专利名称：编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段及用此片段制备狂犬病毒糖蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及可用于狂犬疫苗或其他诊断试剂的狂犬病毒糖蛋白。更具体说，本发明涉及编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段，通过表达所述基因片段而制备的重组的狂犬病毒糖蛋白，以及制备所述狂犬病毒糖蛋白的方法。
狂犬病是人类已知的最古老的疾病之一，对于人类和其他哺乳动物都是一种相当危险的传染性疾病，它在所有感染此疾病的哺乳动物中都能导致100%的死亡率。
日本具有下述有利条件的优越性即它是一个岛国，并已经对狗类实施了狂犬病预防措施(狗类是这种人类疾病的主要携带者)，而且每年都进行预防性注射。其结果是，此疾病已在1957年被成功地根除了。从那以后的约30年内，日本在根除狂犬病方面在世界上具有很高的地位，也就是说，没有发生所述疾病。然而，狂犬病仍然流行于世界，日本只不过是根除了狂犬病的一个相当罕见的例子。根据世界卫生组织1982年的统计数据，狂犬病在越南、泰国、菲律宾、印度、巴西、厄瓜多尔及类似国家流行很盛，并估计仅在印度一个国家，每年就有多达50，000人死于狂犬病。而且即使在日本，狂犬病问题也并未完全解决，对于去外国的游客(尤其是东南亚)来说，注射狂犬病疫苗仍是一种很重要的预防性接种。
回顾一下狂犬病疫苗的发展历史将会发现，狂犬病疫苗的发展首先起于法国巴斯德研究所的减毒疫苗，其次是由哺乳动物脑制备的失活疫苗及其部分纯化的疫苗，进一步是利用哺乳动物或鸟类的培养细胞通过细胞培养制备的疫苗。但所有这些疫苗都是第一代疫苗，并仍然具有安全及生产率等方面的问题。
Nishigahara菌株衍生物是一种适于制备动物和人疫苗的病毒株，它对于当代日本的狂犬病根除作出了巨大贡献。此病毒株是通过修改巴氏固定的狂犬病疫苗而制备的，后者是由法国巴斯德研究所制备的。也就是说，由于巴氏固定的狂犬病毒在兔中传代时的潜伏期为5至6天，Kondo等人(JapanMnistryofAgricultureandForestry，NishigaharaAnimalPlagueResearchInstitute)将此病毒分别在小豚鼠和兔中培养了大约90代，所得到的固定病毒的潜伏期缩短至3至4天，这在当时是最短的(JuekiChosashoKenkyuHokoku，AnimalPlagueResearchInstituteStudyReport，第1期，1918年8月出版)。
迄今已知的其他典型的狂犬病毒包括ERA株、CVS株、PV株等等。已经证实，这些狂犬病毒结构相同，都是由五种蛋白质即L、G、N、M1和M2构成。在这些病毒的构成蛋白中，已知G蛋白是一种制备疫苗的有效物质(Wiktor等人，J.Immunol.110269-276，1973)。近年来，已经制备了针对狂犬病毒每种构成蛋白的单克隆抗体，从而能够在还未确定的狂犬病毒株之间进行比较。Flamand等人(J.Gen.Virol.48105-109，1980)比较了若干狂犬病毒产生中和性抗体的能力，并比较了单克隆抗体对于与G蛋白相关的感染的预防作用，结果表明，G蛋白中至少存在有14个抗原决定簇，而且，通过这些反应型的比较能够使狂犬病毒株相互区别。此后，许多研究者利用一系列针对N蛋白的单克隆抗体，研究了由世界各地分离的街道狂犬病毒的抗原性。结果发现，在许多情况下，病毒的抗原性与分离它的地区或动物有关。由这些事实可产生一个严重问题，即仅仅一株疫苗不大可能预防全世界的狂犬病。然而，本发明的狂犬疫苗是由Nishigahara株产生的，而如上所述日本已经根除狂犬病这一事实已证明了这一菌株的优越性。
迄今为止，已经报导了一些利用基因重组技术表达狂犬病毒蛋白的试验，尤其是G蛋白。例如，L.T.Lawence等人(Vaccine84203-208，冷泉港实验室编)报导，一个编码狂犬病毒ERA株糖蛋白的基因被导入大肠杆菌(EscherichiaColi)的表达系统中进行表达，结果虽然糖蛋白基因在大肠杆菌中得到了表达，但由于宿主细胞是大肠杆菌而未发生糖基化作用，因此没有得到能作为有效免疫原的抗原。E.Yelverton等人(Science219614-619，1983)也报导了一个利用大肠杆菌表达狂犬病毒糖蛋白的实验。此报导没有给出任何已得到有效抗原的结果。此后，如日本专利公开(PCT)500949/1986所报导，在真核细胞如酵母或动物细胞中进行了G蛋白表达的尝试。虽然此报导描述了糖基化G蛋白的表达，但它没有给出任何用动物进行的免疫测试的结果。
正如上面的报导所指出，虽然成功地进行了G蛋白本身的表达，但从应用的观点看来，目前还未发展出一种利用这些G蛋白的有效的狂犬疫苗。
在这种情况下，本发明者通过应用基因重组技术进行了充分研究，企图发展出一种比第一代传统的狂犬疫苗更为安全有效的狂犬病毒疫苗。结果发现，通过本发明的基因重组技术能够得到所的狂犬糖蛋白，所述技术是指，克隆编码由Nishigahara株产生的狂犬病毒G蛋白的cDNA，将克隆的互补DNA(cDNA)插入真核细胞的表达载体中，以在真核细胞中进行表达。根据该方法，所需的狂犬病毒糖蛋白能在真核细胞中很好地表达。并且还证实了所表达的糖蛋白是一种有效疫苗。根据本发明利用基因重组技术制备狂犬病毒糖蛋白的方法，所需的糖蛋白是在胞质的局部进行表达，而不与转化细胞的细胞膜结合，对所需糖蛋白进行有效的表达时，几乎不影响转化细胞的代谢，而且能够很容易地纯化蛋白质。这样得到的本发明的糖蛋白不仅能与具有狂犬病毒中和活性的单克隆抗体发生反应，还能够诱导产生这样的抗体，它具有在用所述糖蛋白免疫的动物体内中和狂犬病毒的活性。因此，已证实本发明的糖蛋白可用于制备疫苗或诊断试剂。
