37g/L，CaCl2 ? 2H20 0.44g/L)，微量元素〇(10.8311^/1，1138036 . 211^/11111504. 4H20 22. 3mg/L, ZnS04 . 7H 20 8. 6mg/L, Na2Mo04 . 2H 20 0. 25mg/L, CuS04 . 5H 20 0. 025mg/ L，CoCl20.025mg/L)，铁盐（Na2 ? EDTA 37.3mg/L，FeS04 ? 7H2027.8mg/L)，有机成分（肌醇 100mg/L，Gly 2mg/L，VE^O. lmg/L，VB60. 5mg/L，VB50. 5mg/L)。
[0079] D?转基因植株的鉴定
[0080] (1)转基因植株阳性检测及纯系检测
[0081] 提取转基因植株幼嫩叶片的基因组DNA，DNA抽提采用天根生化科技（中国）有限 公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取（具体操作步骤见该试剂盒的说明书），以35s启 动子正向引物和目的基因（GhEXLB 2)反向引物35s-S (5 ' -CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3 '） 和 GhEXLB2-R(5' -CAAAGAAATGAATGACTCTGGTGC-3'）进行 PCR 检测是否有相应 T-DNA 插入。 PCR 反应条件为：94°C预变性 5min ;94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 30sec，28 个循环；72°C延 伸 5min〇
[0082] 将收取的代的种子剥去种皮，用0. 1%升汞溶液杀菌10_12min，期间不断摇动， 用无菌水冲洗3次，将种子置于棉花无菌苗培养基（含100mg/L卡那霉素）表面。30°C暗 培养1. 5d后扶苗，转移至光照室（3000LuX，15h/9h)培养，5-6d观察是否有抗性分离（长侧 根植株为阳性转基因植株）。之后每一代单株留自交种进行筛选直至不发生抗性分离的即 为转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。
[0083] (2)转基因RNA水平检测
[0084] 取T3代转基因棉花植株主茎倒一叶提取RNA，RNA的抽提用Invitrogen公司的 Trizol抽提试剂盒（具体操作步骤见该试剂盒的说明书）。
[0085] cDNA 的合成是以 g 总 RNA 为模版，与 liil 500ii g/ml oligo_dT(15)弓丨物（购 自Promega公司），DEPC-water混合，总体积为14 ill;然后70°C变性5min冰上骤冷；再加A10 U 1 5 u 1 RT buffer, 1. 25 u 1 lOmM dNTP, 1. 75 u 1 DEPC-water, 1 u 1 RNasin? Ribonuclease Inhibitor (购自 Promega 公司，美国），和 lul SuperscriptIII反转录酶 (购自Invitrogen公司，美国）的混合液；42°C温浴lh合成第一链；反应结束后70°C处理 15min使SuperscriptIII反转录酶失活。每份cDNA稀释到200 y 1后于_20°C保存待用。以上 述反转录合成的cDNA为模板，用引物GhEXLB2-RTS和GhEXLB 2-RTA进行特异PCR扩增（扩增 产物长 347bp)。同时用 GhUbiquitin7_F 和 GhUbiquitin7_R对棉花 GhUbiquitin7(GenBank 登陆号：DQ116441)基因做特异扩增（扩增产物长198bp)，作为内参对照进行相对定量 分析。PCR反应体系的总体积为20iU，cDNA模板lul、lXTaq酶反应缓冲液2iil、25mM MgCL 21.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM 引物 0.2ul、0.3 单位 Taq 酶 0.2ii 1，加 ddH20 至 20ii 1。 反应程序为：94°C变性 5min，94°C 30s、53°C 30s、72°C 30s 31 个循环，72°C延伸 5min。获得 的PCR产物取10 yl以0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0086] 结果表明：本发明克隆的GhEXLB2基因在不同转基因株系中的表达量有差异。后 续的功能验证研究中选取具有合适表达量的超量表达系mB2-2和mB2-12以及干涉系iB-4、 iB-6和iB-11来进行分析（见图4)。
[0087] 所用引物为：
[0088] GhEXLB2-RTS :5'-CTGACAACAGAGGCAACGACTTTC-3'
[0089] GhEXLB2-RTA :5'-GCTGCTGATACATCTCCACCATTT-3'
[0090] GhUbiquitin7-F :5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3'
[0091] GhUbiquitin7-R :5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3'
[0092] 实施例4:利用转基因棉花对GhEXLB2基因进行功能验证
[0093] 具体步骤如下：
[0094] A.萌发期PEG处理及相关生理指标测定
