一种脂肪酶l-1及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属生物化工和生物技术领域，具体设及一种脂肪酶L-I及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] 乙酸肉桂醋是从肉桂中提取出的香料成分之一，是我国规定可使用的香料。大多 数乙酸肉桂醋是用化学方法合成的，只有少量是从天然植物中提取的。化学法对条件的要 求高，需要在高溫高压下完成，设备的消耗和能耗高，而且合成过程中会有多种副产物产 生，后续提取工艺复杂，对环境污染大。作为生物催化剂的酶具有反应条件溫和、专一性高、 副产物少、环境污染小等优点，可W克服上述化学法合成的缺点，目前已广泛应用于化工、 制药、造纸、皮革、化妆品、食品等领域。
[000引脂肪酶（Lipase,EC3. 1. 1. 3)，又叫作立酷甘油水解酶，是一类能够将立酷甘油水 解为甘油和脂肪酸的酶，其来源非常广泛，微生物、植物和动物中都有存在。脂肪酶作为生 物催化剂多数可作用非天然底物，而且可拆分的底物多，立体选择性高，不需要辅助因子， 是一种重要的手性催化剂。对脂肪酶研究的初期，其来源主要是动植物，但动植物来源的脂 肪酶原料来源受到很大限制，不能满足工业需要，人们更多地将目光投向微生物，开始寻找 微生物来源的脂肪酶，W满足日益增长的需求。已知能够产生脂肪酶的微生物种类繁多，细 菌、霉菌、放线菌中均有很多菌种可产生脂肪酶，微生物来源的脂肪酶的使用抑、溫度比动 植物来源要更广泛。1984年，Zaks发现酶在有机相中也具有催化活性，改变了 "酶只能在 水相中进行催化"的传统观念，开启了非水相酶学的时代，并迅速成为应用酶学研究中最活 跃，发展最为迅速的领域，酶的应用范围也得到了极大扩展。海洋面积迂阔，蕴藏着丰富的 微生物资源，对海洋的开发也极大地扩展了人们获取脂肪酶的手段和范围。
[0004] 但是，大多数在工业中应用的脂肪酶都是源于进口，比如NovoNordisk公司的 月旨肪酉每Novozym435 (来自Candida曰nt曰rctic曰），Am曰noPh曰rm曰ceutic曰1公司的Lip曰se PS(来自Burkholderi曰cep曰Ci曰），Fluk曰公司的Lip曰SeA(来自Candida曰nt曰rctic曰）等 等。运些脂肪酶价格昂贵，生产技术受到制约，因此开发具有自主产权的脂肪酶十分必要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中脂肪酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提 供一种新的脂肪酶L-I及其编码基因和应用。
[0006] 本发明从放线菌（Str巧tomycessp.)SCSIO13580中开发了一种新的脂肪酶 及其编码基因脂肪酶基因^1，构建了含有脂肪酶基因1-1的重组表达载体和基因工程菌， 培养基因工程菌后获得脂肪酶心1，其可应用于催化制备乙酸肉桂醋。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶kl，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的脂肪酶心1的脂肪酶基因。
[0009] 优选，所述的脂肪酶基因1-1的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因1-1的重组表达载体。所述的表达载 体，优选祀T28a(+)载体。
[0011] 本发明还提供一种含有所述的脂肪酶基因1-1的基因工程菌。所述的基因工程 菌，优选大肠杆菌化21 0E3)。
[0012] 本发明的第S个目的是提供所述的脂肪酶L-I在制备乙酸肉桂醋中的应用。
[0013] 优选，其步骤为：取脂肪酶L-I于反应介质中，再加入肉桂醇和酷基供体，进行反 应，制备得到乙酸肉桂醋。
[0014] 所述的反应介质，优选为1，4-二氧六环、四氨巧喃、叔下醇、异丙醇、二氯甲烧、甲 苯、环己烧、正己烧、正庚烧和异辛烧中的一种。
[0015] 所述的酷基供体，优选为乙酸乙締醋、乙酸异丙締醋、乙酸酢、乙酸、乙酸仲下醋和 乙酸乙醋中的一种。
[0016] 本发明的第四个目的是提供所述的脂肪酶L-I在耐受短链醇、控类、丙酬、Tween-20或TritonX-IOO环境下进行催化的应用。
[0017] 所述的短链醇为甲醇、乙醇、异丙醇、叔下醇、异下醇、正戊醇或正己醇；所述的控 类为甲苯、1,4-二氧六环、环己烧、正庚烧、正辛烧或正癸烧。
[0018] 本发明的脂肪酶基因1-1来自放线菌（Str巧tomycesSP.)SCSIO13580,保存在 中国科学院南海海洋研究所。本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的放线菌 (Str巧tomycessp.)SCSIO13580中得到脂肪酶基因，全长为IOOSbp(从起始密码子到 终止密码子），编码334个氨基酸；该酶蛋白是一个全新的脂肪酶，与其它脂肪酶氨基酸序 列的最大相似度为51 %。通过克隆脂肪酶基因1-1并将其连接表达载体祀T-28a(+)后转 化大肠杆菌化21 0E3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的脂肪酶kl。脂肪酶作 为催化剂催化肉桂醇和酷基供体进行反应，制备得到乙酸肉桂醋，获得的乙酸肉桂醋产率 可达48. 3%。脂肪酶L-I具有稳定性高、催化效率高的优点，可用于生物医药、化妆品和精 细化工等领域。
【附图说明】
[0019] 图1是不同酷基长度的对硝基苯酪醋对脂肪酶L-I酶活的影响。
[0020] 图2是脂肪酶的最适抑及抑稳定性，A为最适抑曲线，B为抑稳定性曲线。 [002。 图3是脂肪酶的最适反应溫度和溫度稳定性，A为最适反应溫度曲线，B为溫 度稳定性曲线。
[0022] 图4是脂肪酶心1合成乙酸肉桂醋的气相色谱图，按照保留时间先后依次为：1、内 标十二烧、2、肉桂醇和3、乙酸肉桂醋。
