GhTZF1基因在增强植物抗旱性及延缓衰老中的应用的制作方法

GhTZF1基因在增强植物抗旱性及延缓衰老中的应用的制作方法【专利摘要】本发明属于植物基因工程【
技术领域：
】，具体涉及一种分离自棉花的GhTZF1基因的分离克隆、功能验证及应用。本发明克隆的GhTZF1基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；其编码基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本发明还公开了该基因在提高拟南芥对干旱的耐受性及延缓干旱胁迫下的植株衰老中的应用。【专利说明】GhTZFI基因在增强植物抗旱性及延缓衰老中的应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于植物基因工程【
技术领域：
】。具体涉及一种从棉花中分离、鉴定的CCCH型转录因子GhTZFl的功能验证与应用。功能验证表明GhTZFl基因能提高拟南芥对干旱的耐受性以及能够延缓干旱诱导的衰老，同时也能延缓H2O2诱导的衰老。利用本发明克隆的GhTZFl基因，通过遗传转化可应用于增强植物对干旱的耐受性以及延缓干旱造成的衰老。【
背景技术：
】[0002]干旱是指可充足利用的水分短缺而导致产量减少，或者指一段时间没有降雨或者灌溉而影响作物的生长的一种状态(Bernieretal.,2008,Breedinguplandricefordroughtresistance.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,88:927-939)。据统计，全球约1/3的可耕地处于供水不足的状态，而其他耕地也常受到周期性的难以预料的旱灾影响，干旱严重制约着农业生产(Salekdehetal.,2009,Conceptualframeworkfordroughtphenotypingduringmolecularbreeding.Trendsinplantscience,14:488-496)。在非生物逆境胁迫中，干旱是影响农作物产量的主要非生物因素。干旱在我国平均每两年发生一次，严重影响了粮食作物和经济作物的生长与产量，因此通过抗旱育种提高作物的抗旱性或耐旱性已成为干旱和半干旱地区发展农业的重要手段之O[0003]植物的叶片衰老是植物发育进程的一部分，伴随着年龄增长而发生。但是，植物的叶片衰老也受各种各样的内部和外部环境因子影响。对农作物而言，叶片衰老会限制农作物产量。影响叶片衰老的环境因子包括生物和非生物逆境，如:干旱、极端温度、饥饿、氧化胁迫、病原侵染等(Limetal.，2007，LeafSenescence.AnnualReviewofPlantBiology,58:115-136)。作物受到干旱胁迫后，叶片的光合速率和呼吸速率受到影响，叶片衰老加速，作物生长受到抑制，在细胞水平上，膜脂过氧化，细胞物质代谢紊乱(黄沆和陈光辉，2010，水稻抗旱机制及相关基因研究进展，科技信息)。[0004]由逆境胁迫引起的叶片衰老可能是由活性氧的产生而造成的叶绿体降解(RenuKhanna-Chopraj2012，Leafsenescenceandabioticstressessharereactiveoxygenspecies-mediatedchloroplastdegradation.Protoplasma,249:469-481)。前人研究表明干旱诱导的衰老是由于叶绿体抗氧化保护的缺失而引起的(Boschetal.，2001，Drought-1nducedsenescenceischaracterizedbyalossofantioxidantdefencesinchloroplast.Plant,CellandEnvironment,24:1319-1327)0黑暗诱导的叶片衰老是由于活性氧增加而导致叶绿素降解(Rosenvasseretal.，2006，Increaseinreactiveoxygenspecies(ROS)andinsenescence-associatedgenetranscript(SAG)levelsduringdark-1nducedsenescenceofPelargoniumcuttings,andtheeffectofgibberellicacid.Plantscience，170(4):873-879)。通过对耐干旱和不耐干旱的作物比较发现作物对干旱的耐受性是由于增强了抗氧化胁迫的能力(ChopraandSelotej2007，EnvironmentalandExperimentalBotany.60，276-283)。通过转基因技术来延缓叶片的衰老而增强了植株的抗旱性的研究也有少量报道。在烟草中通过SARK启动子驱动表达IPT基因，发现转基因植株抗旱性显著提高；在干旱胁迫下，转基因植株衰老延缓，体内双氧水含量低于野生型，同时抗氧化保护的物质高于野生型(Riveroetal.，2007.Delayedleafsenescenceinducesextremedroughttoleranceinafloweringplant.PNAS)。将拟南芥14_3_3蛋白转入棉花后,发现转基因植株衰老延缓,抗旱性提高(Yanetal.,2004,OverexpressionoftheArabidopsisl4-3_3proteinGF14Aincottonleadstoa“stay-green，，phenotypeandimprovesstresstoleranceundermoderatedroughtconditions.Plantandcellphysiology,45，1007-1014)。