与棉花纤维强度主效基因连锁的ssr标记的制作方法

专利名称：与棉花纤维强度主效基因连锁的ssr标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及到来自优异纤维品质种质材料0-153与棉花高强纤维主效基因连锁的SSR (Simple Sequence Repeats,简单序列重复)分子标记，这些标记是通过多环境下的纤维 品质表现与群体分子标记遗传图谱结合分析得到的，利用这些与纤维强度紧密连锁的分 子标记进行辅助选择可以提高棉花纤维品质育种效率，属于生物技术应用领域。
背景技术：
棉纤维是棉花最为重要的经济性状，也是重要的纺织工业原料。随着纺织工业的快速 发展和人民生活水平的不断提高，对棉花纤维品质的要求也越来越高。我国棉花育种工 作者在上世纪80年代前主要集中在产量的提高上，纤维品质的提高没有得到足够的重 视，使得我国的棉花品种大多表现为产量高，品质差。杨伟华等对近20年来我国自育棉 花品种的纤维品质的分析得出，我国自育陆地棉品种的纤维主体长度或2. 5%跨距长度 主要集中在27 30mm,断裂比强度集中在17 23cN/tex，马克隆值集中在3. 7 4.9。 与美国相比，纤维长度上有优势，但纤维比强度略逊于美国(杨伟华，项时康，唐淑荣 等.2001， 20年来我国自育棉花品种纤维品质分析.棉花学报.13(6):377-384) 。 2001-2005 年农业部对我国主产棉省主栽棉花品种纤维的抽査结果表明纤维长度主要分布在 28-29mm，比强度处于中等偏上水平，主要分布在27-29 cN/tex，目前我国棉花纤维质量 可以满足纺织工业中、低档棉纱的要求(唐淑荣，孟俊婷，褚平等，2007,我国棉花纤 维品质现状分析，江西农业学报，19(7):8-10)。虽然纤维长度及比强度等纤维品质性状 有所提高，但可纺高支纱的品种依然缺乏。近两年来，审定了一些长度在31mm以上， 比强度在30cN/tex以上的陆地棉品种，但品质单一，棉纤维品质指标间的匹配还不理想， 大部分陆地棉栽培品种的纤维比强度仍偏低。因此，需要加速提高我国棉花品种的纤维 品质，尤其是纤维比强度。
采用传统的育种方法提高陆地棉的纤维比强度，首先要通过陆地棉和海岛棉或亚洲棉 等杂交，通过多代的回交，获得具有高强纤维基因渐渗的种质材料，与现有的陆地棉栽 培品种杂交，通过多代的回交及自交选择，以打破纤维品质性状与产量性状间的负相关。 传统的育种方法主要是根据表型选择，需要足够大的选择群体，每个选择世代都要对纤 维品质进行测定，成本较高且工作量大，而且纤维品质性状受环境影响较大，使得纤维品质育种进展缓慢。
分子标记技术可以在较短的时间内进行大量的个体或家系检测，由于分子标记的基因 型是可以识别的，如果目标性状与某个分子标记紧密连锁，就可以利用分子标记对目标 性状进行选择，可以大大提高检测及选择的效率。目前国内外对分子标记筛选做了大量 的工作，利用不同的群体进行连锁图谱的构建和重要纤维品质性状的QTL筛选，得到了 大量的与纤维品质相关的QTL。在利用F2及Bd等分离群体上，Shappley等(1998) 、 Jiang 等(1998) 、 Ulloa等(2000)利用RFLP标记共检测到了40多个与纤维品质有关的显著性 QTL;袁有禄等(2000， 2001)及Zhang等(2003)利用一个异常棉高强纤维渐渗系7235 和陆地棉遗传标准系TM-1为亲本构建了F2、F2,3分离群体，鉴定了 一个纤维强度主效QTL， 可解释30%以上的表型变异；Kohel等(2001)利用海陆种间F2群体鉴定了 13个与纤维品 质性状有关的QTLs，由这些QTLs解释单个性状的表型变异在30-60y。之间，其中有4个纤 维强度性状的QTLs; Paterson等(2003)利用一个种间F2:3群体获得了68个与纤维品质性 状有关的QTLs，其中纤维强度性状21个；Wu等(2003)利用陆海杂种F2群体检测到2 个强度QTLs ，解释表型变异的13.86%和34.15%; Mei (2004)利用海陆种间F2群体及RFLP 、 AFLP和SSR三种标记，定位了5个纤维品质的QTLs，均解释较大的表型变异。沈新莲等 (2004)利用复合区间作图法共筛选到38个与纤维品质有关的QTLs，其中10个为纤维强 度性状QTLs; Lacape等(2005)利用回交群体筛选到了 11个纤维品质性状的80个QTLs， 其中纤维强度12个QTLs，在一个或多个世代中都能检测到。Lin等(2005)利用陆海F2群体 采用SRAP、 SSR、 RAPD三种标记检测到13个与纤维品质相关的QTLs，其中纤维强度2 个，能解释21.18%~21.66%的表型变异；Zhang等(2005)利用陆地棉种内F2和F2:3群体鉴 定了12个纤维品质性状相关的QTLs，其中纤维强度3个；He等(2007)采用SSR、 SRAP、 RAPD、 REMAP四种不同标记在陆海F2:3群体中发现了 16个纤维品质性状的QTLs，其中 纤维强度的3个，能解释15.26-37.12%的表型变异；Qin等(2008)利用四个陆地棉亲本构 建的F2群体定位了20个纤维品质性状的QTL，其中9个为显著性QTL， ll个为可能存在的 QTL，共解释表型变异的5.1%-25.8%，有5个为纤维强度性状的QTLs。
