cDNA质量较高。
[0044] 实施例2
[0045] PCR方法获得LEA14基因片段
[0046] 根据NCBI数据库中相近物种已有基因数据，运用Primer Premier 5. 0软件设计 引物：3, -LEAP-l:5'-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3' ；
[0047] 3' -LEAP-2:5' -ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3'，结合 cDNA 文库构建试剂盒提供的 5'建库引物，扩增菊芋LEA14基因。引物由上海生物工程技术有限公司合成。
[0048] 在灭菌的1. 5血EP管中依次混匀下列试剂：10 X PCR buffer 5. 0 μ L，dNTPs 4 μ L cDNA 模板 1 μ L (20ng)，引物 0. 5 μ L Taq 0. 5 μ L 加无菌水定容至 50 μ L。
[0049] PCR 反应程序为：95°C预变性 4min，95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 Imin， 共扩增30个循环，在72°C延伸lOmin。
[0050] 实施例3
[0051] 克隆鉴定与序列测定
[005引 1. PCR产物纯化与回收
[005引取上述实施例所得PCR产物经1. 0%琼脂糖120V电泳40min，邸染色后紫外线检 测扩增片段，在紫外仪下切取特异性条带，用北京百泰克生物技术公司的DNA回收试剂盒 进行基因片段回收。
[0054] 2.回收产物与PMD19-T载体的连接及转化
[005引将回收到的目的片段连接到PMD19-T载体中，体系如下：Solution I 1 μ LT载体 5 μ L目的片段DNA 4 μ L 16°C过夜连接。
[0056] 将上述10 μ L连接产物加入D册α感受态细胞中，轻柔混匀。
[0057] 冰浴30min，42°C水浴热激90s，冰浴2min，加入800 μ L LB液体培养基（37°C提前 溫浴），混匀。
[0058] 37 °C 摇床（50巧m，15min ;100巧m，15min ;150巧m，15min)培养，5000巧m 离屯、 3min，弃去800 μ L上清，余200 μ L吸吹均匀，涂布于含有100 μ g/mL Amp的LB平板上，至 菌液完全吸收，37Γ倒置培养过夜。
[0059] 3.目的片段序列测定
[0060] 挑取单菌落于ImL含100 μ g/mL Amp的LB液体培养基中，37°C、200;rpm振荡培养 3-4h〇
[006。 化培养好的菌液为模板，M13-F和M13-R通用引物PCR检测单菌落中是否插入目 的片段。引物序列为：M13-F:
[0062] 5, -GTAAAACGACGGCCAGTG-3, ；M13-R:
[0063] 5' -CAGGAAACAGCTATGACC-3'。
[0064] 挑选含有目的片段的阳性克隆送到上海生工进行测序。
[0065] 本发明通过核巧酸序列测定分析，最终获得菊芋抗逆基因 LEA14,其碱基序列信息 如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0066] 沈Q ID NO 1
[0067]
[0068] 序列特征：
[0069] 长度：750个碱基
[0070] 类型：DNA
[0071] 链型：单链
[0072] 拓扑结构：线型
[0073] 来源：菊芋化elianthus 1:ube;rosus Linn)
[0074] SEQ ID NO 2
[00 巧]
[0076] 序列特征：
[0077] 长度：153个氨基酸
[0078] 类型：氨基酸
[0079] 链型：单链
[0080] 拓扑结构：线型
[0081] 来源：菊芋化elianthus 1:ube;rosus Linn)
[00的]实施例4
[0083] 转基因拟南芥植株的获得及抗逆性分析
[0084] 1.植物表达载体的构建及农杆菌的转化
[00财 W限制性内切酶XBa I和Sac I分别双酶切LEA14基因的加酶切位点的PCR产物 和PCAMBIA2301载体，分别回收LEA14片段和PCAMBIA2301载体，W 5 :1的比例连接，通过 PCR和酶切对重组质粒进行鉴定。