综合前人研究表明，植株调控活性氧水平的能力与其耐逆境胁迫的能力相关，植物具有一套自我保护和修复机制来抵御体内的氧化胁迫，包括一些将(V离子转化成双氧水以及清除双氧水的酶和一些维持细胞内氧化还原稳态的抗氧化保护物质。[0005]在拟南芥中，CCCH类锌指蛋白具有68个成员，它们具有一个典型的锌指结构域由CX6_14Cx4_5Cx3H组成，其中X代表任意氨基酸。CCCH类锌指蛋白具有1-6个CCCHmotifs，根据锌指结构域中半胱氨酸和组氨酸的距离和锌指结构域的数目，将拟南芥CCCH超家族分为11个亚家族。其中第九亚家族是植物所特有的串联锌指蛋白，该亚家族除具有典型的Cx7Cx5Cx3H-X16-Cx5Cx4Cx3H串联锌指结构域外，在其上游还具有一个植物所特有的锌指结构域Cx5H-X4-Cx3H,其中X代表任意氨基酸。表达分析表明该亚家族成员可能参与了植物对逆境的响应(Wangetal.,2008,Genome-wideanalysisofCCCHzincfingerfamilyinArabidopsisandrice.BMCGenomics,9，44)。迄今为止，一些植物特有的TZF基因的功能相继被报道。PEIl(AtTZF6)参与了拟南芥胚胎发育过程(ZhongsenLiandTerryL.Thomas,1998,ThePlantCell,10,383-398)；SOMNUS(AtTZF4)参与了光依赖的种子萌发(Kimetal.,2008,S0MNUS,aCCCH-TypeZincFingerProteininArabidopsis,NegativelyRegulatesLight-DependentSeedGerminationDownstreamofPIL5.ThePlantCell,20,1260-1277)；AtSZFl(AtTZFll)和AtSZF2(AtTZFlO)负调控了盐响应基因的表达而参与了植物对高盐的响应过程(Sunetal.,2007,TheCCCH-TypeZincFingerProteinsAtSZFlandAtSZF2RegulateSaltStressResponsesinArabidopsis.PlantCellPhysiol.48(8)，1148-1158)。这些植物特有的TZF基因参与了一些发育和逆境响应过程，但是对相应的调控机制仍然有待挖掘。在烟草中超量表达GhZFPl增强了转基因烟草的耐盐性以及提高了转基因烟草的抗病性，酵母双杂交结果显示该基因可能与RD21A和PR5互作(Guoetal.,2009,GhZFPl,anovelCCCH-typezincfingerproteinfromcotton,enhancessaltstresstoleranceandfungaldiseaseresistanceintransgenictobaccobyinteractingwithGZIRD21AandGZIPR5.NewPhytol,183，62-75)。目前，尚未有从棉花中分离克隆的TZF类基因参与植物的抗旱性及延缓干旱诱导的衰老的报道。【
发明内容】[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从陆地棉中分离克隆一个与棉花抗逆和发育相关的转录因子，通过转化拟南芥，验证其在抗旱和延缓叶片衰老中的功能。[0007]我们基于棉花细胞壁重建的差减文库(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot，59:3661-3674)，分离到在细胞壁重建过程中差异表达的GhTZFl基因，超量表达与GhTZFl具有较高同源性的AtTZFl基因后增强了拟南芥的抗旱性和耐冷性(Linetal.,2011,TheArabidopsistandemzincfingerproteinAtTZFlaffectsABA—andGA—mediatedgrowth,stressandgeneexpressionresponses.PlantJournal,65，253-268);超量表达AtTZF2和AtTZF3增强了拟南芥的抗旱性(Leeetal.,2012,ArabidopsisZincFingerProteinsAtC3H49/AtTZF3andAtC3H20/AtTZF2areInvolvedinABAandJAResponses.PlantCellPhysiol,53，673-686)。但是这些基因都是通过ABA或JA介导的。GhTZFl基因对ABA没有响应，我们发现GhTZFl基因参与植株抗旱性及延缓干旱诱导的衰老，同时能延缓多种逆境胁迫下地植株衰老可能是通过调控植株体内的氧化还原平衡稳态而介导的。[0008]本发明通过如下技术方案实现:[0009](I)本发明从棉花中分离得到一个与棉花抗逆和发育相关的转录因子基因GhTZFl，它的核苷酸序列如序列表SEQNO:1所示，在该序列表中的第20-1109位所示的序列是该基因的编码区，其编码的蛋白与拟南芥中的AtTZFl，AtTZF2，AtTZF3基因的同源性分别为52.69%，54.92%和52.13%，聚类分析表明该基因编码的蛋白与AtTZFl同源度最高，我们将这个基因命名为GhTZFl基因。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信息构建了该基因的超表达载体，它是序列表SEQNO:2中的第1-362位所示的DNA序列。[0010]本发明的转录因子的基因(核苷酸序列见SEQIDN0:1)来源于棉花，其由1089个碱基组成，蛋白质编码序列有362个氨基酸组成，它是SEQIDNO:1所示序列的自5’端第20位碱基到1109位碱基组成。该基因在对逆境胁迫，激素以及棉花生长发育的影响上尚未有任何报道。通过不同的胁迫处理及激素处理野生型(非转基因)棉花，检测该基因在野生型棉花中的表达情况，发现该基因受干旱(PEG)、盐(NaCl)，茉莉酸(JA)的诱导表达(见图2)。