图1显示了编码本发明者克隆的狂犬病毒G蛋白的结构基因顺序和与之相接的基因顺序，以及由此推导出的氨基酸顺序。
图2显示了在狂犬G-cDNA的制备中腺苷酸串的去除。
图3显示了以COS细胞作为宿主的表达载体，pSVL-N913的构建。
图4显示了COS细胞形态变化的照片，其中，COS细胞中表达的狂犬G蛋白由荧光反应显示。
图5显示了酵母表达载体pAMN913的构建。
本发明所用的狂犬病毒株如前所述产生于Nishigahara株，后者通过在兔中传代保存，到目前已传了2000多代(下面称为“N.HL株”)。
本发明编码狂犬病毒G蛋白的基因片段(G-cDNA)是一个含有1575碱基对的基因片段，它在图1所示的碱基对中始于起始密码ATG，一直到终止密码TGA，或是一个含有与其等同的基因顺序的基因片段，或是一个含有部分该基因的基因，它基本上编码上述基因片段中的抗原决定簇。
利用常规的基因克隆技术，例如利用Gubler和Hoffman的方法(Gene25263-269，1983)，由狂犬病毒N.HL株能够克隆到本发明的G-cDNA。本发明者已以大肠杆菌DH5α/pUC-N913寄存了一株大肠杆菌，它含有的质粒中掺入有狂犬病毒N.HL株的G-cDNA，它是根据布达佩斯条约以“FERMBP-1613”寄存于日本工业科技署的发酵研究所。根据图1所示的碱基对，本发明的G-cDNA也可利用DNA合成仪(如AppliedBiosystemCo.，Ltd.制造的381A型)合成所需的1575碱基对或其必需部分而制备。G-cDNA能被掺入适当的载体中，然后导入真核细胞中，以在胞质中表达所需的狂犬病毒G蛋白。
为了表达本发明的G-cDNA，可利用真核细胞作为宿主细胞。这种真核细胞包括酵母、来自哺乳类的动物细胞或来自昆虫细胞的培养细胞。表达体系的构建可如下述进行首先构建适于所用的宿主细胞的表达载体，然后将表达载体导入宿主细胞中，以产生所需要的能表达G蛋白的转化细胞。对于使用酵母细胞和培养细胞作为宿主细胞的两种情况，下面都将给出详细说明。
如果用酵母细胞作为宿主细胞，则所述的G-cDNA最好掺入穿梭载体中，该载体既携带有酵母基因又有大肠杆菌基因，并进一步携有合适的启动子区。这种穿梭载体是一种质粒，它含有酵母的复制原点(例如2μori和/或arsl等)、酵母中的选择标记基因、来自酵母的启动子区、大肠杆菌的复制原点(例如来自pBR322的Ori等)和大肠杆菌中的选择标记基因等。此处提及的酵母中的选择标记是指一种产生氨基酸如亮氨酸、组氨酸或色氨酸的基因。大肠杆菌中的选择标记是指氨苄青霉素、卡那霉素、四环素或氯霉素的抗性基因。来自酵母的启动子区是指能在酵母细胞中作用的表达调控区。这种优选的启动子区包括(例如)可阻遏的酸性磷酯酶(PH05)启动子、戊二醛-3-磷酸脱氢酶(GAP-DH)启动子等。这种穿梭载体的优选实例有含有酸性磷酯酶表达调控区(启动子)的pAM82(参见US4，778，761)及其等同物。作为宿主的优选酵母细胞包括，但不限于，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)AH22(FERMBP-312)等。
可以利用常规的转化方法(Ito等，J.Bacteriol.153163-168，1983)用上述适于酵母的表达载体(穿梭载体)转化酵母，以得到能够表达所需G蛋白的转化的酵母细胞。
如果利用培养细胞作为宿主，则用G-cDNA取代SV40病毒的部分基因，以产生能在转化细胞中表达G蛋白的重组病毒，然后将重组病毒与辅助病毒一起导入宿主细胞中以产生所需的G蛋白。另外一种方法是，使能够在宿主细胞中以质粒状态生长的病毒的部分基因(例如乳头状瘤病毒等)与G-cDNA连接，然后将连接产物导入宿主细胞中，以产生质粒状态的能表达G蛋白的表达所需基因的细胞。进一步，如果将G-cDNA掺入大肠杆菌的质粒中，并在所述G-cDNA的上游连接来自高等动物的病毒或启动子，然后将其导入培养细胞中，则能在转化细胞中表达掺入宿主染色体中的G-cDNA。这种质粒也可以使用市售可得的质粒，例如pSVL载体(Pharmacia生产)。
可以下述方式处理这样制备的表达G蛋白的转化体，以便纯化所需的G蛋白。
首先，在适合所用细胞的条件下用培养基培养所得到的转化体，以在转化体的胞质中产生所需G蛋白。如果使用酵母细胞作为宿主细胞，则通过物理处理如超声处理、用玻璃珠处理、或用MantonGaulin(APV-GAULIN、INC、USA，MS18-8TBS)处理(并也可以伴随化学处理如表面活性剂处理)来破碎收集的细胞。如果用培养细胞作为宿主细胞，则无需进行如酵母那样的强处理，只需用表面活性剂处理就能洗脱在胞质中产生的G蛋白。使这样得到的溶菌液通过离心等方法去除宿主细胞沉淀，然后利用抗狂犬G蛋白抗体进行亲和层析，以方便地纯化出所需G蛋白。通过常规的纯化方法能够进行进一步纯化，例如离子交换层析、密度梯度离心或各种亲和层析，从而能使蛋白质高度纯化，达到可作为疫苗使用的纯化度。
