oRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物12 再次纯化并连接至EcoRI/NJotl-消化和去憐酸化的祀F6'载体。从各克隆中分离微量制备 的DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对其进行检测。选择克隆7 (称为抑Dl12. 7)， 通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
[0104] 为产生GlcCerase-HH化/F316A/L317F(称为抑Dl13)，通过重叠PCR将氨基酸替 换引入抑D105. 5。通过使用引物A&F和抑D105. 5模板DNA在PCR反应13中产生N-末端片 段（~0. 55化），而使用引物B&E和抑D105. 5模板在PCR反应14中产生C-末端片段（~ 化b)。在PCR反应15中通过加入IyIPCR反应物13&14和引物A&B产生完整的H14化/ F316A/L317FGlcCerasecDNA。如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物 15 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物15 再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载体。 阳105] 为产生GlcCerase-H145F/F316A/L317F(称为抑D114)，通过重叠PCR将氨基酸替 换引入抑D105. 5。通过使用引物A&H和抑D105. 5模板DNA在PCR反应16中产生N-末端片 段（~0. 55化），而使用引物B&G和抑D105. 5模板在PCR反应17中产生C-末端片段（~ 化b)。在PCR反应18中通过加入IyIPCR反应物16&17和引物A&B产生完整的H145F/ F316A/L317FGlcCerasecDNA。如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物 18 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物18 再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载体。
[0106]为产生GlcCerase-HH化/K321N(称为抑D115)，使用BsrGI和BamHI限制性内切 酶对P皿109. 3和P皿110. 2进行消化，通过1 %的琼脂糖制备凝胶分离来自P皿109. 3的~ 0. 5化片段和来自P皿110. 2的~6. 9化片段（在经过热敏憐酸酶处理后）。然后在框架内 将来自P皿109. 3的~0.5化片段（含有K321N氨基酸替换）连接至质粒P皿110. 2 (含有 H14化修饰），其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的 限制性消化对其进行检测。选择克隆5,通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的 表征。
[0107] 为产生GlcCerase-HH化/F316A/L317F/K321N(称为抑D116)，使用BsrGI和 BamHI限制性酶对P皿112. 7和P皿110. 2进行消化，通过1 %的琼脂糖制备凝胶分离来自 P皿112. 7的~0. 5化片段和来自P皿110. 2的~6. 9化片段（在经过热敏憐酸酶?处理后）。 在框架内将来自P皿112. 7的~0. 5化片段（含有F316A/L317F/K321N氨基酸替换）连接 至质粒抑DllO. 2 (含有H14化修饰），其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通 过使用EcoRI和甜al的限制性消化进行检测，W鉴定具有正确的GlcCerase-HH化/F316A/ L317F/K321ACDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其 用于进一步的表征。
[0108] 为产生GlcCerase-K321A(称为抑D117)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言 之，通过使用引物A&J和抑DlOL4作为模板DNA在PCR反应19中产生N-末端片段（~ 1. 化b)，而使用引物B&I和抑DlOL4模板在PCR反应20中产生C-末端片段（~0.5化）。 通过1 %琼脂糖制备凝胶分离PCR产物19和20并将其作为模板DNA在PCR反应21中使用 引物A&B合成完整的K321AGlcCerasecDNA片段。如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离 合成的PCR产物21 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物 21再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载体，其过程如上文所述。从 各克隆中分离微量制备DM,通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对其进行检测。选择克 隆1 (称为P皿117. 1)，并将其用于进一步的表征。
[0109] 为产生GlcCerase-K321V(称为抑D118)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言 之，通过使用引物A化和抑DlOL4作为模板DNA在PCR反应22中产生N-末端片段（~ 1.化b)，而使用引物B&K和抑DlOL4模板在PCR反应23中产生C-末端片段（~0.5化）。 通过1 %琼脂糖制备凝胶分离PCR产物22和23并将其作为模板DNA在PCR反应24中使用 引物A&B合成完整的K321AGlcCe化secDNA片段。如前所述从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离 合成的PCR产物24 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物 24再次纯化并连接至EcoRI/Notl-消化和去憐酸化的祀F6'载体，其过程如上文所述。从 各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对其进行检测。选择克 隆7 (称为P皿118. 7)，并将其用于进一步的表征。
[0110]为产生GlcCerase-F316A/L317F/K321A(称为抑D119)，通过重叠PCR将氨基酸替 换引入抑D105. 5。通过使用引物A&J和抑D105. 5模板DNA在PCR反应25中产生N-末端 片段（~1.化b)，而使用引物B&I和抑D105. 5模板在PCR反应26中产生C-末端片段（~ 0. 5化）。通过1 %琼脂糖制备凝胶分离PCR产物25和26并将其作为模板DNA在PCR反应 27中使用引物A&B合成完整的F316A/L317F/K321A/K321AGlcCerasecDNA片段。如前所述 从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物27 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制 性核酸内切酶消化。如前所述将PCR产物27再次纯化并连接至EcoRINotI-消化和去憐酸 化的祀F6'载体。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对 其进行检测，W鉴定具有正确的GlcCerase-F316A/L317F/K321AcDNA的转化细菌菌株。将 通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。 阳11U为产生GlcCerase-F316A/L317F/K321V(称为抑D120)，通过重叠PCR将氨基酸替 换引入抑D105. 5。通过便用引物A化和抑D105. 5模板DNA在PCR反应28中产生N-末端 片段（~1.化b)，而使用引物B&K和抑D105. 5模板在PCR反应29中产生C-末端片段（~ 0. 5化）。通过1 %琼脂糖制备凝胶分离PCR产物28和29并将其作为模板DNA在PCR反应 30中使用引物A&B合成完整的F316A/L317F/K321A/K321VGlcCerasecDNA片段。如前所述 从1 %的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物30 (~1. 6化）并使用EcoRI和NotI限制 性核酸内切酶消化。如前所述将PCR产物30再次纯化并连接至EcoRINotI-消化和去憐酸 化的祀F6'载体。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化对 其进行检测，W鉴定具有正确的GlcCerase-F316A/L317F/K321VcDNA的转化细菌菌株。将 通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