通过构建该基因的超量表达载体PK2GW7.0(其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)，获得转化载体PK2GW7.0-GhTZFl(见图3C)，将该转化载体转化到哥伦比亚生态型拟南芥中，得到该基因的超表达转基因阳性拟南芥植株，检测其表达量并选取具有合适表达量的两个纯系进行后续实验(见图4)。当对野生型拟南芥以及超表达转基因拟南芥植株进行PEG(水势为-0.5MPa)模拟干旱处理时，发现在正常条件的培养基上，超表达拟南芥和野生型拟南芥的萌发率一致，而在PEG存在的培养基上，转基因拟南芥的萌发率明显高于野生型拟南芥，说明该基因的超量表达可以提高拟南芥对PEG的抗性(见图5A和图5B)。通过黑暗处理离体叶片时，相对于对照而言，黑暗促进了叶片衰老，但是与野生型比较而言，超表达拟南芥植株叶片受黑暗诱导的衰老被显著延缓(图5C)。表明该基因可以抑制黑暗诱导拟南芥叶片的衰老。通过用茉莉酸甲酯处理拟南芥离体叶片时，相对于平行对照而言，拟南芥叶片的衰老加速，但是与野生型拟南芥相比，超表达拟南芥植株叶片受茉莉酸甲酯诱导的衰老被显著延缓(图OT)。表明该基因能够抑制茉莉酸所调控的拟南芥叶片衰老。通过用双氧水处理离体拟南芥叶片时，相对于平行对照，拟南芥叶片的衰老加速，但是野生型的拟南芥叶片衰老显著快于超表达拟南芥植株叶片(图5E)。这说明该基因能够延缓双氧水诱导的拟南芥叶片衰老，即该基因能够增强植株耐氧化胁迫的能力。通过干旱处理成株期拟南芥发现，超量表达拟南芥转基因植株的萎焉程度明显低于野生型拟南芥(图6A-a，b)，对其相对含水量的测定发现，正常情况下转基因植株与野生型植株的相对含水量一致，但是受到干旱胁迫后，野生型拟南芥的相对含水量显著低于转基因拟南芥植株(图6B)。说明超量表达该基因能提高拟南芥植株的抗旱性。对植株体内双氧水含量的测定发现，受到干旱胁迫后，野生型拟南芥双氧水含量的升闻闻于超表达拟南芥植株(图6C),检测与氧化胁迫相关的裳老相关基因的表达，发现在干旱情况下，野生型拟南芥中这些基因的表达明显高于超表达系(图6D)。说明该基因会影响植株体内双氧水含量，并且会影响植株在逆境胁迫下的衰老。通过进一步延长干旱时间后发现，转基因植株显著延缓了干旱诱导的衰老(图6A中的c至图6A中的h)，通过测定MDA的含量来评价膜脂过氧化的程度发现，在受到干旱胁迫后，超表达拟南芥植株的MDA含量显著低于野生型拟南芥(图6E)，表明超表达拟南芥植株的膜脂过氧化程度显著低于野生型拟南芥植株，这些说明该基因具有调控拟南芥植株在逆境胁迫下的氧化还原稳态的能力。[0011]具体地，本发明的操作步骤如下:[0012]I)通过RACE扩增出GhTZFl的5’和3’端，将序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列,根据测序的序列设计超表达载体的引物，以棉花cDNA为模板，扩增其全长(翻译起始位点至下游1086个碱基)，获得DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0013]2)将步骤I)中扩增得到的全长ORF片段连接到中间载体HX)NRtm221(购自Invitrogen公司，美国，)上，通过BP-LR反应，将该片段连接到超表达载体PK2GW7.0(比利时国立根特大学惠赠)上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOPlO中，获得GhTZFl超表达转化载体。利用农杆菌介导的转基因方法，将所述的载体导入拟南芥中，获得转化植株GhTZFl。[0014]3)借助卡那霉素筛选及分离比统计的方法获得转基因阳性纯和植株，通过RT-PCR的方法，检测转基因植株的表达量。鉴定转基因植株的表型，并进行统计分析。[0015]4)用干旱、高盐以及各种激素处理野生型棉花品种YZl两叶一心的幼苗，检测GhTZFl基因对不同胁迫条件的应答。[0016]5)用GhTZFl超表达植株进行各种逆境和激素胁迫，观察其表型。[0017]6)将生长5周的用GhTZFl超表达转基因阳性拟南芥植株和野生型拟南芥植株进行干旱处理，观察其表型，并测定干旱胁迫下相关指标及基因的表达。[0018]本发明的优点在于:[0019]1.本发明克隆的GhTZFl基因可提高植物对干旱的耐受性，因此能够利用基因工程技术有目的提高植物耐干旱的能力。[0020]2.本发明能够利用基因工程技术有目的延长植株在逆境胁迫下的生命周期，进而可用于提高植株在逆境胁迫下产量的提高，并能用于研究干旱和叶片衰老的分子机制。【专利附图】【附图说明】[0021]序列表SEQIDNO:1是本发明分离克隆GhTZFl基因的核苷酸序列，序列长度为1318bp,ORF长度为1086bp。[0022]序列表SEQIDNO:2是GhTZFl基因编码的蛋白质的序列，编码362个氨基酸。[0023]图1:一种采用ClustalW软件和MEGA4.0软件(公开使用软件)对GhTZFl编码序列与拟南芥中的CCCH型第九亚家族成员基因和AtC3H14，AtC3H15聚类分析的结果。通过聚类分析表明，GhTZFl编码序列与拟南芥中的TZF编码序列中的AtTZFl同源性最高，因而命名为GhTZFl。[0024]图2:使用Real-timePCR和RT-PCR的方法检测GhTZFl基因对逆境处理和其组织的表达模式分析。图2A为PEG处理下GhTZFl的表达情况；图2B为NaCl处理下GhTZFl的表达分析；通过表达分析表明=GhTZFl受PEG和NaCl诱导表达，在24h时诱导表达量最高。图2C为GhTZFl随着叶片衰老，其表达量降低。[0025]图3:构建超表达载体所用的载体。图3A为BP反应的中间载体pD0NR?221，图3B为所使用的超量表达载体PK2GW7.0的示意图，图3C为一种基因所使用的超量表达载体p35S-GhTZFl的构建示意图。