本发明的狂犬病毒G-cDNA、通过其表达而制备的重组G蛋白和表达系统与先有技术相比较具有如下几点特征(1)糖蛋白(G蛋白)cDNA的碱基顺序迄今为止，已经报导了好几种狂犬病毒cDNA的碱基顺序，其中，狂犬病毒构成蛋白中成熟G蛋白的cDNA包含1515个碱基对，编码505个氨基酸。将本发明中狂犬病毒N.HL株的G-cDNA碱基顺序与ERA株、CVS株和PV株的相比较表明，本发明G-cDNA的碱基顺序与其中的任何一个都不同，此差别在Asn-X-Thr(Ser)顺序部分(估计是发生糖基化的部位)尤其明显。表1总结了此差别。
表1菌株从N端起的氨基酸号码37158204247319465480N·HLOXXOOXOERAOXXOOOXCVSOXOXOXOPVOOXOOOXO能够进行糖基化的位点X不能进行糖基化的位点对于糖基化的重要性了解还不清楚，但认为它参与了蛋白质的结构或稳定性。事实上，活体中的许多蛋白如生理活性物质和血清蛋白都是糖蛋白。虽然糖基化信号顺序的存在并不一定意味着糖基化的形成，但此顺序非常可能参与了蛋白质的结构或稳定性。如果说，糖基化信号顺序参与了蛋白质的功能(即生物活性)，则因此可以说，对糖基化位点进行比较与比较完整cDNA的同源性是同等重要的。
(2)在动物培养细胞系统中的表达型将本发明的表达质粒导入动物培养细胞中，例如COS细胞，然后利用多克隆抗体(用狂犬病毒G蛋白免疫动物而制备)和单克隆抗体(具有中和狂犬病毒的活性)检测狂犬病毒G蛋白的表达位点。
结果，按照用本发明的表达系统，在胞质中检测到了G蛋白颗粒，而在细胞膜上没有。迄今为止，还从未报导过在动物细胞中表达狂犬病毒G蛋白时有这种现象，因此，本发明的上述表达类型是相当新颖的。关于水泡性口炎病毒(VSV)(它与狂犬病毒一样属于Rhabdoviridae)，Rose等人以与本发明表达系统同样的方式构建了VSV的G蛋白cDNA，并报告了其表达类型(Cell30753-762，1982)。根据此报导，发现在转化细胞中表达的特异抗原与细胞膜连接在一起。这一现象表明，本发明中G蛋白的定位是基于本发明G-cDNA的特异功能。
除了将表达产物释放至培养基中的系统以外，外源基因的表达系统可分为两种类型，即表达产物在胞质中局部进行表达的系统和表达产物在表达后定位于细胞膜上的系统。一般说来，如果表达产物与细胞膜相结合，则宿主细胞易受到生长抑制，而且，在纯化与细胞膜结合的蛋白时(糖蛋白)，由于细胞膜成分与所需蛋白结合在一起，所需蛋白的质量或产率受到很大影响。本发明的狂犬病毒G蛋白表达系统能够在胞质中表达所需蛋白，因此不存在上述的表达效率和纯化等问题，从而能够高效率地表达和纯化所需蛋白。
(3)通过表达的G蛋白生产中和性抗体如果一种外源基因如本发明所用酵母细胞或培养细胞通过基因重组技术得到了表达，则表达的肽段即使能够与所需肽段(抗原)的抗体反应(即表现出对抗体的抗原性)，它有时也可能不具有适于进行生物制备的性质。这可能依赖于是否对肽段进行了修饰，使得它在宿主细胞中转译后表现出生物活性。如前所述，E.Yelverton等人已成功地用大肠杆菌表达了狂犬G蛋白基因，并证实产生的蛋白能与针对狂犬G蛋白的抗体反应，但据报道他们用产生的蛋白对动物免疫后不能产生任何抗体。估计其主要原因是在大肠杆菌中缺乏修饰过程，例如糖基化作用。与此相似，如果使用真核细胞如酵母或培养细胞，在许多情况下可能产生同样的表达产物的生物活性问题。估计有多种因素与此相关，包括表达肽段对于宿主细胞的效应、为表现出固有生物活性的表达肽段的修饰等等。换言之，它受到导入宿主细胞以进行表达的编码所需肽段的大量结构基因的精细调控。与此相反，将本发明的G-cDNA导入真核细胞以进行表达时，所产生的G蛋白不仅能与G蛋白的抗体反应，当它作为疫苗注入动物体后还能诱导产生具有狂犬病毒中和活性的抗体，这一点已在豚鼠的免疫试验中得到证实。进一步来看，比较它与来自狂犬病毒的纯化G蛋白的免疫原性时，两种蛋白表现出同样水平的免疫原性。这些结果表明，本发明的G蛋白作为疫苗是足够有效的，并提示包含有本发明G蛋白的疫苗将为在发展中国家和周围其他国家中根除狂犬病作出贡献，而这种疫苗通过基因重组技术能够廉价而大量地制备。
本发明的特征在于，能够以定位于胞质中的状态表达狂犬病毒G蛋白，而不与细胞膜结合，并且，这样得到的狂犬G蛋白能够诱导针对狂犬病毒的中和性抗体。
下述实例进一步说明本发明，但它们并不限制本发明。
在实例中，除非特别指出，采用下列试剂和方法。
酶和化学试剂所用限制酶和修饰酶分别得自Takara Shuzo Co.Ltd.和Toyobo Co.Ltd.。至于α-32P-dCTP，采用Amasham产品(产品号PB 10385，800 Ci/mmol)。
DNA的切割、修饰和连接每种酶的使用都在小册子“用于基因工程研究的Takara试剂”和“基因工程研究的Toyobo综合目录”中给出的条件下进行。每种酶的反应完成以后，根据《分子克隆》(T.Maniatis，p458-459，1982)的方法进行苯酚处理和氯仿处理，然后通过乙醇沉淀收集DNA。利用Takara连接药盒(TakaraShuzoCo.Ltd.，目录号6021)并根据所附说明进行DNA连接反应。同样利用此药盒和根据所附说明在DNA末端加上人工接头。
通过琼脂糖电泳收集DNA片段根据《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P150-163，1982)进行DNA的琼脂糖电泳。尤其在从琼脂糖凝胶中提取特殊DNA片段时，使用一种低胶凝的琼脂糖(BIO-RAD，目录号162-0017)，并同样根据《分子克隆》的方法(T.Maniatis，p170，1982)收集此片段。
