一种棉花抗旱基因GhSNAC1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因工程技术领域，具体涉及一种棉花抗旱基因 GhSNACl及其应 用。
【背景技术】
[0002] 干旱严重影响作物的生长发育，在诸多自然灾害中，干旱造成的损失最为严重。我 国二分之一的国土面积为干旱和半干旱地区，即使非干旱地区，也会时常遭受干旱危害。尤 其近些年来，随着城镇化的不断推进和人口的增加，耕地面积不断减少，淡水资源也日益匮 乏，如何在干旱条件下提高植物水分利用效率，最大限度的保证作物生产，成为农业生产中 亟需解决的重大课题。已有研宄发现，植物在适应干旱胁迫的过程中，可以通过调节自身形 态、生理或代谢变化来抵御干旱。目前，在拟南芥和水稻等模式植物中，已经克隆了众多响 应干旱胁迫的功能基因，其中转录因子由于能够调节多个胁迫响应功能基因的表达而备受 关注。
[0003] 我国是全球最大的棉花生产国和消费国，棉花行业在国民经济和棉区的经济 发展中具有举足轻重的作用。但是，我国棉区也是主要的粮食生产区，粮棉争地矛盾突 出。为了保证棉花的有效供给，我们棉花正在向盐碱地、旱地和瘠薄地发展。因此，提高 棉花的抗旱耐盐能力具有更加重要的现实意义。棉花NAC转录因子研宄起步较晚，且相 关研宄主要集中在我国科学家中。2009年，南京农业大学的郭旺珍教授课题组利用生物 信息学和RT-PCR等方法率先从陆地棉中克隆了 6个NAC基因，命名为GhNAC I -GhNAC6。 GhNACl-GhNAC6主要在叶片中表达，GhNAC2和GhNAC3受低温诱导表达，GhNAC5受低温和干 旱诱导表达，GhNAC4和GhNAC6受低温、干旱和盐胁迫诱导表达。2013年华中师范大学李学 宝教授课题组克隆了 7个逆境相关NAC基因，命名为GhNAC7-GhNAC13, qPCR分析发现这7 个GhNAC基因主要在根中表达，并受ABA和高盐诱导表达。2013年中国农业科学院棉花研 宄所喻树迅院士课题组克隆了 10个NAC基因，命名为GhNAC8-GhNAC17, qPCR分析发现它们 受叶片衰老、干旱、高盐、低温、高温、ABA和乙烯等诱导表达。2014年喻树迅院士课题组利 用生物信息学和RT-PCR方法从陆地棉中鉴定了 61个NAC基因，命名为GhNAC18-GhNAC78， 发现绝大多数GhNAC基因的表达具有组织特异性，部分GhNAC基因的表达受乙烯、ABA、GA、 干旱、盐渍和衰老等诱导表达。截止目前，我国科学家们已经克隆了近80个陆地棉NAC基 因，并分析了其在多种组织、多种激素和逆境处理下的表达变化，但具体功能研宄尚未见到 报道。我们以NAC结构域的保守序列为探针，搜索棉花EST和nucleotide序列，对得到的 匹配序列进行拼接和进化分析，挖掘逆境相关NAC序列，然后利用RT-PCR克隆棉花逆境相 关NAC基因，并分析其在干旱、盐害、低温和黄萎病胁迫下的表达变化，筛选胁迫诱导表达 的NAC基因，构建过量表达载体和抑制表达载体，通过转化烟草和棉花研宄其在逆境胁迫 用的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种棉花抗旱基因 GhSNACl，该基因过量表达株的保水能 力增强，同时转基因植株的根系的长度得到了增长，说明转基因烟草在干旱胁迫下抗逆性 增强。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作 物抗旱性状。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一种棉花抗旱基因 GhSNACl，其核 苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
[0007] 本发明还提供了所述的棉花抗旱基因 GhSNACl编码的蛋白质，其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 2。
[0008] 进一步，本发明还包括含有所述抗旱基因 GhSNACl的表达载体 pCAMBIA3301-GhSNACl，所述的表达载体通过pCAMBIA3301构建，构建过程中的引物分别 为：SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
[0009] 本发明提供了所述的抗旱基因 GhSNACl和表达载体pCAMBIA 3301-GhSNACl在培 育GhSNACl基因过表达的转基因植物中的应用。
[0010] 所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，其中较优选为烟草或棉花。
