具有增强的稳定性和增强的保留催化活性的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的制作方法
【专利说明】具有増强的稳定性和増强的保留催化活性的变体重组 (3-葡萄糖脑昔脂酶蛋白
[0001] 巧关专利申请
[0002] 本申请是中国专利申请201180064243. 6的分案申请。
技术领域
[0003] 本发明的领域包括用于治疗多种溶酶体胆积症的酶替代疗法的蛋白。运些溶酶体 胆积症包括戈谢病。
【背景技术】
[0004] 0 -葡萄糖脑巧脂酶是一种可溶性的溶酶体酶，其功能为在管腔膜表面通过与銷 脂酶激活蛋白C和阴离子憐脂的相互作用来水解糖脂葡糖神经酷胺。0-葡萄糖脑巧脂酶 在组织巨隧细胞从被吞隧的受损细胞和病原体中分解和回收膜的过程中特别重要。由于葡 糖神经酷胺是超过300种参与多种重要的细胞途径和信号级联的糖脂和神经节巧脂的主 要前体分子，因而其是维持运些多种脂质分子复杂的平衡所必需的。 阳0化]戈谢病由0-葡萄糖脑巧脂酶的缺乏引起，该缺乏造成葡糖神经酷胺的蓄积。戈 谢病通过多种临床症状体现，包括贫血、血小板减少、肝脾肿大和骨骼崎形。基于神经受累 情况将戈谢病分为S种类型：1型（非神经型）；2型（急性神经型）；和3型（慢性神经 型）。目前尚无已知的治疗戈谢病的方法，但是已批准使用补充缺乏的P-葡萄糖脑巧脂酶 的酶替代疗法巧RT)和抑制葡糖神经酷胺的合成底物减少疗法来治疗该病。还将其他治疗 方法如小分子药理伴侣和蛋白折叠调节剂作为运种疾病的潜在疗法进行评估。在运些治疗 方法中，ERT是针对戈谢病的内脏症状最成熟和有效的临床疗法。伊米巧酶（重组0-葡 萄糖脑巧脂酶；Cerezyme?，GenzymeCo巧.?)开发出来并被抑A于1994年批准用于治疗戈 谢病，而且是目前治疗运种疾病的标准治疗方法。 阳006] 尽管普遍认为Cerezyme?ERT是最有效的治疗方法，但是运种溶酶体酶在中性抑 和37°C下不稳定。事实上，药物的绝大部分在静脉输注至血液后不久就被不可逆性的灭活。 仅有少部分保持催化活性并进入祀巨隧细胞，其赋予了全部的治疗效果。因此，开发一种更 为稳定的P-葡萄糖脑巧脂酶是有益的，该酶在从蛋白生产步骤到在进入所需的人类对象 后所遇到的生理条件下均不易于被酶灭活。
[0007] 发巧概沐
[0008] 本发明提供了变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，其特征在于与野生型重组 0 -葡萄糖脑巧脂酶相比，具有增强的稳定性。本发明还提供了变体重组0 -葡萄糖脑巧脂 酶蛋白，其特征在于与野生型重组P-葡萄糖脑巧脂酶相比，保留了更高的催化活性。本发 明进一步描述了变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，其在一个或多个下述位置可W具有氨 基酸变异：316、317、321 和 145。
[0009] 本发明描述了一种变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白的制备方法，其特征在于与 野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶相比，保留了更高的催化活性。本发明进一步描述了一种 组合物，所述组合物包括变体重组e-葡萄糖脑巧脂酶蛋白和药学上可接受的载体。本发 明还提供了一种组合物，所述组合物包括变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白和药学上可接 受的缓冲剂。
[0010] 本发明描述了变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的环1 区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象， 所述侧链构象增加所述蛋白活性位点附近的有序性。本发明进一步描述了一种变体重组 0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的活性位点（a6)附近的a-螺旋中具有一 个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，所述侧 链构象稳定所述螺旋并牵拉邻近的环1使其远离催化位点且具有开放和活化的构象。本发 明还提供了一种变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，所述蛋白在0-折叠（02)和a-螺 旋（a2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸 的特征在于具有侧链构象，所述侧链构象有利于不同残基和二级结构之间更好的相互作用 W改善稳定性。