质粒的提取和纯化如果要从转化的大肠杆菌中提取和纯化大量质粒，应采用《分子克隆》所述的碱性法(T.Maniatis，P90-91，1982)。为了从大量转化的大肠杆菌中选择出用所需质粒转化的集落，首先根据下述的集落杂交法选择所需的阳性克隆。根据《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P368，1982)，从该克隆中提取和纯化少量质粒，然后用合适的限制酶切割，并通过琼脂糖电泳进行分析。
集落杂交和空斑杂交利用缺口转译药盒(BRL，目录号8160SB)和生物素-11-UTP(BRL，目录号9507SA)并根据药盒所附的说明由G-cDNA片段制备探针。根据Fujita等人SaiboKogaku(CellEngineer-ing4(10)893-900，1985)的条件进行集落杂交和空斑杂交。
实例1G-cDNA的制备(1)RNA的提取仓鼠肺细胞(HmLu细胞)于37℃下培养48小时，然后用狂犬病毒H·HL株以0.2moi(感染复数)进行感染。48小时以后，根据《分子克隆》的方法(T.Maniatis，P196，1982)从细胞中提取完整RNA。
通过分光光度计的定量测定(260nm处的1.0吸光度相当于40μg/ml)，每一旋管中的狂犬病毒感染细胞产生1.5mgRNA。为了证实这样得到的RNA未被切断，用2μgRNA根据P.Tomas(Proc.N.A.S.775201-5205，1980)的方法进行电泳。结果发现，大多数RNA都是28s或18s的核糖体RNA，由于核糖体RNA并不分解，估计其中含有的少量G-mRNA也未被切断。
将根据P.Tomas的方法电泳过的RNA转移至硝化纤维素滤膜上(Schleicher & Schuell BA 85)，利用32P标记的狂犬病毒HEP-Flury株的G-cDNA片段作为探针在硝化纤维素膜上进行杂交(Northern印迹转移)。结果，在一同进行电泳的由未经病毒感染的HmLu细胞中提取的RNA的泳道中未观察到条带，而在由病毒感染的细胞中提取的RNA的泳道中，在大约2.2Kbp处及分子量更大一些的地方观察到一些条带。在本文的后面，用此由病毒感染的细胞中提取的RNA进行cDNA的合成。
(2)狂犬病毒H·HL株G蛋白cDNA的克隆根据Gubler和Hoffman的方法(Gene 25263-269，1983)进行cDNA的合成，也就是说，利用寡聚dT12-18(Phar-macia产品)作为引物、5μg由病毒感染细胞提取的RNA作为模板以及逆转录酶(莫洛尼氏鼠白血病毒转录酶，BRL产品)合成单链的cDNA。然后，用大肠杆菌RNA酶H在与这样合成的单链cDNA链杂交的RNA链中导入一个缺口以制备RNA链，然后用这样制备的RNA作为引物使用大肠杆菌聚合酶I合成双链cDNA。得到的双链cDNA通过下述两种方法克隆。
方法1利用Takara连接药盒，并根据该药盒所附的说明书，使两端都加有pSalI人工接头的双链cDNA与克隆载体pUC19反应(16℃30分钟)，该载体已预先用限制酶SalI切断，并去掉了其5′端的磷酸基团。将得到的产物导入市售可得的DH5α感受态细胞中〔F-，end A1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，thi-1，λ-recA1，gyr96，rel A1，φ80dlacZ△M15〕。然后，大约3，000个这样得到的克隆用狂犬病毒HEP-Flury株G-cDNA片段作为探针进行集落杂交。结果有一个克隆显色，将它定名为“pUC-RNSL”。用“G蛋白表达系统的构建”中所述相同的方法处理此cDNA，然后导入COS细胞和酵母表达系统中。
方法2根据Nagata等人，JikkenIgaku(ExperimentalMedicine4(8)87-92，1986)所述的方法，首先用EcoRI-甲基化酶处理双链cDNA(0.5μg)，使EcoRI切割位点甲基化，然后在DNA的两端加上pEcoRI人工接头。为了克隆此DNA，根据说明书中给出的程序，使此DNA与用EcoRI切割的λgt10手臂(来自STRATAGENE)(GT10)进行连接。然后，利用得自STRATAGENE的体外包装提取物(商品名Gigapackpuls，STRATAGENE产品)和所附的VCS258宿主细胞或C600hfl，通过体外包装法克隆G-cDNA。总共得到大约350，000个克隆。在每个平皿上放置7，000个克隆，进行空斑杂交后产生21个阳性克隆。
(3)pRNSL完整碱基顺序的测定为了制备G-cDNA片段，将pRNSL(20μg)用限制性酶SalI(50单位)在所附的缓冲液中于37℃下消化4小时。通过1%的低胶凝琼脂糖电泳将得到的DNA分成两种片段，提取并回收相应于2.1Kbp的G-cDNA片段。
(a)为了使此G-cDNA片段进一步分离，G-cDNA片段(每种0.1μg)分别用识别四碱基的限制性酶HaeⅢ、RsaI、AluI、TagI或Sau3AI切割成6、5、6、9或7种片段。在这些G-cDNA片段中，用HaeⅢ、RsaI或AluI切割的片段与用SmaI切割的M13mp18连接，或与用SmaI和SalI二者切断的M13mp19连接，TagI片段与用AccI切断的M13mp18连接，Sau3AI片段与用BamHI或用BamHI和SalI二者切断的M13mp19连接，这些连接都利用Takara连接药盒进行。