[0026]图4为GhTZFl超量表达转基因拟南芥PEG处理下表型分析示意图。图中:图4A为转基因拟南芥表达量的检测，其中左起第一个泳道为野生型，第二个泳道为转基因系GhTZF1-3(后面的标注为0X3)，第三个泳道为转基因系GhTZFl-4(后面的标注为0X4)，Actin2为拟南芥肌动蛋白，作为内参基因以检测上样量是否一致。图4B为PEG处理下(-0.5MPa)种子的萌发情况，其中a，b，c分别为野生型，GhTZFl超表达系0X3以及GhTZFl超表达系0X4在正常培养基上的萌发情况；d，e，f分别为野生型，GhTZFl超表达系0X3以及GhTZFl超表达系0X4在水势为-0.5MPa的PEG培养基上的萌发情况。图4C为PEG处理下(-0.5MPa)种子的萌发速率统计结果。正常情况下，野生型与超表达系的萌发速率一致，在PEG存在的条件下，野生型的萌发速率远低于两个超表达系。[0027]图5为GhTZFl基因在延缓叶片衰老中的应用。图5中:图5A为转基因和野生型拟南芥离体叶片在黑暗处理下的衰老表型，其中左边的为未处理前的对照，从上往下第一排为野生型，第二排为0X3，第三排为0X4;右边的为黑暗处理7天后的结果。图5B为转基因和野生型拟南芥离体叶片在茉莉酸甲酯处理下的衰老表型，其中上排的为平行对照，下排的为45uM茉莉酸甲酯处理4天后的结果，左起第一个为野生型，第二个为0X3，第三个为0X4。图5C为双氧水(H2O2)处理离体叶片的表型，其中上排的为平行对照，下排的为IOmMH2O2处理4天后的结果，左起第一个为野生型，第二个为0X3，第三个为0X4。[0028]图6为GhTZFl能够提高植株的抗旱性并能延缓干旱诱导的衰老。图中:图6A为干旱处理后的表型，其中上排的为干旱处理7天后的表型，下排的为干旱处理15天后的表型；左边的均为正常条件下植株的生长情况，右边的均为干旱处理情况下的表型鉴定，每种生长条件下，从左往右依次为野生型，0X3，0X4。图6B为干旱处理7天后植株体内相对含水量的统计结果。图6C为干旱处理7天后植株体内双氧水含量的统计结果。图6D为干旱处理7天后与氧化胁迫相关的衰老相关基因的表达情况，其中左边的3个泳道代表正常条件下，右边的3个泳道代表干旱处理情况下，3个泳道从左往右依次代表野生型，0X3，0X4。图中CK均代表正常生长情况，DT均代表干旱处理情况。图6E为干旱处理15天后植株体内丙二醛含量的统计结果。【具体实施方式】[0029]以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有GhTZFl基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GhTZFl基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。[0030]实施例1GhTZFl基因的分离克隆及表达模式分析[0031]本申请人:在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的前期工作中从建立细胞壁再生的SSH文库(Yangetal.,2008,Expressionprofileanalysisofgenesinvolvedincellwallregenerationduringprotoplastcultureincottonbysuppressionsubtractivehybridizationandmacroarray.JExpBot,59:3661-3674)中分离出的一段EST序列(NCBIEST登录号FF403655，提交时间2009年4月)，对该EST序列序列在NCBI基因库中进行tBLASTx比对，发现这个序列可能是CCCH-type转录因子。这条EST序列没有包含完整地开放读码框，我们采用RACE(rapid-amplificationofcDNAends)法通过PCR进行cDNA末端快速克隆技术以得到这个基因完整的编码序列。具体步骤如下所述:A.RNA的提取及cDNA的获得[0032]从陆地棉C201(来自中国棉花种植资源库，中国河南安阳，中国农业科学院棉花研究所管理)细胞壁再生3h的样品中提取总RNA(参照Zhuetal.报道的方法，文献见:Zhuetal.,2005,AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica,31,1657-1659),利用反转录酶SuperscriptIIK购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0[0033]B.GhTZFl基因全长序列的获得[0034]米用RACE方法(rapid-amplificationofcDNAends)(Frohmanetal.,1988,Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscripts:amplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS,85,8998-9002.)分别扩增出GhTZFl基因的5，端和3，端，采用的引物序列分别为GhTZF5r-l(5，-CATGGGCGAACCAACATAATCCAAATC-3’)和GhTZF5r_2(5，-AAGCGGACCCATTTCCTCTCGGACTC-3’)，GhTZF3r_l(5，-AATGAATGGTGCTTGTTCCTGGGGC-3’)和GhTZF3r_2(5，-TTCCACACTCCGACCCGGTTTTTGC-3’)。将序列拼接后得到GhTZFl的cDNA序列。