基因在增强植物抗旱性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种GhEXLB2基因在增强植物抗 旱性中的应用。从棉花中克隆得到一种细胞壁蛋白基因GhEXLB2,功能验证表明超表达 GhEXLB 2基因能提高棉花对干旱的耐受性。利用本发明克隆的GhEXLB 2基因，通过遗传转化 可应用于增强植物对干旱的耐受性。
【背景技术】
[0002] 干旱是影响作物生长、限制作物产量的主要非生物胁迫因子。据统计，世界干旱、 半干旱地区占地球陆地面积的三分之一（Salekdeh et al. 2009)。我国干旱、半干旱地区占 全国陆地面积的二分之一，干旱天气频繁出现，给我国作物生产带来极大的影响。
[0003] 抗旱性是一个由多基因控制的复杂性状，涉及多种抗旱机制和信号传导途径。植 物在遇到干旱胁迫后，植物细胞的形态结构、生理生化、代谢、基因表达等许多方面都产生 一系列变化，以最大限度地减轻逆境造成的伤害（Bray 2007)。近些年来，通过同源发掘、基 因克隆和遗传转化等方法发掘并验证了一些参与植物干旱胁迫响应相关的基因，根据基因 蛋白产物功能的不同，将这些基因主要分为两大类（Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki 2007):-类是编码功能蛋白的基因，如渗透压调节物质（脯氨酸、甜菜碱、海藻糖等）合成 代谢过程中的一些酶、过氧化物酶、糖和脯氨酸转运蛋白等，这些基因的产物可以直接保护 植物组织细胞，使其免于外界胁迫环境造成的伤害（裴金玲et al. 2012)。另一类是调控蛋 白基因，包括转录因子及感受和传导胁迫信号的蛋白激酶及其参与的信号路径中的效应基 因等，这类基因主要通过复杂的表达调控去调节下游保护性功能基因表达来实现植物对逆 境的抵抗（Zhu 2002)。
[0004] 膨胀素（EXPs)是一种细胞壁松弛蛋白，其主要作用方式是疏松植物细胞壁的组 分，增加细胞壁的柔韧性（Cosgrove 2000)。编码EXPs的基因是一个多基因的家族，依据结 构分为四个亚家族：两个膨胀素亚家族a_expansin(EXPAs)和P-expansin(EXPBs);两个 类膨胀素亚家族expansin-like A(EXLA)和expansin like B(EXLB)(Kende et al.2004)。 不同家族的膨胀素蛋白之间只有20% -40%的相似性。早期的研究表明，EXP四个亚家族 中，EXPA和EXPB亚家族的多数成员在体外都具有使细胞伸长的活性，EXPA主要存在于双子 叶和非禾本科单子叶植物中；EXPB主要存在禾本科单子叶植物中（Yennawar et al.2006)。
[0005] 近年来的研究发现膨胀素除了参与植物生长发育的调控，还对植物抗非生物逆境 有重要作用。在玉米中的研究表明，干旱胁迫条件下EXPs在维持生长过程中起着重要作 用，其主要通过促使细胞壁更好的扩展来维持玉米初生根生长（Veselov et al. 2008);干 旱条件下水稻根尖和侧根的快速生长主要是由于0sEXP2基因的表达（Yang et al. 2004); Li等（Li et al.2015)发现水分胁迫能够诱导小麦TaEXPB23的上调表达，在烟草中超表 达TaEXPB23增强其根系对PEG渗透胁迫的耐受性。当植物处于逆境时，通过EXPs在细胞 壁的积累表达可能增加了细胞壁的柔韧性，在一定程度上舒缓了逆境对植物细胞的张力威 胁，增加了植物对逆境的适应性。