[0112] 为产生GlcCerase-HH化/K321A(称为抑D121)，使用BsrGI和BamHI限制性酶对 P皿117. 1和P皿110. 2进行消化，通过1 %的琼脂糖制备凝胶分离来自P皿117. 1的~0. 5化 片段和来自P皿110. 2的~6. 9化片段（在经过热敏憐酸酶TM处理后）。在框架内将来自 P皿117. 1的~0.5化片段（含有K321A氨基酸替换）连接至质粒P皿110. 2 (含有化4化修 饰），其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消 化进行检测，W鉴定具有正确的GlcCerase-HH化/K321ACDNA的转化细菌菌株。将通过DNA 测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
[0113]为产生GlcCerase-HH化/K321V(称为抑D122)，使用BsrGI和BamHI限制性酶对 P皿118. 7和P皿110.2进行消化，通过I%的琼脂糖制备凝胶分离来自P皿118. 7的~0. 5化 片段和来自P皿110.2的~6. 9化片段（在经过热敏憐酸酶处理后）。将来自P皿118. 7的~ 0. 5化片段（含有K321V氨基酸替换）框内连接至质粒P皿110. 2 (含有H14化修饰），其过 程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和甜al的限制性消化进行检 巧U，W鉴定具有正确的GlcCerase-HH化/K321VCDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对 选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。 阳114] 表3中汇总了上文中提到的用于构建经修饰的GlcCerase酶的引物序列。 阳11引表3
[0117] 尽管本发明就其特定实施方式进行了描述，但是多种其它的变化和修饰W及其他 用途对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，优选地不是通过本发明的特定披露而是 仅通过所附的权利要求对本发明进行表述。
【主权项】
1. 一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，包括在一个或多个下述位置中的氨基酸变 异：321和145,前提是排除只具有氨基酸变异Κ321Ν的重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。2. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中野生型葡萄糖 脑苷脂酶蛋白的氨基酸序列示出于SEQIDNO: 1。3. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是K321V或Κ321Α〇4. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是H145L或H145F。5. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是F316A、L317F和Κ321Ν。6. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是F316A、L317F和Κ321Α。7. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是H145L、F316A和L317F。8. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是H145L和Κ321Ν。9. 根据权利要求1所述的变体重组葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是H145L和Κ321Α。10. 根据权利要求1所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中氨基酸变异是 H145L和K321V。11. 根据权利要求1所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述蛋白在中性 pH和37°C条件下孵育3小时后测定具有延长的表观半衰期。12. 根据权利要求2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述蛋白与野生型 重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，具有增强的稳定性。13. 根据权利要求12所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述增强的稳定 性是在中性pH和37°C条件下。14. 一种组合物，包括如权利要求1-13中任一项所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶 蛋白，和药学上可接受的载体。15. 权利要求1-13中任一项所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白在制备用于治疗 溶酶体贮积症的组合物中的应用。
【专利摘要】本发明描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白特征为与重组野生型β-葡萄糖脑苷脂酶相比具有增强的稳定性。本发明还提供了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征为与重组野生型β-葡萄糖脑苷脂酶相比保留了更高的催化活性。本发明进一步描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其可以在下述位置中的一个或多个具有氨基酸变异：316、317、321和145。本发明还描述了一种制备变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的方法以及治疗溶酶体贮积症患者的方法。
【IPC分类】C12N9/24, A61K38/47, A61P3/00
【公开号】CN105296447
【申请号】CN201510671991
【发明人】H·杜
【申请人】阿米库斯治疗学公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2011年11月8日
【公告号】CA2817011A1, CN103314105A, CN103314105B, EP2638152A2, EP2638152A4, US8962564, US9254313, US20130344054, US20150216950, US20160184408, WO2012064709A2, WO2012064709A3