根据上述所得的拼接序列设计ORF引物，其上下游引物分别为=GhTZFl-F(5’-CAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFl-R(5’-TCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以细胞壁再生3h的cDNA为模板利用PCR技术扩增GhTZFl的0RF。PCR条件为94°C预变性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，28个循环；72°C延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM_T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)，筛选阳性克隆并测序。其序列为SEQIDNO:1所不的核苷酸序列。再通过ORFFinder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的0RF，其表达的蛋白为SEQIDN0:2所示的蛋白质的氨基酸序列。[0035]C.PEG和NaCl处理、不同发育阶段拟南芥叶片的总RNA的提取、cDNA的获得及GhTZFl基因的表达分析[0036]以陆地棉YZl为材料(金双侠，即Jinetal.,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiolPlant,2006,50:519-524)，提取新叶、成熟叶、老叶以及聚乙二醇(PEG)和NaCl处理不同时间点各样品的RNA(方法同前)，选取的PEG和NaCl处理的时间点分别是Oh，lh，3h，6h，12h，24h。正常生长的YZl选取相对应的时间点以作平行对照。利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA,反应条件为:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin0以上述反转合成的cDNA为模板，采用Real-timePCR检测GhTZFl的表达水平，所用引物为:GhTZFl-RTS:(5，-TCGGTGGCCTTTGATTCTTCT-3’)和GhTZFl-RTA:5’-(AGGCAGTAGCACCACMMTAGAG-3’)。同时用引物GhUbiquitin7_F:(5，-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’)和GhUbiquitin7-R:(5，-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’)对棉花GhUbiquitin7(GenBank登陆号:DQ116441)基因做特异扩增，作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μI)包括:1μI稀释后的cDNA(等于IOng起始总RNA)，10μ12XPCRMasterMix,200nM的引物。反应条件为:95°C30sec；95°C5sec，60°C35sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明:本发明克隆的基因GhTZFl受PEG和NaCl处理诱导表达，均在处理24h时表达量最高，GhTZFl的表达量随叶片发育而降低。[0037]实施例2:GhTZFI基因植物超量表达载体的构建[0038]根据得到的SEQIDNO:1序列设计引物用于构建表达载体，在引物两端分别加上BP-LR反应的接头碱基，引物序列分别为GhTZFlBP-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)，以T-GhTZFl质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C预变性3min；94°C30sec,58°C30sec,72°Clmin，共28个循环；72°C延伸7min，经PCR扩增得到包含完整ORF的PCR产物。PCR产物经BP反应连接至pD0NR?221载体(购自Invitrogen公司，美国，)上效果见图3A，后转化大肠杆菌感受态细胞T0P10，以GhTZFl的特异引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3，)和GhTZFlBP-R5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3，)进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为:94°C预变性3min；94°C30sec,55°C30sec，72°Clmin，25个循环；72°C延伸7min。再用LR反应将GhTZFl基因连接至植物表达载体pK2GW7.0(比利时国立根特大学惠赠，LR酶购自Invitrogen公司，美国，室温反应4小时，图3B)，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞T0P10。以GhTZFl的特异引物GhTZFlBP-F(5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和GhTZFlBP-R(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTCATTTCACCAACTCAGATAC-3’)进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为:94°C预变性3min；94°C30sec，55°C30sec,72°Clmin，25个循环；72°C延伸7min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的超量表达质粒p35s-GhTZFl(图3C)。