一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeSAPK7及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地，本发明设及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白 EeSAPK7及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每 年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。 利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，掲示植物对逆境 胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，克隆抗逆相关基因为培育作物抗逆新种质提供候 选抗逆基因资源。
[0003] 薦糖非发酵相关蛋白激酶家族（Sn服S)在植物的许多生理过程中起着重要的作 用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。Sn服蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨 酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被分为=个亚家族分别 是：Sn服1，Sn服2和Sn服3。Sn服蛋白激酶S个亚家族都有相似的结构特点，N-端都有一 段能与其他蛋白相互作用的激酶结构域，并且结构在=个家族中是高度变化的。
[0004]Sn服2家族基因在功能上表现出一定的差异性，拟南芥中Sn服家族成员中有9个 基因被高渗胁迫（甘露醇或化Cl)诱导，5个基因被ABA诱导，但均不受冷胁迫诱导。在水 稻中，鉴定了 10个Sn服2蛋白激酶家族基因，命名为OsSAPKI~OsSAPKIO;水稻中Sn服基 因，通过蛋白憐酸化分析表明所有成员都能被高渗胁迫激活，但是只有OsSAPKS、0SSAPK9 和OsSAPKIO运S个基因受ABA诱导表达。在小麦中，第一个Sn服2成员是从ABA处理的小 麦胚胎CDNA文库中分离得到的PKABAl,PKABAl的表达除受ABA和干旱胁迫所诱导。此外， 在小麦中还鉴定出多个Sn服家族成员，如hSn服2. 3JaSn服2.AJaSn服2. 7和hSn服2.8。 化SnRK2. 3基因过表达能够增强转基因拟南芥细胞膜的稳定性及对干旱、低溫的胁迫耐性； 化Sn服2. 4基因过表达能够增强转基因拟南芥对干旱、高盐的胁迫耐性，同时不会造成植物 的生长矮化现象。化Sn服2. 7基因功能分析显示，在糖代谢、降低渗透势、增强光系统II的 活性W及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用；Taai服2.8基因过表达的拟南芥 对干旱、低溫、高盐、高溫等均有一定胁迫耐性。
[0005] 综上所述，Sn服蛋白激酶在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关 重要的作用，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗旱、耐 盐的野生植物长穗偃麦草为实验材料，克隆、分离抗逆相关SnRK蛋白激酶基因改良和提高 作物的抗逆性具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白EeSAPK7。
[0007] 本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋EeSAPK7的基因。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0009] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。
[0010] 本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白EeSAPK7的应用。
[0011] 本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白EeSAPK7,来源于长穗偃麦草，其氨基酸序列 如沈QIDNO. 1所示。
[0012] 本发明的蛋白激酶由357个氨基酸残基组成，是Sn服类蛋白激酶。自SEQIDNO. 1 的氨基末端第10-34位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQIDNO. 1的第119-131位氨基酸 残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。 阳01引 沈QIDNO. 1
[0014]
[0015] 为了使蛋白EeSAPK7便于纯化，可在由SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列组成的蛋 白质的氨基末端或簇基末端连接上如表1所示的标签。
[0016] 表1标签的序列
[0017]
[0018] 根据本发明所公开的SEQIDNO.I序列，本发明的转录因子EeSAPK7可人工合成， 也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0019] 根据本发明的EeSAPK7编码基因具有如SEQIDNO. 2所示CDNA序列。
[0020] 沈QIDNO. 2
[0022] 含有EeSAPK7基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发 明的保护范围。
[0023] 可用现有的植物表达载体构建含有EeSAPK7基因的重组表达载体。
[0024] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺巧酸信号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘦瘤诱导（Ti)质粒基因（如姻脂合成酶Nos基因）、植物基因3'端转录 的非翻译区均具有类似功能。 阳0巧]使用EeSAPK7构建重组植物表达载体时，在其转录起始核巧酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花挪菜花叶病毒（CaMV) 35S启动子、玉米的泛素启动子 OJbiquitin),它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构 建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，运些增强子区域可W 是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，W保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可W是天然的，也可 W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或结构基因。
[00%] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 蛋光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莽剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选 择性标记基因，直接W逆境筛选转化植株。
[0027] 本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。
[0028] 本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有EeSAPK7基因的重组 表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。
[0029] 利用任何一种可W引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的Sn服 蛋白激酶EeSAPK7基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的 转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、化质粒、植 物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞 或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可W是单子叶植物，也可 W是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、长穗偃麦草、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪 草、首宿等。
[0030] 本发明W抗旱、耐盐性较强的长穗偃麦草巧Iytrigia elongate L.)为实验材料， 得到了抗逆相关的EeSAPK7蛋白及其编码基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗 旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产 量、加速抗逆分子育种进程，W及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
[0031] 下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
【附图说明】
[0032] 图1为Tl代转基因拟南芥PCR检测。M:Trans2KPlusDNAmarker;1 :阴性对照； 2-8为转基因拟南芥株系。
[0033] 图2为EeSAPK7转基因拟南芥培养基根长表型鉴定。CK为野生型拟南芥；L1-L5 为不同转基因拟南芥株系。
[0034] 图3为EeSAPK7转基因拟南芥耐旱性鉴定。CK为野生型拟南芥；1^、1^3、1^4、1^5为 不同转基因拟南芥株系。
[0035] 图4为EeSAPK7转基因拟南芥筛盒耐盐性鉴定。CK为野生型拟南芥；LU13、L4、 L5为不同转基因拟南芥株系。
【具体实施方式】
[0036]W下实施例中未作具体说明的分子生物学实验