[0095] 将超表达mB2-2、mB2-12和干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-ll及对照YZ1T 3代种子 用升汞杀菌清洗后置于不含PEG的无菌苗培养基和含PEG(-〇. 7MPa)的无菌苗培养基 上。含PEG的无菌苗培养基的配制参照Verslues et at. ,2006, Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status. The Plant Journal 45:523-539 (Verslues et al.2006)报 道的方法，在28°C暗培养观察种子萌发。在不含PEG的无菌苗培养基上，各个转基因株系 的萌发一致，在含PEG(-〇. 7MPa)的无菌苗培养基上，干涉系萌发慢于超表达两个株系。9d 后，不含PEG的无菌苗培养基上各个转基因株系的主根和下胚轴长无明显差异，在含有PEG 的无菌苗培养基上棉花主根下胚轴生长受到抑制，但超表达株系的主根根长和下胚轴长显 著高于对照YZ1和干涉系。这说明本发明克隆的基因的超表达可以提高转基因株系对PEG 的抗性，检测结果见图5A。取子叶进行H 202含量测定，发现PEG处理后H 202含量呈上升趋 势，且处理后超表达系H202含量显著低于干涉系（见图，表明超表达系清除干旱胁迫产 生的活性氧能力较强。
[0096] B.两叶一心期幼苗水培PEG处理实验
[0097] 将超表达mB2-2、mB2-12和干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-ll及对照YZ1T 3R种子用 清水萌发后，幼苗在常规的Hoagland营养液中水培至两叶期，之后用13%浓度的PEG6000 溶液进行处理，处理7天后发现干涉系iB2-4、iB2-6、iB2-ll株系和对照品种的萎蔫程度 较重，而超表达两个株系萎蔫程度较轻，转入正常培养液（Hoagland营养液）中进行缓苗处 理，发现超表达两个株系恢复较快（结果见图6A)，表明超表达该基因可以增强转基因棉花 对干旱的耐受性。进一步用PEG处理5天，取叶片测定膜脂过氧化程度（MDA含量）及活性 氧（H 202含量），发现干涉系中H 202含量显著升高，MDA含量在超表达系和干涉系之间无显 著差异（见图6B和图6C)。
[0098] C?植株土培干旱处理及复水实验
[0099] 将转基因棉花和野生型陆地棉YZ1种子用浓硫酸脱绒晒干后温水浸泡6h后催芽， 播种于均匀的沙质细土（每盆质量相等），放入温室培养，6周后进行水饱和试验，测定含 水量后停止浇水进行干旱处理，观察植株的萎蔫程度。7天后观察到超表达系萎蔫较轻，而 干涉系萎蔫严重，结果见图7A，并测定了叶片膜脂过氧化程度（MDA含量）发现正常生长条 件下，各个系之间MDA含量并无明显差别，而在干旱情况下，MDA含量显著降低，且超表达系 MDA含量显著低于对照野生型YZ1和干涉系（结果见图7B)，说明本发明克隆的基因能够提 高植株的耐旱性。
[0100] D.GhEXLB2转基因植株和YZ1植株PEG或干旱处理后生理指标的测定
[0101] 1)过氧化氢定量测定。
[0102] 在酸性环境中，过氧化氢可将Fe2+离子氧化成Fe 3+离子，Fe 2+离子再与染料分子结 合形成Fe3+-染料复合物，该复合物在560nm (或595nm)处有最大吸收波长，且吸光值与过 氧化氢的浓度成正比。
[0103] 将转基因棉花子叶或叶片样品用液氮研磨，取0. lg左右的样品至2ml的离心管 中，立即加入1. 8ml预冷的80%丙酮，振荡20分钟，4°C，13000rpm/min离心15分钟，吸取 上清液转入新的离心管用于后续实验。按照试剂盒H 202quantification kit(购自Sangon Biotech公司，上海）提供的方法对转基因棉花样品进行过氧化氢定量测定。对不含PEG和 含PEG的无菌苗上萌发9天后的各个转基因及对照（YZ1)株系棉花子叶和水培各个转基因 及对照（YZ1)株系幼苗两叶期PEG处理5天后叶片双氧水含量测定发现，PEG能够提高植株 体内的双氧水含量，即打破了细胞的氧化还原稳态，但是超表达系的双氧水升高明显低于 对照和干涉系，说明在棉花中超表达GhEXLB 2基因有助于清除干旱胁迫导致的活性氧积累， 测定结果见图和图6B。
[0104] 2)丙二醛（MDA)含量的测定。
[0105] 植物器官衰老或在非生物逆境条件下，膜脂发生过氧化作用，丙二醛是其中的产 物之一，通常利用它作为膜脂过氧化指标。在PEG萌发处理9天后和干旱处理7天后取样进 行MDA含量测定。称取0. lg左右的叶片，剪刀剪碎后加10%三氯乙酸（TCA)2mL，用预冷的 研钵置于冰上研磨至匀浆状，倒入2mL离心管中。在12000rpm下冷冻（4°C )离心10min，取 上清液0.81^至新的21^的离心管中，向其中加入0.6%硫代巴比妥酸〇^4)0.811^，混合后 在100°C沸水中煮15min后在冰上立即冷却后离心取上清。用分光光度计分别测定上清液 在450nm、532nm和600nm处的吸光度值。并按公式算出MDA浓度，再算出单位鲜重组织中 的 MDA 含量（ii mol/g)。结果计算按公式：C/ ii mol/L = 6. 45 (A532-A600) * (V1*V) AV2*W)。 其中VI为反应液总量，V2为反应中提取液量，V为提取液总量，W为样品质量。最终结果发 现PEG处理的样品导致膜脂过氧化，超表达系的膜脂过氧化程度明显低于干涉系和对照， 结果见图7B。
[0106] 本实施例中用到的棉花无菌苗培养基配方为：0. 02M KN03,0. 02M NH3N03，1.5mM MgS04,1. 2mM KH2P04,3mM CaCl2,15g/L 葡萄糖；pH6. 2, phgtagel 2. 5g/L。
[0107] 特别说明：本专利申请获得中国〃国家自然科学基金青年基金〃项目资助。
[0108] 参考文献
[0109] Abuqamar S, Ajeb S, Sham A, Enan MR,