[0039]将构建得到的的p35s_GhTZFl载体转化农杆菌菌株GV3101(Rogeretal.,2000,AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.TrendsPlantSci,5，1360-1385),挑取单菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm,28°C摇48h,按菌液和甘油体积比为1:1加入1.5mL离心管混匀，-70°C保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。[0040]以上及以后所述的LB培养基配方为:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L；用5mMNaOH调pH=7.2;用蒸馏水定容至IL;在高温121_125°C高压灭菌15_20min。LB固体培养基为每升加入Sg琼脂。[0041]实施例3GhTZFl基因的遗传转化及筛选鉴定[0042]A.拟南芥的准备[0043]供试材料为野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaL.Columbiaecotype)。野生型拟南芥种子经过春化处理后点播拟南芥种植专用营养土(培蕾牌，中国，江苏，镇江生产，商品营养土)并放入人工培养室(16小时光照，22±2°C)等拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水。[0044]B.农杆菌的活化[0045]从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的GhTZFl基因)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28°C暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5°C，IOOrpm)，其OD6tltl=0.8-1.0时即可用于转化；[0046]将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入IOOml浓度为5%(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28°C摇床中复苏1_2小时。加入表面活性剂0.05%(V/V)SilwetL-77，震荡摇混匀。[0047]C.农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选[0048]农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照参考Zhangetal.，2006报道的方法(Zhangetal.,2006,Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,1，641-646)。具体步骤如下:[0049](I)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30秒钟，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24小时；[0050](2)24小时之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；[0051](3)—个星期之后重复上述(I)的操作；[0052](4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即为T1代种子。[0053](5)将收获的种子消毒:先用70%(V/V)乙醇溶液浸泡I分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；[0054](6)处理后的种子用Topagar(0.1%(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在含卡那霉素的拟南芥生长培养基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基，MS培养基为通用培养基，1/2MS是指无机盐成分减半)表面；[0055](7)4°C下春化处理3天，移入培养室培养10天后，共选取具有卡那霉素抗性植株20株；[0056](8)将20株转基因T1代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T2代种子。[0057](9)将收取的T2代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作I次；[0058](10)4°C下春化处理3天，正常培养10天后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；[0059](11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3:1的株系认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即为T3代种子。[0060]D.