[0011] 本发明提供了一种通过向所需对象给予变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白来治 疗溶酶体胆积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶相比具有 增强的稳定性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋 白来治疗溶酶体胆积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组P-葡萄糖脑巧脂酶相 比保留了更高的催化活性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组0-葡萄糖 脑巧脂酶蛋白来治疗溶酶体胆积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组0-葡萄糖 脑巧脂酶相比具有增强的特异性活性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组 0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白来治疗溶酶体胆积症的方法，所述蛋白的特征在于在下述一个或 多个位置具有氨基酸变异：316、317、321和145。本发明还提供了一种通过向所需对象给予 变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白来治疗戈谢病的方法。
[0012] 本发明还提供了一种化合物，所述化合物包括变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋 白，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、SEQIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈Q IDNO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或 沈QIDNO:16。
[0013] 本发明还提供了一种变体重组e-葡萄糖脑巧脂酶蛋白，其特征在于与野生型重 组0-葡萄糖脑巧脂酶相比能够增加表达。
[0014] 本发明还提供了一种制备包含变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的化合物的方 法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、沈QIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈Q IDNO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或沈Q IDN0:16。本发明还提供了一种制备编码变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的核酸的方 法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个：SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 沈QIDNO:4、沈QIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:7、沈QIDNO:8、沈QIDNO:9、沈QID NO: 10、沈QIDNO: 11、沈QIDNO: 12、沈QIDNO: 13、沈QIDNO: 14、沈QIDNO: 15、或沈Q IDNO:16。 引附图概沐
[0016] 根据对本发明的下述详细描述并结合附图考虑时，本发明的前述和其他方面是清 楚的。出于解释本发明的目的，在附图中所示的均为优选的实施方式，但是将理解的是本发 明不限于所公开的特定方式。附图并不一定是按照比例尺绘制的。在附图中：
[0017] 图I(A)显示了酶活性的巧U量值，用于比较变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白和 野生型酶在典型瞬时转染实验48小时后分泌至细胞培养基中的相对表达情况；度）显示 了western印迹分析，用于比较在瞬时转染后变体重组0 -葡萄糖脑巧脂酶蛋白和野生型 GlcCerase蛋白的相对分泌量。
[0018] 图2显示了在抑7. 5和37°C下H14化修饰、H145F修饰、F316A/L317F修饰、K321N 修饰、K321A修饰、F316A/L317F/K321N修饰、和H14化/K321N修饰的变体重组0 -葡萄糖脑 巧脂酶蛋白与野生型重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比的稳定性；和
[0019] 图3显示了在P册和37°C下具有F316A/L317F修饰的变体重组0-葡萄糖脑巧脂 酶蛋白与野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比的稳定性。
[0020] 发巧详沐
[0021] 通过参考下述的详细描述结合作为本公开一部分的附图和实施例可能更容易理 解本主题。应理解的是本发明不限于本发明所描述和/或所示的特定设备、方法、应用、条 件或参数，并且本发明所使用的术语仅用于通过示例性的方式描述特定实施方式的目的而 非旨在限制所要求保护的发明。
[0022] 此外，除非上下文中另有明示，否则在说明书中包括所附权利要求书中使用的单 数形式的"一"和"一"W及"所述"包括复数，提到一个特定数值至少包括该特定值。本发 明所使用的术语"多个"指一个W上。当表示数值范围时，另一个实施方式包括从一个特定 值和/或至其它特定值。类似地，当通过在其前面使用"约"表示近似值时，应理解为特定 值形成另一个实施方式。所有范围均是开放式和可组合的。