pUC-RNSL用限制性酶KpnI和BamHI切断。利用Takara的千碱基缺失药盒(目录号6030)及所附的说明使切断的pUC-RNSL从BamHI切割位点起发生缺失，以制备出具有不同缺失度G-cDNA，然后用SalI切割。利用Takara连接药盒，使这样得到的G-cDNA与用SmaI和SalI二者切断的M13mp18连接。
根据《Toyobo说明手册》的方法，用上述方法(a)和(b)中处理的DNA转化JM101感受态细胞。转化过程和下述的提取纯化单链DNA过程都根据ToyoboM13克隆药盒(目录号M13-001)和其中的“说明手册”进行。利用ToyoboM13测序药盒(目录号M13-003)和BRL电泳装置(S2型，目录号1105)及所附的说明书，根据BRL测序凝胶电泳系统测定这样得到的单链DNA的顺序。结果发现，pRNSL含有2，123个碱基对(bp)，其中含有1，575bp的可译框，它编码包括524个氨基酸的狂犬病G蛋白(参见图1)。
作为顺序测定的结果，发现在5′端含有一串32个腺苷酸。如果将克隆的G-cDNA连接在SV40晚期区启动子或酵母酸性磷酯酶启动子的下游，则此腺苷酸串可能对其转录产生强烈抑制。因此，以下述方式去掉此腺苷酸串。首先，将pUC-RNSL(2μg)用限制性酶PstI于37℃切割2小时。得到的DNA通过Takara核酸酶Bal31-S(目录号2510A)于30℃消化2分钟，反应在下述组合物中进行DNA(用PstI切断)23μl5×Bal31缓冲液(＊)6μlBal31S(2单位/ml)1μl(＊)5×Bal31缓冲液100mM Tris-HCl，3M NaCl，60mM CaCl2，60mM MgCl2，5mM EDTA然后，利用Takara连接药盒，在上述核酸酶Bal31消化的DNA两端加上pSalI人工接头(ToyoboSAL-801，2μg)。将该DNA用限制性酶SalI进行充分切割，然后进行低胶凝琼脂糖电泳。在大约2.1Kbp处切下一个DNA宽带并收集DNA。利用连接药盒通过使DNA与用限制酶SalI切断的pUC19连接而克隆收集的DNA，然后用连接物转化DH5α感受态细胞(得自BRL，目录号8263SA)。
根据ToyoboM13克隆药盒(目录号M13-001)和所附“说明手册”，测定这样得到的克隆的5′端碱基顺序(参见图2)。在它们之中，用N9-13作为G蛋白cDNA以下述方式导入COS细胞和酵母的表达系统中。含有此基因片段的质粒已经以掺入大肠杆菌中的状态，以大肠杆菌DH5α/pUC-N913，根据布达佩斯条约以“FERMBP-1631”寄存于日本工业科技署的发酵研究所。
实例2糖蛋白在作为宿主的动物细胞中表达(1)COS细胞表达质粒的构建为了分离插在pUC－N913中的G蛋白cDNA，用限制酶SalI切割pUC－N913使之分两个片段。根据《分子克隆》的方法(T.Maniatis,p170,1982),通过低胶凝琼脂糖凝胶电泳得到G－cDNA片段。
用市售可得的pSVL(pharmacia产品，目录号27－4509－01)作为表达载体。为了将G－cDNA掺入表达载体启动子的下游，用限制酶XhoI切断载体，并去掉其5′端的磷酸。然后用Takara连接药盒使pSVL与N9－13G－cDNA连接，并用此连接物感染HB101感受态细胞。
利用上面“质粒的提取和纯化”及“集落杂交和空斑杂交”中所述的方法，选择在SV40晚期区启动子的转录方向掺有N9－13G－cDNA的连接物，利用细胞转染药盒(Cell phect Transfec-tion Kit,得自pharmacla，目录号17-0595-01),，用这种连接物之一pSVL-N913(图3)感染COS细胞。
(2)cos细胞中G蛋白表达的证实使来自非洲青猴肾的SV40转化细胞(cos-1，得自Dainippon Pharmaceutical Co,Ltd.,目录号09－1650)在CO2保温器中于37℃培养24小时，使含有10％小牛血清的MEM培养基中的细胞浓度达到105细胞／ml。培养24小时以后，去掉培养基，细胞用0.01MPBS洗涤一次。在细胞中滴加DEAE－葡聚糖溶液(50μg/ml，100μl)和G蛋白表达载体pSVL－N913(0.5μg)的混合物，使之在室温下放置15分钟以感染细胞。然后，细胞用不含血清的MEM培养基洗涤，并在常规条件下(37℃，5%CO2保温器)培养48小时。
然后，为了证实这样得到的细胞已经表达了G蛋白，根据“UirusugakuJikkenho(病毒学实验)”(NationalInstituteofHealth，alumniassociationed.，p297-329)中所述的间接荧光抗体技术观察细胞。也就是说，在DNA感染48小时后，去掉培养上清液，通过滴加丙酮进行预处理，以防止所需抗原的脱落或洗脱。将预处理过的细胞与作为初级抗体的单克隆抗体(具有中和活性)在室温下反应10分钟。用0.01MPBS洗涤后，使细胞与用荧光色素FITC(荧光异硫氰酸酯)标记的抗鼠IgG(FITC-RbxMouseIgG(H+2)，ZYMED产品，目录号61-6511)反应。反应后的细胞用0.01MPBS洗涤，并在荧光显微镜下观察。图4显示了这样观察到的COS细胞的荧光反应。结果证实，COS细胞中表达的G蛋白是以颗粒形式在胞质中表达的，而不是处于与细胞膜结合的状态。