利用RIL群体中，James等(2006)检测到了25个与棉花纤维品质相关的QTL，其中控 制纤维强度的6个，可解释5.4-6.5%的表型变异；Wang等(2006)利用SSR标记检测到了 48个QTLs，其中4个纤维强度性状的QTLs; Shen等(2007)利用陆地棉种内RIL群体筛 选到27个纤维品质相关的QTLs，其中纤维强度性状5个，l个能在不冋的环境下表达，能 解释表型变异的10.52%; Wu等(2009)利用陆地棉种内RIL群体，共定位34个纤维品质 性状的QTL，其中6个纤维强度QTLs; Zhang等(2009)利用陆地棉种内的RIL群体检测到 13个纤维品质性状的QTL,其中2个纤维强度QTLs能在两个环境下检测到，解释表型变
4异的10.2%~31.8%。
这些研究结果为纤维品质性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础。但是，前人 的研究中较多的是利用分离群体，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性 和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上 没有考虑和育种材料相结合，还很难应用到育种中。

发明内容
本发明通过筛选来自优异纤维品质材料中与棉花高强纤维主效基因连锁的SSR (Simple Sequence Repeats,简单序列重复)分子标记，利用这些与纤维强度紧密连锁的 分子标记进行DNA水平上的早期辅助选择可以提高棉花纤维强度的选择效率。
本发明提供的技术方案是来自优质纤维品质材料0-153的棉花纤维强度主效基因 位点FS1、 FS2、 FS4、 FS5相关的分子标记，其中，FS1、 FS2位于染色体c25上，FS3、 FS4位于染色体c7上，FS5位于染色体c13上，与FS1连锁的标记为NAU211933o;与 FS2连锁的标记为BNL2572125 、 BNL106411Q、 DPL087421G;与FS4连锁的标记为 NAU104 825Q、 NAU26 2 7350;与FS5连锁的标记为BNL1421細、NAU27 3 0450。
一种与棉花纤维强度主效基因位点连锁的分子标记，其特征在于是通过以下方法获 得的
1)利用大田推广的陆地棉栽培品种中棉所41选系sGK9708和具有亚洲棉高强纤维 基因渐渗的陆地棉优质品系0-153为亲本构建F2、 F2, 3群体；
2) F2: 3群体家系内每世代自交，直至F2,6代，在F2"代进行一次家系内单株选择， 用以家系提纯，再种植两代至Fsj;
3) 选用已公布的5742对SSR引物进行亲本间多态性筛选，分子标记初步筛选结果 表明有191对SSR引物在亲本间有差异，用多态性引物对196个F。8家系群体进行扩增， 获得了 217个多态性位点，构建RIL群体连锁图谱；
4) 进行多环境下的纤维强度主效QTL筛选，共筛选出6个来自0-153的棉花纤维 强度性状的QTLs，其中5个为多环境稳定的QTLs，即FS1、 FS2位于染色体c25上， FS3、 FS4位于染色体c7上，FS5位于染色体c13上，与FS1连锁的标记为NAU21 19330; 与FS2连锁的标记为BNL2572125、 BNL1064Uo、 DPL087421o;与FS4连锁的标记为 NAU104 8250、 NAU2627350;与FS5连锁的标记为BNL1421扁、NAU27 3 0450。
上述第3)步选用已公布的5742对SSR引物进行亲本间多态性筛选，PCR反应体系 为lO(xl，其中超纯水6.40^1， lOxBuffer l.Opl， 10mM dNTPs 0.50(^1， 10pM正向引物0.50|il， lO(xM反向引物0.50|il， 30ng/pl模板DNA1.0|al ， 5U/|alTaq DNA聚合酶0.10^1， PCR反应程序为94。C预变性45s; 94。C变性30s， 57。C退火45s， 72。C延伸lmin, 29个 循环；94。C变性60s, 57。C退火45s， 72。C延伸2min， PCR反应在TGRADIENT及PTC-200
上进行，扩增产物在8%的聚丙烯凝胶中进行电泳，记录结果。
本发明的具有如下有益效果
本发明所涉及的与棉花纤维强度主效基因有关的4个位点(FS1、 FS2、 FS4、 FS5)， 增效基因均来自优异纤维亲本材料0-153，而且在所检测的多个环境中效应稳定，可以用 于棉花纤维强度的分子标记辅助选择。FS1在四个环境下解释表型变异均较大，分别为 19.12%、 14.25%、 15.38°/。、 18.43%，加性效应也较大，分别为1.0510、 0.8067、 0.9823、 1.1026 cN/tex; FS2在四环境下解释表型变异也较大，分别为21.36%、 18.05%、 14.69%、 17.47%,加性效应也较大，分别为1.1216、 0，3、 0.9646、 1.0785 cN/tex; FS4在四个 环境下分别解释表型变异的2.79%、4.87%、6.54%、5.66%，加性效应分别为0.4037、0.4737、 0.6341、 0.5982 cN/tex; FS5在两个环境下检测到，分别解释表型变异的6.87%、 3.80%， 加性效应分别为0.5338、 0.4741 cN/tex。