[0023] 提供实施例W帮助进一步理解本发明。所使用的特定材料、方案和条件旨在进一 步解释本发明，不应将其解释为限制其合理的范围。
[0024] 除非另有说明，否则对变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白性质的说明是相对 于野生型重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的性质（SEQIDN0:1)而言的。在本发明中， "GlcCerase"是0-葡萄糖脑巧脂酶的缩写。所有的氨基酸编号均是相对于SEQ.ID.no. 1 而言的。因此，位置145将是SE化ID.NO. 1中的第145个的氨基酸。而且，本发明所公开的 变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白还包括其功能性片段或衍生物。
[002引在本发明中，"约中性抑"指包括通常被认为是生理抑的抑（即，在37°C下抑约 7. 5)
[00%] 适宜的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的特征可W在于，与野生型重组0-葡 萄糖脑巧脂酶蛋白相比，在细胞培养和蛋白生产期间，具有相似或增加的蛋白表达和向细 胞培养基中的分泌。适宜的变体重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白的特征可W在于，与野生型 重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比具有增强的稳定性。运些蛋白在生理条件下具有增强的 稳定性并且那些生理条件可W是体内的。此外，运些蛋白的特征还可W在于在约中性抑和 约37°C的条件下具有增强的稳定性。该增强的稳定性可W在约中性抑和约37°C的条件下 监测约3小时的一段时间。所述增强的稳定性在细胞培养基内保持，并且可W在细胞内保 持。运些蛋白还可W在溶酶体内具有增强的稳定性，并且在溶酶体内的条件可W是约抑5 和约37°C。运些蛋白还可W具有增强的稳定性，其特征在于蛋白水解降解作用减少，减少的 蛋白水解降解作用可W发生在细胞内。此外，减少的蛋白水解降解作用可W在细胞的溶酶 体内。运些蛋白还可W在非生理条件下具有增强的稳定性，如在蛋白纯化过程中的缓冲溶 液中。在蛋白纯化过程中运些缓冲溶液可W具有高于约7的抑或低于约3的抑。运些缓 冲溶液还可W含有有机溶剂或离液盐。运些蛋白还可W在溫度范围为约2°C至约37°C的缓 冲溶液中具有增强的稳定性。此外，运些蛋白还可W在溫度范围为约2°C至约8°C的缓冲溶 液中具有增强的稳定性。而且，运些蛋白可W在溫度约20°C的缓冲溶液中具有增强的稳定 性。运些蛋白还可W在冻融循环后或冻干后复溶时具有增强的稳定性。运些蛋白还可W在 药物制剂缓冲液如盐水中具有增强的稳定性。
[0027] 适宜的变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白可W是其特征在于与野生型重组0-葡 萄糖脑巧脂酶蛋白相比保留了更高的催化活性。运些蛋白在生理条件下保留了更高的催化 活性，并且更高的保留的催化活性可W是在体内。此外，运些蛋白还可W是其特征在于在约 中性抑和约37°C的条件下保留了更高的催化活性。该更高的保留的催化活性可W在约中 性抑和约37°C的条件下监测约2小时的一段时间。运些蛋白在细胞培养基中保留了更高 的催化活性并且更高的保留的催化活性可W是在细胞内。此外，运些蛋白可W在溶酶体内 保留了更高的催化活性并且在溶酶体内的条件可W是约P册和约37°C。运些蛋白还可W 保留了更高的催化活性，其特征在于蛋白水解降解作用减少，该减少的蛋白水解降解作用 可W发生在细胞内。此外，该减少的蛋白降解可W在细胞的溶酶体内。运些蛋白还可W在 非生理条件下保留更高的催化活性，如在蛋白纯化过程中的缓冲溶液中。在蛋白纯化过程 中运些缓冲溶液可W具有高于约7的抑或低于约3的抑。运些缓冲溶液还可W含有有机 溶剂或离液盐。运些蛋白还可W在约2°C至约37°C的溫度范围内保留更高的催化活性。此 夕F，运些蛋白还可W在约2°C至约8°C的溫度范围内保留更高的催化活性。而且，运些蛋白 还可W在约20°C的溫度保留更高的催化活性。运些蛋白还可W在冻融循环后或冻干后复 溶时保留更高的催化活性。运些蛋白还可W在药物制剂缓冲液如盐水中保留更高的催化活 性。
[0028] 变体重组0-葡萄糖脑巧脂酶蛋白还可W在一个或多个下述位置具有氨基酸变 异：316、317、321和145。运些蛋白还可W具有氨基酸变异或多个氨基酸变异：（1)F316A和 L317F;或似K321N;或（3)H14化；或（4)H145F; (5)F316A、L317F、和K321N;或化)K321A; 或（7)K321V; (8)F316A、L317F、和K321A;或（9)F316A、L317F、和K321V;或（10)H145L F316A、和L317F;或（Il)HH化和K321N;或（12)H14化和K321A;或（13)H14化和K321V。 运些蛋白中的某些还可W是其特征在于与野生型重组P-葡萄糖脑巧脂酶蛋白相比，在细 胞培养和蛋白生产期间具有相