[0006] 植物中关于EXPA和EXPB亚家族成员的研究较多，相对于EXP来说，EXL基因同样 拥有EXP的两个结构域，但其氨基酸序列与EXPA和EXPB不同，它们缺少HFD基元，同时却含 有更多的半胱氨酸残基，这样的结构性差异又带来什么样的功能变化，植物中EXLA和EXLB 亚家族是否具有什么样的功能？我们基于棉花细胞壁重建的差减文库（Yang et al. 2008) 及 DFCI 棉花数据库（http://compbio. dfci. harvard, edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain. pi ? gudb = cotton)，通过同源序列法克隆到棉花中的GhEXLB2基因。在枯草杆菌中分离到的膨 胀素类似蛋白基因EXLX1 (BsYoaJ)与植物EXP功能相似，能与多聚糖和肽聚糖结合，并增强 纤维素酶的活性（Kerff et al.2008;Kim et al.2009);来自普城沙雷菌的膨胀素类似蛋 白基因HcEXLX2也行使相同功能（Lee et al.2010)。植物中对EXL亚家族的成员的功能研 究较少，Lee和Kende(Lee and Kende 2002)发现0S-EXPL3基因与细胞的伸长有关，并受 到GA的诱导表达。拟南芥基因组中存在三个EXLA和一个EXLB基因（http://homes, bio. 口811.6(111/61口3118；[118)，3个拟南芥4七￡乂1^基因在冷胁迫下都上调表达（1^6 6七31.2005); 最新研究发现AtEXLA2基因受盐和冷诱导表达，AtEXLA2基因的突变体对盐和ABA敏感 (Abuqamar et al.2013)。我们研究发现棉花GhEXLB2基因对盐、PEG和ABA均有响应，在棉 花中超表达GhEXLBjg够显著增强植株的抗旱性。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于从陆地棉中基于同源序列克隆到一个与细胞壁松弛相关的功 能基因，我们将这个基因命名为GhEXLB 2基因，通过转化陆地棉YZ1，获得转基因陆地棉， 以验证其在棉花抗非生物逆境中的功能，为细胞壁如何参与植物抗非生物逆境提供理论依 据，并为棉花在逆境中提高产量提供参考。
[0008] 本发明的技术方案如下所述：
[0009] (1)本发明从陆地棉中克隆一个与棉花抗逆相关的功能基因GhEXLB 2，它的核苷酸 序列是序列表SEQ NO: 1中第1-1151位碱基所示的序列，其中在该序列表中的第150-899 位所示的序列是该基因的编码区（即CDS，其编码的蛋白质序列如SEQ N0:2所示），其编码 的蛋白与烟草!'也乂1^1编码的蛋白同源性较高（见图1)，序列一致性为89%，聚类分析表 明该序列编码的蛋白属于类膨胀素家族蛋白。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信 息构建了该基因的干涉表达载体和超表达载体，超量表达的序列是序列表SEQ N0:1中的第 150-899位所示的DNA序列。
[0010] 本发明的基因（SEQ ID NO: 1)来源于棉花，其编码的蛋白质由750个碱基组成，该 蛋白质编码249个氨基酸，是序列1自5'端第150位碱基到896位碱基组成。该基因在对 逆境胁迫，激素以及棉花生长发育的影响上尚未有任何报道。通过不同的胁迫处理及激素 处理野生型棉花，检测该基因的表达情况，发现该基因受PEG模拟的干旱、盐（NaCl)，茉莉 酸（JA)和水杨酸（SA)等处理的诱导表达（见图2)。本发明分别构建了该基因的超量表 达载体PCAMBIA2300 (超量表达的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示的自5'端第150位碱基到 899位碱基）和干涉载体pHELLSGATE4 (干涉表达的DNA序列如SEQ ID NO: 1所示的自5' 端第847位碱基至970位碱基）（见图3)，将这两个载体分别转化到豫早1号陆地棉（YZ1) 中，得到该基因的超表达和干涉转基因阳性株系，检测其表达量并选取具有合适表达量的2 个超表达纯系和3个干涉纯系进行后续实验（见图4)。