实例3糖蛋白在作为宿主的酵母细胞中表达(1)酵母表达质粒的构建为了分离插在pUC-N913中的G蛋白cDNA，用限制酶SalI切割pUC-N913使之分成两个片段。通过低胶凝琼脂糖凝胶电泳得到一个G-cDNA片段。另一方面，用限制性酶XhoI切割酵母表达载体pAM82(参见美国专利4，778，761)。然后，根据《分子克隆》所述方法(T.Maniatis，p133-134)，用碱性磷酯酶(Boeringer产品，产品号703023)去掉5′端的磷酸。然后用Takara连接药盒使此载体与N9-13连接，并用此连接物感染大肠杆菌HB101感受态细胞。用G-cDNA作为探针使感染的大肠杆菌进行集落杂交，产生一个阳性克隆pAMN913(参见图5)。
(2)糖蛋白在酵母细胞中的表达酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)AH22〔leu2his4 Canl(Cir+)〕(FERM BP-312)接种于YPE培养基上(2%蛋白胨，1%酵母膏，2%葡萄糖，100ml)于30℃培养过夜，然后离心收集细胞。收集到的细胞用无菌水洗涤(20ml)，悬浮于1.2M山梨醇和Zymolyase-60，000(日本Seikagaku Kogyo K.K.产品，100μg/ml)的溶液中(5ml)，悬浮液于30℃放置30分钟以产生原生质球。将这样制备的原生质球用1.2M山梨醇溶液洗涤三次，然后悬浮于2M山梨醇、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)的溶液(0.6ml)中。这样制备的悬浮液以60μl的体积分装于小试管中。在悬浮液中加入上述制备的重组质粒pAMN913(10μg)的溶液。充分混合后，加入0.1M CaCl2(3μg)，使其最终浓度为10mM CaCl2，使混合物在室温下放置5至10分钟。向得到的混合物中加入1ml 20%聚乙二醇4000，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)的溶液，使混合物在室温下放置20分钟。将得到的混合物(每份0.2ml)加到下述组成的培养基中(10ml);22%山梨醇，2%葡萄糖，0.7%酵母氮基氨基酸，2%YPD，20μg/ml组氨酸和3%琼脂，使之保持在45℃的恒温下。轻轻混合后，将混合物以层状加至含有1.2M山梨醇的基本培养基平皿上，该培养基是预先由下述成分制备的0.7%酵母氮基氨基酸，2%葡萄糖，20μg/ml组氨酸和2%琼脂，并放置备用。平皿于30℃下培养后，产生一个不需亮氨酸的酵母集落。该集落在补充有组氨酸(20μg/ml)的BurkHolde基本培养基中培养(参见Tohe，A.等人，J.Bacteriol，113117-738，1973)，则产生所需的转化酿酒酵母。
使这样得到的转化酵母的集落置于补充有组氨酸(20μg/ml)的Burk Holder基本培养基琼脂平皿上，于30℃下培养以形成集落(以证实转化体不需要亮氨酸)。将从集落中分离产生的细胞，接种在补充有组氨酸(20μg/ml)的Burk Holder基本培养基(10ml)中，并于30℃培养。在大约24小时后，离心收集对数生长期的细胞，并以大约4×106细胞/ml的细胞浓度悬浮于不含磷酸的基本培养基中(10ml)(通过用KCl代替Burk Holder基本培养基中的KH2PO4，并随后补加20μg/ml组氨酸而制备)。在30℃下培养24小时后，将培养基以4，000rpm离心10分钟而收集细胞。
将这样分离的细胞悬浮于3ml1.2M山梨醇、50mM磷酸缓冲液(pH7.2)，14mM2-巯基乙醇和100μg/mlZymolyase-60，000(日本SeikagakuKogyoK.K.生产)的溶液中，混合物于30℃轻轻摇动30分钟以产生原生质球。离心收集原生质球，然后充分悬浮于含有1%TritonX-100的50mM磷酸缓冲液(pH7.2，1ml)中，使混合液与玻璃珠强烈搅动以破碎细胞。
破碎后的混合液以5，000rpm离心10分钟，取出上清作为酵母溶解液。对于上清，通过下述方法测量G蛋白抗原活性，即用50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)稀释作为第一抗体的抗G蛋白单克隆抗体，然后加到96孔ELISA平板上，于37℃保温2小时或于室温下保温4小时，使单克隆抗体复盖在平板上。复盖后的平板用PBS(磷酸缓冲盐水)/0.05%Tween20溶液(PBS-Tween)洗涤三次，并用含有1%BSA的PBS-Tween(BSA-PBS-Tween)于4℃下掩蔽过夜。然后，每个样品用PBS-Tween适当稀释，加入每个孔中并于37℃保温1小时。平板然后用PBS-Tween洗涤五次，并向其加入含有过氧化物酶标记的抗G蛋白单克隆抗体的BSA-PBS-Tween溶液，于37℃保持一小时。平板再次用PBS-Tween洗涤五次，向平板中加入作为底物的TMBZ(N，N′-四甲基联苯胺盐酸)的EDTA溶液(0.006%过氧化氢)进行显色。用自动测定仪(OD450nm)测定显色强度，结果示于表2中。作为阴性对照，对于用未掺入G-cDNA的质粒pAM82转化并如上述同样处理的酵母，也作了G蛋白抗原活性的测定。