[0011] 本发明的有益效果为：将实验证明，在模拟干旱（18%的PEG6000)胁迫2h后， GhSNACl基因的表达量显著提高，预示其可能在抵御干旱胁迫中起作用。进一步通过构建表 达载体PCAMBIA3301-G hSNACl，并转化农杆菌LBA4404,结果表明过量表达GhSNACl基因的 转基因植株在干旱胁迫下抗逆性增强。 图1是GhSNACl基因的结构； 图2是不同胁迫处理下GhSNACl基因的表达分析； 图3是不同干旱胁迫时间下GhSNACl基因的表达变化； 图4是转基因植株的PCR检测； 图5是转基因植株的qPCR分析； 图6是野生型和转GhSNACl基因烟草的离体叶片失水率比较； 图7是模拟干旱条件下转基因烟草的根系生长比较； 图8是干旱条件下转GhSNACl基因烟草的表型变化。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0013] 实施例1 GhSNACl的克隆
[0014] 1.1植物材料
[0015] 鲁棉研32是由鲁1565系（石368X澳A93-14组合后代选系）与鲁棉研18号 杂交后经系统选育而成的，具有抗枯萎病、耐黄萎病和耐盐碱等特点。棉籽用1%的次氯酸 钠表面消毒15min，无菌水充分冲洗，于蒸馏水中浸泡12h，使种子充分吸水，吸胀后的种子 铺在洗水棉中于黑暗、28°C条件下发芽，发芽后转移至Hoagland营养液中生长，待幼苗长 出2-3片真叶时分别进行以下处理：CK(Hoagland培养液培养）、PEG(10% PEG6000溶液）、 Salt(150mm〇l/L Na Cl溶液）、Wilt (黄萎病菌液侵染，采用具有高致病力的落叶型黄萎病 菌系VD8,孢子悬浮液浓度约I X IO7个/mL)和LT (4°C低温处理），处理时间均为2h，剪取 根系用作实验材料，液氮速冻，保存于_80°C冰箱备用。
[0016] 1. 2棉花根系RNA提取和GhSNACl基因克隆
[0017] 根系RNA提取采用改进的CTAB法，cDNA的合成按照TaKaRa公司反转录合成试剂 盒说明书步骤进行。GhSNACl基因克隆引物为GhSNAClF(5' -ATGGTAGTCCCGGAAACTGAT-3'） 和 GhSNAClR(5, -AATTCCATACCTCTTTCCCCC-3'）。RT-PCR 扩增参照 TaKaRa 公司试剂盒说明 书步骤进行。获得的PCR产物克隆到T载体中，阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有 限公司测序。测序结果经BLAST检索序列数据库，确定所克隆序列为棉花NAC类基因编码 序列。
[0018] 二倍体雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii)基因组测序已经完成，Jin等（2014) 利用生物信息学方法从G.raimondii基因组中预测了 266个NAC基因 （PlantTFDB 3.0， http://planttfdb. cbi. pku. edu. cn/index. php)。我们发现 Gorai. 009G433200. 1 基因 与抗旱NAC转录因子ANAC072、ANACO19、ANAC055和SNACl的序列一致性分别高达63 % (E 彡 8e-142)、58% (E 彡 le-130)、68% (E 彡 6e-128)和 57% (E 彡 5e-85)，因而推测其可 能在植物响应干旱胁迫中起作用。
[0019] 以Gorai. 009G433200. 1基因序列为模板，我们利用基因特异引物GhSNAClF和 GhSNAClR，在鲁棉研32号克隆了 一个与NAC类基因同源的cDNA序列，命名为GhSNACl，该序 列长度为l〇75bp，具有单一的完整开放阅读框，推测编码蛋白含有342个氨基酸，分子量为 38. 3kDa，等电点为 8. 85。InterProScan 5(http://www. expasy.org/)软件分析发现在第 14-139氨基酸之间存在NAC保守结构域（图1)。
[0020] 实施例2 GhSNACl基因的表达分析
[0021] 用qPCR分析GhSNACl基因的表达情况。qPCR按照Takara公司S YBR? Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行。上游引物为5 ' -GTTCCCAGTGGACAAACTCAGAC-3 '，下游引 物为 5' -CTTAAACACAAACCCACCCGAC-3'。以棉花泛素蛋白（Ubiquitin)基因 UBQ7 (Acc. No. AY-189972)为内参基因，反应体系为25 μ L。qPCR共进行40个循环：95°C 30s，95°C 5s， 60