转基因拟南芥植株的纯系检测[0061]将收取的T3代转基因拟南芥种子按实施例3中农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选的操作步骤(5)-(6)进行操作I次；然后4°C春化3天，移入培养室培养10天后查看转基因植株在固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系即认为是转基因纯系T4代种子，用作下一步表型分析和功能鉴定。[0062]实施例4:转基因拟南芥的表达分析[0063]收集T3代种子生长的拟南芥植株地上部分以提取RNA，RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。[0064]cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与Iμ1500μg/mloligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，IμII0mMdNTP,DEPC-water混合，总体积为I2μI;然后65°C变性5min冰上骤冷；再加入8μI含有4μIRTbuffer,2μ10.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasin#RibonucleaseInhibitor(购自Promega公司，美国)，和200unitsofSuperscriptIII反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50°C温浴Ih合成第一链；反应结束后75°C处理15min使SuperscriptIII反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μI后-20°C保存待用。[0065]以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物GhTZFl-AtOS和GhTZFl-AtOA对GhTZFl基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长284bp)。同时用拟南芥Atactin2(GenBank登陆号:NM_179953)基因作为内对照基因做特异扩增(扩增产物长216bp)。PCR反应体系的总体积为20μ1，DNA模板Iul(约50叩)、1父13卩酶反应缓冲液、251111MgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加ddH20至20μI。反应程序为:94°C变性5min，94°C30s,55°C30s,72°C30s30cycles，72°C延伸5min。获得的PCR产物取10μI以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。[0066]结果表明:本发明克隆的GhTZFl基因在拟南芥中能够表达，并且在不同转基因系中的表达量有差异。后续的功能验证研究中选取具有合适表达量的0X3和0X4两个系来进行分析(图4Α)。[0067]所用引物为:[0068]GhTZFl-AtOS:5’-GTGAGGAGGTGTGCTCGTGGAAG-3’[0069]GhTZFl-AtOA:5’-CGAAGCTGCTCCGGTGTGTG-3’[0070]actin-f:5’-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3’[0071]actin-r:5，-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3’[0072]实施例5:利用转基因拟南芥对GhTZFl基因进行功能验证，[0073]具体步骤如下:[0074]A.PEG处理萌发实验[0075]将超表达两个家系0X3，0X4和野生型WT的T3代种子置于1/2MS培养基和含有PEG(-0.5MPa)的1/2MS培养基上，观察种子萌发。在正常培养基上，WT、0X3和0X4的萌发一致，在PEG(-0.5MPa)培养基上，WT的萌发慢于超表达两个家系0X3和0X4，这说明该基因的超表达可以提高对PEG的抗性，结果见图5A。对萌发速率进行统计发现超表达家系的萌发速率在前期远高于野生型，随着时间延长，超表达系可以完全萌发，而野生型的萌发率仍低于超表达系，统计结果见图5B。[0076]B.黑暗处理离体叶片[0077]选取超表达两个家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的莲座叶置于黑暗条件下离体培养7天，平行对照为正常光照条件下的叶片，发现与平行对照相比，黑暗处理诱导了叶片衰老，但是黑暗处理7天后，相比于野生型，转基因叶片的叶绿素降解被显著延缓，表明超表达该基因可以延缓黑暗诱导的衰老，结果如图5C。[0078]C.MeJA处理离体叶片[0079]选取超表达两个家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的莲座叶在含有45uM的茉莉酸甲酯(MeJA)溶液中避光处理4天，平行对照为在水溶液中避光处理4天，发现与平行对照相比，茉莉酸甲酯加速了叶片衰老，但是在茉莉酸甲酯的处理下，超表达系的叶片衰老程度明显低于野生型，表明该基因可以延缓茉莉酸甲酯诱导的衰老，结果见图[0080]D.