表2pAMN913pAM82OD4501.70.1从表2所示结果清楚可见，只在一种酵母中检测到了很高的G蛋白抗原活性，该酶母中掺入了插有本发明G-cDNA的穿梭载体。
实例4豚鼠的免疫原性试验(1)免疫抗原的制备和免疫作用通过用具有病毒中和活性的单克隆抗体作为配体的亲和层析，从用pAMN913转化的酵母溶解液中纯化用于免疫试验的G蛋白。在纯化的G蛋白中加入氢氧化铝凝胶，制备成每份剂量含有1μgG蛋白的免疫用抗原。使用20只重450至650克的Hartley豚鼠(雌性)。对10只豚鼠腹腔注射如上制备的免疫抗原，一星期后进行加强注射。另10只豚鼠作为非免疫对照组，以同样方式注射生理盐水。
(2)中和试验
用生存于HmLu-1细胞中的狂犬病毒N·HL株作为中和病毒，如果将它注射于脑中，它具有能够使成年小鼠致死的毒性。在第一次注射前和加强注射之后，从免疫组的所有动物取血样。以同样方式从非免疫组动物取血样。然后使这些血清加热至56℃30分钟使之失活。将失活血清稀释两倍，取50μl与病毒溶液(50μl)在37℃下反应90分钟，病毒液中含有数量为200TCID50(50%组织培养感染剂量)的病毒。然后，每50μl反应混合液在96孔微量滴定板中保温。保温后的反应混合液接种于HmLu-1细胞中，于37℃下吸收1.0小时，然后加入150μl细胞维持培养基(Eagle MEM培养基)，于37℃下培养4天。培养以后，使平板与标记有辣根过氧化物酶的抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体(标记抗体)反应。如果血清不与标记抗体反应，则意味着血清未受到病毒感染，并属于中和性抗体阳性。中和抗体的效价表示为完全抑制病毒感染的血清最大稀释度的倒数。结果发现，由本发明的G蛋白免疫而得到的血清具有中和性抗体。所得结果示于表3。
表3免疫组非免疫组豚鼠号中和抗体效价豚鼠号中和抗体效价注射前(0周)注射后(3周)注射前(0周)注射后(3周)1＜23211＜2＜22＜2812＜2＜23＜21613＜2＜24＜26414＜2＜25＜23215＜2＜26＜2416＜2＜27＜23217＜2＜28＜26418＜2＜29＜21619＜2＜210＜212820＜2＜2(4)病毒攻击试验根据上面(2)中所述方法对豚鼠进行加强注射，在加强注射两周后(也即第一次注射后三周时)，在咀嚼肌中接种狂犬病毒CVS株(大约10LD50/0.2ml)(即进行攻击)。对照组也进行同样的攻击。攻击后两周内观察症状的出现。两周内没有症状的豚鼠被称为预防作用阳性。结果示于表4中。
表4测试组死亡数无症状数预防率(%)免疫组1990对照组1000由上面表4清楚可见，除了一只豚鼠外(表3中的6号)，所有用本发明的G蛋白免疫的动物组中的豚鼠都无症状出现，而在非免疫的对照组中，所有豚鼠都死于典型的狂犬病症状。这些实验结果证实，本发明的G蛋白作为狂犬病疫苗使用是极为可行的。
权利要求
1.一种含有全部或部分下述编码狂犬病毒糖蛋白的碱基顺序或与其等同的碱基顺序的基因片段10 20 30 40 50ATGGTTCCGC AAGCTCTTCT GCTTGTACCC ATTCTGGGTT TTTCCTCGTG60 70 80 90100TTTCGGGAAA TTCCCTATTT ACACGATACC AGACACACTT GGTCCCTGGA110120130140150GCCCGATCGA TATACATCAT CTCAGTTGCC CAAACAATTT GGTTGTAGAG160170180190200GACGAAGGAT GCACCAACCT GTCAGGGTTC TCCTACATGG AACTTAAAGT210220230240250TGGACACATC TCAGCCATAA AGGTGAACGG GTTCACTTGC ACAGGCGTTG260270280290300TAACAGAGGC AGAAACCTAC ACTAACTTTG TTGGTTATGT CACCACCACT310320330340350TTCAAAAGAA AGCATTTCCG CCCAACACCA GATGCTTGTA GAGCTGCGTA360370380390400CAACTGGAAG ATGGCCGGTG ACCCCAGATA TGAAGAGTCT CTACACAGTC410420430440450CGTACCCTGA CTACCATTGG CTTCGAACTG TAAAAACCAC AAAGGAGTCC460470480490500CTCGTTATCA TATCTCCAAG TGTGGCAGAT TTGGACCCAT ATGACAACTC510520530540550CCTTCACTCG AGGGTCTTCC CTAGCGGAAA GTGCTCAGGA ATAACAGTAT560570580590600CTTCTGTCTA CTGCTCAACT AACCACGATT ACACCGTTTG GATGCCTGAA610620630640650AGTCTGAGAC TAGGGACATC TTGTGACATT TTTACCAATA GTAGAGGGAA660670680690700GAGAGTATCC AAGGGGAGCA AGACCTGTGG CTTTGTAGAT GAAAGAGGCC710720730740750TATATAAGTC TCTAAAAGGC GCATGCAAAC TCAAGTTGTG