[008引 1)酶切体系为：
[0087]
[008引 37。过夜。
[0089] 2)按实施例3的方法胶回收LEA14基因片段和PCAMBIA2301载体。
[0090] 3)将回收的LEA14片段与PCAMBIA2301表达载体在16°C下连接过夜，连接体系 为：
[0091]
[0092]
[009引 4)将连接产物转化大肠杆菌XLl-Blue，挑取单菌落，接种于20血LB+Km的Ξ角瓶 中，37Γ恒溫振荡培养过夜，W菌液为模板做PCR检测。将阳性菌落扩大培养，提取质粒并 纯化，用XBa I和Sac I做双酶切，检测克隆是否正确。
[0094] 5)将构建好的植物表达载体利用冻融法转化农杆菌EHA105,获得重组农杆菌，并 经PCR鉴定得到阳性转化子（含有SEQ ID NO 1所示的LEA14基因的转化子），用于侵染拟 南芥植株。
[0095] 2. LEA14转基因拟南芥的获得及鉴定
[0096] 将上述重组农杆菌侵染待转化的拟南芥植株花序，收取其种子。将收取的种子种 植在MS固体培养基的平板上（含Km 60 μ g/mL)筛选T。代阳性转基因植株。将绿色幼苗移 入盆中生长，待τ。代的绿色幼苗长大，结芙收取种子进行τ 1代阳性植株的筛选。将筛选得 到的Τι代阳性植株种植，收取不同Τ 1代阳性株系的种子。将收取的Τ 1代种子种植在含Km 60 μ g/血的MS固体培养基上，筛选T2代纯合株系。采用CTAB法提取纯合转基因株系基因 组进行PCR验证，得到T2代转基因拟南芥纯合体株系。
[0097] 3.含LEA14基因的转基因拟南芥的抗性鉴定
[009引将转基因拟南芥自交纯合一代，选取3个纯合转化株系，收取种子。播种后，幼苗 生长7天，用对照组野生型拟南芥和了2代转基因幼苗分别移置含有300mM化化和甘露醇 的MS固体培养基的平板上，培养10-25天研究植株的生长情况。结果如表1所示，盐胁迫 后70%左右非转基因植株枯萎而死，转基因植株死亡率仅为30%左右。在干旱胁迫下，非 转基因植株生长比转LEA14基因植株缓慢，T2代纯合系转基因植株的鲜重显著高于野生型 植株，表明转基因植株同野生型植株相比对干旱具有抗性。
[0099] 可见LEA基因在干旱和盐胁迫下的抗逆境功能，将可用于利用转基因技术改良作 物抗旱耐盐的研究和产业化生产中。
[0100] 表1转基因与野生型拟南芥的盐、干旱处理后生长情况
[0101]
【主权项】
1. 一种来源于菊芋的抗逆基因，其特征在于：菊芋抗逆LEAH基因碱基序列如SEQ ID NO 1 ； 或，与SEQ ID NO :1所示碱基序列同源性在85%以上的基因。2. 按权利要求1所述的抗逆基因，其特征在于：菊芋抗逆LEA14基因编码的氨基酸序 列如 SEQ ID NO 2。3. -种权利要求1所述的抗逆基因的制备，其特征在于：包括如下步骤： 菊芋cDNA文库的构建：选取菊芋块茎提取总RNA，以总RNA为模板，在AMV反转录酶的 作用下合成cDNA ; 设计两条引物，以上述cDNA为模板，结合5'建库引物进行PCR扩增，获得菊芋抗逆 LEA14基因片段； 上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得SEQ ID NO 1所示菊芋抗逆基因 LEA14〇4. 按权利要求3所述的抗逆基因的制备，其特征在于：所述引物为： 3' -LEAP-l:5，-CGCACCAATGTCCTTCACCAG-3，； 3' -LEAP-2:5'-ACACCTTAACCCCCACATCTAGC-3' 。5. -种权利要求1所述的抗逆基因的应用，其特征在于：所述抗逆基因在制备抗逆的 转基因植物中的应用。6. 按权利要求5所述的抗逆基因的应用，其特征在于：所述抗逆基因在制备抗盐碱胁 迫的转基因植物中的应用。7. 按权利要求5所述的抗逆基因的应用，其特征在于：所述抗逆基因在制备抗旱的转 基因植物中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK106011145SQ201510581421
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年9月14日
【发明人】杨少丽, 秦松, 王义鹏, 苏振, 李莉莉
【申请人】中国科学院烟台海岸带研究所