[0011] 当对超表达、YZ1以及干涉转基因萌发期进行PEG (水势为-o. 7MPa)模拟干旱处理 时，发现在正常棉花无菌苗培养基上，超表达系、YZ1和干涉系长势较一致，而在PEG存在的 培养基上，超表达系植株的主根长和下胚轴长显著高于YZ1和干涉系植株（见图5A，5B和 5C)，说明该基因的超量表达可以提高棉花对PEG的抗性。测定子叶中H 202含量发现处理后 H202含量呈上升趋势，处理后超表达系H 202含量显著低于干涉系（见图，表明超表达系 清除干旱胁迫产生的活性氧能力较强。进一步对超表达株系、YZ1以及干涉株系两叶一心 期幼苗进行PEG模拟干旱处理时，发现干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-l 1和CK (YZ1)萎蔫程度较 重，而超表达系萎蔫程度较轻，转入普通Hogland营养液中，超表达系恢复较快。测定叶片 中H 202含量和MDA含量发现干涉系中H 202含量显著升高，MDA含量在超表达系和干涉系之 间无显著差异（见图6)。
[0012] 通过干旱处理沙质土培6周幼苗发现，超表达转基因植株的为萎蔫程度明显低于 对照和干涉系植株。测定各系MDA含量发现，正常情况下超表达系和干涉系及对照MDA含 量较一致，但是植株受到干旱胁迫后，干涉系和对照植株MDA含量显著高于超表达系，说明 超表达该基因能够在一定程度上减轻植株受到干旱胁迫后的膜脂过氧化程度，从而提高植 株的耐旱性（见图7)。
[0013] 本发明具体操作步骤如下：
[0014] 1)通过常规的 RACE (rapid-amplification of cDNA ends)方法扩增出 GhEXLB2 的5'和3'端，将序列拼接后得到GhEXLBj^ cDNA序列全长，根据测序的序列设计超表达和 干涉载体的引物，以棉花cDNA为模板，扩增其全长，获得DNA片段，其cDNA序列全长如SEQ ID N0:l(l-1151bp)所示，扩增该基因的引物序列如下所示：
[0015] GhEXLB25r-l :5'-AGCTGCATCTTTTGTCTGAGCCATCC-3'
[0016] Gh EXLB25r-2 :5'-GAGTTTGGGTAGTAAGCTGCTCGCGA-3'
[0017] Gh EXLB23r-l :5'-GGTGCACCAACAGCCACTATTGCTCAGAC-3'
[0018] Gh EXLB23r-2 :5'-GGATGGCTCAGACAAAAGATGCAGCT-3'
[0019] GhEXLB2-F :5'-ATGGCTCTTTCTATTCAATCCCT-3'
[0020] GhEXLB2-R :5'-CTCTGGTGCAGATATCTAGATATCA-3'
[0021] 2)将步骤1)中扩增得到的全长ORF片段及表达载体酶切位点分布设计引物进行 PCR扩增，回收PCR产物后利用利用Sac I和Pst I (购自NEB公司，美国）对回收产物和 PCAMBIA2300空载体（pCAMBIA2300空载体由CAMBIA实验室惠赠，澳大利亚）分别进行双酶 切，酶切后进行凝胶电泳，对目标片段和PCAMBIA2300空载体大片段挖胶回收，利用T4DNA 连接酶对回收的目标片段和PCAMBIA2300空载体酶切产物进行连接，再通过热激转化大肠 杆菌感受态细胞T0P10中，获得表达转化载体（p35s-GhEXLB 2，由申请人自行制 备，武汉）。同时设计引物用于非保守区干涉，通过BP-LR反应，将该片段先后连接到中间载 体pD0NR?221(由CSIRO Plant Industry惠赠，澳大利亚）和干涉载体pHELLSGATE 4(由 CSIRO Plant Industry惠赠，澳大利亚）上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞T0P10 中，获得GhEXLB2干涉表达载体