朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一条适于朱砂叶螨取食棉花的丝氨酸蛋白酶 基因的全长克隆及应用。
【背景技术】
[0002] 朱砂叶螨别名棉红蜘蛛、棉叶螨、红叶螨，在世界各地均有分布，在我国华北、华 东、华中、华南、东北等地区均有发生。该螨是一种多食性的农业害螨，主要危害棉花、豆类、 茄科类以及玉米等多种作物。朱砂叶螨个体非常小，肉眼很难发现；具有极强的繁殖能力， 在适宜的生长环境下产卵量多；世代周期短，在短时间内就能迅速形成一定数量的种群。朱 砂叶螨主要在植物叶背及叶脉两侧聚集，以口针刺吸植株汁液，并结成丝网，使受害叶片逐 渐褪绿，形成无数白色斑点，对植物组织造成严重的伤害。在田间，朱砂叶螨危害严重时可 导致植株叶片完全干枯脱落，甚至成片死亡，造成严重的经济损失。自美国转基因抗虫Bt 棉开始在我国推广种植以来，Bt棉很好地控制了棉铃虫的危害，使棉田的农药使用量降低 约65%。但随着Bt棉在我国大面积的推广种植，一些次生性的害虫如棉叶螨，棉蚜等种群 数量逐年上升，逐步成为棉花种植过程中的重要害虫。
[0003] 消化酶作为昆虫和螨类消化食物获取营养物质的必须酶，可分为蛋白酶类、淀粉 酶类、转化酶类和海藻糖酶类等。丝氨酸蛋白酶作为蛋白酶类重要代表之一，该酶是大多数 昆虫和螨类消化系统内重要的消化酶。丝氨酸蛋白酶在昆虫和螨体内是一个大的基因家 族，主要功能有食物代谢、免疫防御、酶源激活等。在丝氨酸蛋白酶众多功能中，食物代谢功 能作为该类酶的一个重要的功能而被广泛的研宄。该功能可以将食物中蛋白质类营养物质 消化和分解成小分子物质，从而为昆虫和螨类提供营养物质。朱砂叶螨体内丰富的消化酶 为朱砂叶螨的生长发育、代谢、生殖提供食物代谢所需的能量，同时也为朱砂叶螨取食和消 化不同寄主植物起到了十分重要的作用。正是由于消化酶强大的作用，使得朱砂叶螨能够 将不同的寄主植物成功的消化代谢成能量物质来满足自身生长发育需求。但由于朱砂叶螨 个体小，肉眼很难发现，对其体内消化酶的研宄也相对较少。因此，研宄朱砂叶螨体内的重 要的消化酶，对明白朱砂叶螨取食不同寄主植物的机制和为朱砂叶螨的防治等都具有十分 重要的意义。
[0004] 本发明通过对朱砂叶螨取食豇豆苗和棉苗不同寄主植物后进行表达谱测序，根据 表达谱测序结果，从获得的7条差异表达的丝氨酸蛋白酶中，筛选出了一条适于朱砂叶螨 取食棉花的重要丝氨酸蛋白基因。朱砂叶螨取食棉花苗后该基因上调倍数超过6倍，并且 表达丰度（RPKM)超过107。丝氨酸蛋白酶作为叶螨体内的一类重要的超家族消化酶，该酶 对朱砂叶螨寄主食物的代谢消化起到非常大的作用。棉花植株相比于豇豆具有更多的纤 维，朱砂叶螨在取食棉叶后对其叶片组织的消化代谢更加困难，所以需要调整体内的消化 酶表达水平来适应寄主差异。通过朱砂叶螨取食豇豆苗和棉苗后数字基因表达谱测序，根 据表达谱结果获得丝氨酸蛋白酶基因的超量表达，说明该基因对于朱砂叶螨取食适应棉花 植株十分重要。本发明通过克隆测序获得了该基因的全长序列，并利用荧光定量PCR验证 朱砂叶螨取食豇豆和取食棉花后该基因的表达情况。定量结果显示，朱砂叶螨取食棉叶后 相对取食豇豆叶后该丝氨酸蛋白酶基因同样上调表达。该基因的发现对于研宄朱砂叶螨取 食不同寄主植物提供了很好的基因资源，同时该基因全长的获得也对进一步探宄该基因具 体的代谢功能提供了很好的基础。今后的研宄可以在解析该基因分子生物学特性的基础 上，结合蛋白纯化、酶学特性研宄来开发专一性的蛋白酶抑制剂，为朱砂叶螨在田间危害提 供新的控制方法和思路，缓解目前化学防治带来的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是筛选获得一条适于朱砂叶螨取食棉花的丝氨酸蛋白酶基因，并克隆 其全长序列，定量验证朱砂叶螨取食棉花后该基因的表达情况。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种朱砂叶螨取食棉花的消化酶基 因，该消化酶基因核苷酸序列如SEQIDNO: 1。
[0007] 进一步的，该消化酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDN0:2。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因的克隆方法，所 述克隆该基因所用引物序列为TcS-Forward:ATGAGATTCTTTATGITGACCGC，TcS-Reverse:CTAATTTTGCCAGCAAGCGTTGG。
[0009] 本发明的第三目的是提供一种朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因核苷酸序列或编 码的氨基酸序列在朱砂叶螨防治中的运用。
[0010] 本发明的第四目的是提供一种朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因核苷酸序列或编 码的氨基酸序列在防止朱砂叶螨转基因棉培养中的应用。