TGGAGTTCGT760770780790800GGACTTAGAC TTATGGACGG AACATGGGTC GCGATGCAGA CATCAAAATGA810820830840850GACCAAATGG TGTCCTCCCG ATCAGTTGGT TAATCTGCAC GACCTTCGCT860870880890900CAGATGAAAT CGAGCATCTT GTTATAGAGG AGTTGGTCAA GAAAAGAGAG910920930940950GAGTGTCTGG ATGCATTAGA GTCCATCATA ACCACCAAGT CAGTGAGTTT960970980990 1000CAGACGTCTC AGTTATTTAA GAAAACTTGT CCCCGGGTTC GGAAAAGCAT1010 1020 1030 1040 1050ATACCATATT CAACAAGACC TTGATGGAGG CTGAAGCTCA CTACAAGTCA1060 1070 1080 1090 1100GTCAGGACTT GGAATGAGAT CATCCCCTCA AAAGGATGTT TGAGAGTTGG1110 1120 1130 1140 1150AGGGAGGTGT CATCCTCATG TAAACGGGGT GTTTTTCAAT GGTATAATAT1160 1170 1180 1190 1200TAGGGCCTGA CGGTCATGTT TTAATCCCAG AGATGCAATC ATCCCTCCTC1210 1220 1230 1240 1250CAGCAACATA TAGAGTTATT GGAATCCTCA GTTATTCCCC TGATGCACCC1260 1270 1280 1290 1300CCTTGCAGAC CCGTTCACAG TTTTCAAGGA CGGCGATGAG ACTGAGGATT1310 1320 1330 1340 1350TTATAGAAGT TCACCTTCCC GATGTGCACG AACAAGTCTC AGGGGTTGAC1360 1370 1380 1390 1400CTGGGTCTCC CGAACTGGGG GGAGTATGTA TTACTAAGTG CAGGGACCTT1410 1420 1430 1440 1450GATTGCCTTG ATGTTGATAA TTTTCCTAAT GACATGTTGT AGAAAAGTCG1460 1470 1480 1490 1500ATCGGCCAGA ATCTACACAA CGCAGTCTCA GAGGGACAGG AAGGAATGTG1510 1520 1530 1540 1550TCAGTCACCT CCCAAAGCGG GAAATTCATA CCTTCATGGG AGTCGTATAA1560 1570AAGTGGGGGT GAGACTGGAC TGTGA
2.根据权利要求1的基因片段，其特征在于，基因片段含有权利要求1编码狂犬病毒糖蛋白的碱基顺序中的腺苷酸58至腺苷酸1575的碱基顺序。
3.一种重组的狂犬病毒糖蛋白，它是通过在真核细胞中表达权利要求1的基因片段而制备的。
4.一种制备狂犬病毒糖蛋白的方法，其特征在于，该方法包括将插有权利要求1的基因片段的表达载体导入真核细胞中，所述片段插在能在真核细胞中作用的启动子的下游，并培养所述的转化细胞，以在所述细胞的胞质中产生狂犬病毒糖蛋白。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于真核细胞是酵母细胞。
6.根据权利要求4的方法，其特征在于穿梭载体是含有酵母复制原点、酵母中的选择性标记基因、来自酵母的启动子区、大肠杆菌的复制原点和大肠杆菌中的选择性标记基因的质粒。
7.一种制备狂犬病毒糖蛋白的方法，其特征在于，该方法包括将插有编码狂犬病毒G蛋白的基因片段的重组病毒导入培养细胞中，并培养所述的转化细胞，以在所述细胞的胞质中产生狂犬病毒糖蛋白。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于重组质粒是通过用编码狂犬病毒G蛋白的基因片段取代SV40病毒的部分基因而制备的，并用该重组质粒感染培养细胞。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于重组病毒是通过将能在培养细胞中以质粒状态生长的部分病毒与编码狂犬病毒G蛋白的基因片段相连接而制备的。
全文摘要
编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段，利用所述基因片段表达的重组的狂犬病毒糖蛋白，该蛋白非常适用于制备狂犬病疫苗和诊断试剂，以及一种制备狂犬病毒糖蛋白的方法，该方法包括将插有编码狂犬病毒糖蛋白的基因片段的穿梭载体导入真核细胞中，所述基因片段插在能在真核细胞中作用的启动子的下游，以及培养所述转化细胞，以在所述细胞的胞质中产生狂犬病毒糖蛋白。由于G蛋白能在胞质中以颗粒形式表达，而不与细胞膜结合，因此本发明的方法能以高产率和高纯度产生所需的G蛋白。
文档编号A61K39/00GK1035126SQ88105198
公开日1989年8月30日 申请日期1988年12月24日 优先权日1987年12月26日
发明者坂本信一, 井手敏雄, 時吉幸男, 山元通孝 申请人:财团法人化学及血清疗法研究所