[002引图5是脂肪酶纯化、脱盐的SDS-PAGE凝胶结果，其中，1为蛋白分子量标记， 2为IPTG诱导前的总蛋白对照，3为IPTG诱导后的总蛋白对照，4为IPTG诱导后的细胞上 清液，5为儀柱穿透液，6为儀柱纯化蛋白，7为脱盐蛋白（即图中的脂肪酶蛋白，分子质量： 38kD)O
【具体实施方式】
[0024] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[00巧]本发明的脂肪酶基因1-1来自于链霉菌（Str巧tomycessp. )SCSIO13580,保存 在中国科学院南海海洋研究所，该基因也可W通过人工合成等手段获得。
[0026] 实施例1 :脂肪酶基因1-1引物设计及开放阅读框边界确定
[0027] 提取放线菌（Streptomycessp. )SCSIO13580 的基因组DNA，经 16SrRNA验证无 误后，交至上海美吉生物科技有限公司测序。利用生物信息学手段对基因组进行注释，分 析其中的脂肪酶基因，确定了其中脂肪酶基因1-1的开放阅读框，其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示，全长为IOOSbp(从起始密码子到终止密码子），其编码的脂肪酶L-I的氨基酸序 列如SEQIDN0.2所示，共334个氨基酸；该酶蛋白是一个全新的脂肪酶，与其它脂肪酶氨 基酸序列的最大相似度为51%。根据分析得到的脂肪酶基因1-1序列，设计全长扩增引物 如下：正向引物：5' -CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3 '，下划线部分为BamHI酶切位 点；反向引物：5' -CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3 '，下划线部分为HioI酶切位点。 [002引实施例2 :脂肪酶基因1-1的克隆及载体构建
[0029] 2. 1PCR扩增
[0030] 将实施例 1 设计的引物（正向引物 5' -CACGGATCCATGAGGATCGATCCGCCCG-3 '，反 向引物5' -CATCTCGAGTTAGGCGGGCTGTGGGGTC-3')送至上海生物工程有限公司合成引物， 合成的引物使用TE稀释到10yM，提取放线菌（Str巧tomycessp.)SCSIO13580的总DNA 作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
[00引]表IPCR反应体系
[0032]
[0033] 使用W下PCR扩增程序扩增脂肪酶基因:a. 95°C变性5min;b. 95°C变性Imin, 55~65°C退火0. 5min，72°C延伸Imin20s，进行30个循环；c. 72°C延伸lOmin，冷却到 10 °C。
[0034] 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察。回收1000 bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20yL无 菌水洗脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0035] 2. 2 酶切
[0036] 将纯化回收的PCR产物使用W下体系进行双酶切，酶切时间Ih。酶切体系为：BamH 11y以化〇11yLDNA<0. 3yg，灭菌的双蒸水加至30yL。酶切后纯化回收得到经过双酶切 的PCR产物。
[0037]质粒祀T-28a(+)的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌D册a单菌落，过夜培养。 使用质粒提取试剂盒提取质粒，用BamHI和化Ol按W下体系双酶切酶切，酶切时间Ih。酶 切体系为：BamHIIyL质粒DNA<lyg，灭菌的双蒸水加至20yL。酶切后纯化 回收得到经过双酶切的祀T-28a(+)载体。
[003引上述双酶切使用的限制性内切酶为化ermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯 化回收使用核酸纯化回收试剂盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit),质粒提取试 剂盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0039] 2. 3 连接
[0040] 将经过双酶切的PCR产物和双酶切的祀T-28a(+)载体按照5 : 1的摩尔比例进 行连接。连接使用的T4连接酶购自北京全式金生物技术公司，连接使用的酶量为抓/5yL 连接体系，连接溫度为22°C，连接时间20min。
[0041] 2. 4转化及筛选
[0042] 取10yL连接产物与50yL大肠杆菌D册a感受态细胞中，冰浴30min，于42°C水 浴锅热激50s，冰浴2min后加入500yLLB液体培养基，37°C20化pm培养比。将培养物 4000巧m离屯、Imin后，弃上清400Ji以余下的100JiL涂布于含50JiL/mL卡那霉素的LB平 板，培养2化后挑选单菌落。单菌落于5mLLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切 验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
[0043] 2. 5基因核巧酸序列测定
[0044] 将获得的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与 脂肪酶基因1-1核巧酸序列进行比对，确认是将脂肪酶基因(其核巧酸序列如SEQID NO. 1所示）插入到祀T-28a(+)质粒中，结果完全正确后确认得到带有脂肪酶基因1-1的 祀T-28a(+