[0011] 本发明的有益技术效果是：本发明技术提供了一种高效、方便的获取朱砂叶螨取 食棉花的消化酶基因的全长序列的方法，对明白朱砂叶螨取食不同寄主植物的机制和为朱 砂叶螨的防治等都具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0012] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0013] 图1本发明总RNA提取电泳图；
[0014] 图2 :朱砂叶螨取食不同寄主豇豆（V-TC)和棉花（G-TC)后丝氨酸蛋白酶基因基 因的表达情况。
【具体实施方式】
[0015] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0016] 实施例
[0017] 下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。
[0018] 下述的实施例中所使用的实验耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。
[0019] 下述的实施例中所使用的朱砂叶螨为西南大学植物保护学院农药毒理及科学应 用研宄室所特有的敏感品系（室内用豇豆苗作为供试寄主饲养超过15年；饲养条件为温 度：26 ± 1 °C，相对湿度：35 % -55 %，光照周期14:10 (L:D))。取食棉花的朱砂叶螨由取食豇 豆苗的朱砂叶螨转移寄主所得，饲养条件一致。
[0020] 1、利用表达谱测序比较朱砂叶螨取食豇豆和取食棉花后基因的变化情况（基因 的筛选）
[0021] 本发明首先将室内饲养的取食豇豆苗的朱砂叶螨（该螨在实验室饲养已超过15 年，期间不接触任何药剂）转移到室内种植的棉苗上。取食棉苗50天后，分别收集寄主为 豇豆苗（V-TC)和棉苗（G-TC)的朱砂叶螨用于总RNA的提取。然后委托华大基因对提取的 V-TC和G-TC总RNA进行表达谱测序。最后通过表达谱数据分析，相对于V-TC，在G-TC中 发现了超过500条差异表达的基因。同时将获得的差异基因进行比对及功能注释，并按照 不同功能进行基因分类。本次表达谱测序一共获得了 7条具有差异表达的丝氨酸蛋白酶和 丝氨酸蛋白酶同系物，最终从这7条中筛选获得了一条上调倍数最高（超过6倍）和表达 丰度（RPKM)超过107的丝氨酸蛋白酶基因l(Unigene9176_A)。
[0022] 2、丝氨酸蛋白酶基因的全长克隆
[0023] (1)总RNA的提取
[0024] 采用Trizol法提取朱砂叶螨的总RNA(操作步骤完全按照Trizol提取总RNA的 说明书来进行），电泳结果如图1所示。
[0025] (2)cDNA第一条链的合成。
[0026]操作步骤完全按照TAKARA公司PrimeScriptII1stStrandcDNASynthesis Kit(D6210A)说明书进行。
[0027] (3)基因全长PCR扩增
[0028]Primer5软件设计特异引物序列：
[0029]TcS-Forward：ATGAGATTCTTTATGTTGACCGC
[0030]TcS-Reverse：CTAATTTTGCCAGCAAGCGTTGG
[0031] 聚合酶链式反应的试剂组成如下：
[0032]
【主权项】
1. 朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因，其特征在于：该消化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO: 1〇
2. 根据权利要求1所述朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因，其特征在于：该消化酶基因 编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:2。
3. 根据权利要求1或2所述朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因的克隆方法，其特征在于， 所述克隆该基因所用引物序列为 TcS-Forward :ATGAGATTCTTTATGTTGACCGC，TcS-Reverse : CTAATTTTGCCAGCAAGCGTTGG。
4. 根据权利要求1或2该基因核苷酸序列或编码的氨基酸序列在朱砂叶螨防治中的运 用。
5. 根据权利要求1或2该基因核苷酸序列或编码的氨基酸序列在防止朱砂叶螨转基因 棉培养中的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一条适于朱砂叶螨取食棉花的丝氨酸蛋白酶基因的全长克隆及应用，该消化酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1，该消化酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2。本发明技术提供了一种高效、方便的获取朱砂叶螨取食棉花的消化酶基因的全长序列的方法，对明白朱砂叶螨取食不同寄主植物的机制和为朱砂叶螨的防治等都具有十分重要的意义。
【IPC分类】C12N15-57, C12N9-64, C12N15-10
【公开号】CN104651384
【申请号】CN201510043681
【发明人】何林, 肖月华, 张永军, 宋长贵, 卢文才
【申请人】西南大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月28日