双氧水处理离体叶片[0081]选取超表达两个家系0X3，0X4和野生型WT的T3代植株相同部位的莲座叶在含有IOmM的双氧水(H2O2)溶液中避光处理4天，平行对照为在水溶液中避光处理4天，发现与平行对照相比，双氧水加速了叶片衰老，但是在双氧水的处理下，超表达系的叶片衰老程度明显低于野生型，说明该基因可以延缓双氧水诱导的衰老，具有耐氧化胁迫的能力，结果见图5E0[0082]E.GhTZFl超量表达和野生型拟南芥干旱处理[0083]将超表达转基因拟南芥0X3和0X4及野生型种子点播于拟南芥专用营养土(培蕾牌，江苏镇江生产的产品，公开销售)，并放入人工培养室(16小时光照，22±2°C)等拟南芥生长5周，停止浇水I个星期，观察植株的萎焉程度，发现与对照野生型相比，超表达植株并未出现明显萎焉，而野生型出现了明显萎焉，结果见图6A-a和图6A-b，并测定了植株体内的相对含水量，发现正常生长条件下，转基因系拟南芥与野生型拟南芥的相对含水量并无差别，而在干旱情况下，野生型拟南芥的相对含水量显著降低，转基因系拟南芥的相对含水量显著高于野生型拟南芥，统计结果见图6B，这些说明该基因能够提高拟南芥植株的抗旱性。待正常生长5周的拟南芥停止浇水15天后，发现植株均出现严重萎焉，并且干旱严重诱导了野生型叶片衰老加速，而与野生型相比，超表达系植株干旱诱导的衰老被明显抑制，结果见图6A-c至图6A_h。[0084]F.GhTZFl超量表达植株和野生型拟南芥干旱处理后生理指标的测定和相关基因的表达[0085]I)过氧化氢定量测定。[0086]在酸性环境中，过氧化氢可将Fe2+离子氧化成Fe3+离子，Fe2+离子再与染料分子结合形成Fe3+_染料复合物，该复合物在560nm(或595nm)处有最大吸收波长，且吸光值与过氧化氢的浓度成正比。[0087]将拟南芥样品用液氮研磨，取0.1g左右的样品至2ml离心管中，立即加入1.8ml预冷的80%丙酮，振荡20分钟，4°C，13000rpm/min离心15分钟，吸取上清液转入新的离心管用于后续实验。按照试剂盒H202quantificationkit(SangonBiotech,Shanghai,China)提供的方法对过氧化氢进行定量测定。对干旱7天后植株体内的双氧水含量测定发现，干旱能够提高植株体内的双氧水含量，即打破了细胞的氧化还原稳态，但是与野生型拟南芥相比，超表达系拟南芥的双氧水升高明显低于野生型拟南芥，说明该基因可以调控双氧水的积累，维持胞内氧化还原平衡状态，统计结果见图6C。[0088]2)GhTZFl超量表达和野生型拟南芥干旱处理下衰老相关基因的表达[0089]在干旱处理7天时分别采集超表达系0X3和0X4及野生型拟南芥的地上部分，提取RNA,RNA的抽提用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。反转录后用RT-PCR检测衰老相关基因(0RE9，SAG21，SAG14，ERD1)的表达。拟南芥Atactin2(同上)基因作为内对照基因。结果表明:干旱处理的情况下，与野生型相比，转基因中SAG相关基因的表达量下调，表明干旱诱导的衰老在转基因植株中得到延缓(见图6D)。[0090]所用引物分别为:[0091]0RE9-F:5，-GACACAATCGGTTTCGCACTG-3，[0092]0RE9-R:5’-CTCCTCTGGTTAACATCTCTATCCTG-3’[0093]SAG21-F:5’-ATCGTATCTGCTTTCGTCTCTCG-3，[0094]SAG21-R:5，-TTCCACTCCCTTCTTCTTCATCAC-3，[0095]SAG14-F:5’-GGAGGACTACGATGTTGGTGATGA-3，[0096]SAG14-R:5’-TGTGGCTAATGGGTTTCTCTTTCT-3’[0097]ERDl-F:5，-ATGTCACCTCCATCGCCGCT-3’[0098]ERDl-R:5，-GAACCGTTCGAAAACCGCTG-3，[0099]3)丙二醛(MDA)含量的测定。[0100]植物器官衰老或在非生物逆境条件下，膜脂发生过氧化作用，丙二醛是产物之一，通常利用它作为膜脂过氧化指标。在干旱处理15天后取样进行MDA含量测定。天平称取0.1g左右的拟南芥莲座叶叶片，剪刀剪碎后加10%TCA2mL，用预冷的研钵置于冰上研磨至匀衆状，倒入2mL离心管中。在12000rpm下冷冻(4°C)离心IOmin,取上清液0.8mL至新的2mL离心管中，向其中加入0.6%TBA0.8mL，混合后在100°C沸水中煮15min后冰上立即冷却后离心取上清。用分光光度计分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。并按公式算出MDA浓度，再算出单位鲜重组织中的MDA含量(μmol/g)。结果计算，按公式C/ymol/L=6.45(A532-A600)*(V1*V)/(V2*W)。其中Vl为反应液总量，V2为反应中提取液量，V为提取液总量，W为样品质量。最终结果发现干旱导致膜脂过氧化，但是与野生型相t匕，超表达系的膜脂过氧化程度降低，绘图如图6E。[0101]以上过程中用到的拟南芥正常生长培养基:5mMKNO3,2mMMgSO4,2mMCa(NO3)2,ImMKH2PO4,1.5mMKCI，70μMH3BO3,14μMMnCl2,1μΜZnSO4,0.5μMCuSO4,10μMNaCI，0.2μMNa2MoO4,40μMFe-EDTA,10g/L蔗糖，ρΗ5.7，8g/LAgar0[0102]特别说明:本发明专利申请得到“中央高校基本科研业务费专项资金资助(2010QC034)”的资助。【权利要求】1.一种从棉花中分离的GhTZFl基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种从棉花中分离的GhTZFl基因，其蛋白质的序列如SEQIDNO:2所示。3.一种超表达载体p35s-GhTZFl，其特征在于，该载体含有如权利要求1所述的基因。4.权利要求1所述的基因在提高拟南芥耐旱性及延缓干旱诱导衰老中的应用。【文档编号】C07K14/415GK103468712SQ201310365814【公开日】2013年12月25日申请日期:2013年8月20日优先权日:2013年8月20日【发明者】张献龙,杨细燕,周婷,王丽晨申请人:华中农业大学