图1为本发明RIL群体部分分子标记连锁图谱。
其中，FS1位于染色体c25的标记区间BNL380619()-CM067145内，与之相连锁的标记 为BNL3806190、 TMK19180、 BNL3 8 0 6230、 NAU105 4220、 N AU21 19330、 NAU1054320、 CM067145; FS2位于染色体c25的标记区间BNL2572125-BNL144024o内，与之想连锁的标 记为BNL2572125、 JESPR215140、 BNL1064110、 DPL0874210、 BNL1440240; FS3位于染 色体c7的标记区间NAU10 8 5 26(rTMB161818()内，与之相连锁的标记为NAU108 5260、 TMB161818o; FS4位于标记区间NAU104823o-NAU26 2 735q内，与之相连锁的标记为 NAU104 825o、 NAU262735o; FS5位于标记区间BNL14212oo-NAU2 7 3 045o，与之连锁的标 记为BNL1421扁、NAU27 3 0450。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
的详细描述来进一步阐明本发明，与棉花高强纤维主效基因 连锁的分子标记是通过以下方法得出的
(1)以中国农业科学院棉花研究所培育的陆地棉品种中棉所41选系sGK9708为母 本，四川农业大学选育的具有亚洲棉渐渗的高强纤维种质系0-153为父本，2001年于中国农业科学院棉花研究所试验地配置杂交组合，2002年种植Fp自交产生F2。 2003年 在中国农业科学院棉花研究所试验地种植F2，同时种植亲本及F,各两行，收获250个单 株，将所有的单株自交，获得F2.3种子。分单株收花，并称取12-15g纤维样品进行纤维 品质测定。2004年选取196个单株种成F2:3株行，每家系自交获得F^ 4种子，按家系收 花，并选取12-15g纤维样品进行纤维品质测定。2004年冬，于海南加代繁殖，种植Fi
4种子，家系内自交获得F2: 5种子。2005年于中国农业科学院棉花研究所种植F2: 5种子，
每家系自交获得F^ 6种子。2005年冬于海南种植F2, 6家系，进行一次单株选择，进行家 系内提纯。2006年于中国农业科学院棉花研究所种植F6: 7种子，收获F^代种子。2007 年于中国农业科学院棉花研究所种植F6:8种子，并采用不完全随机区组设计，设置两重复， 收获F6,9种子，后期按家系收花，取12-15g纤维样品用于纤维品质的测定。2008年于 中国农业科学院棉花研究所、山东棉花研究中心临清试验站、中国农业大学河北曲周实 验站种植F&9种子，采用不完全随机区组设计，种植两重复，按家系收花，取12-15g纤 维样品进行纤维品质的测定。
(2) 取F^ 8代RIL群体的叶片，采用CTAB法提取196个家系和两亲本的DNA。
(3) 采用SSR标记进行高强纤维标记的筛选，首先选用5742对SSR引物对两亲本 间的多态性进行筛选，这些SSR引物中，其中以BNL编号的引物为布鲁克海文国家实验 室(美国)开发，以NAU编号的为南京农业大学(中国)开发，CIR编号的为国际农业 研究发展中心(法国)开发，以CM和JESPR编号的为德州农工大学(美国)开发，以 TMB和MGHES编号的为美国农业部农业研究服务署开发，MUCS和MUSS编号的为加 州大学戴维斯分校(美国)开发等，DPL编号的为Delta and Pine Land公司(美国)开 发。引物由上海生工和Bioasia公司合成。SSR扩增反应体系为10|il，其中超纯水6.40^1， 10xBuffer 1.0|al， 10mM dNTPs 0.50^1,正向引物(10pM) 0.50(il，反向引物(10pM) 0.50jnl， 模板DNA (30ng4il) 1.0^1 ， Taq DNA聚合酶(5U/nl) O.lOpl 。 SSR扩增反应程序94°C 预变性45s; 94'C变性30s， 57'C退火45s， 72'C延伸lmin， 29个循环。94。C变性60s, 57。C退火45s， 72。C延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD 公司PTC-200上进行，扩增产物在8%的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方 法进行凝胶银染，记录结果。分子标记筛选结果表明，有191对SSR引物在亲本间表现 多态性。
(4) 选用191对在亲本间有多态性的引物，对196个RIL家系群体进行扩增分析， SSR反应体系及SSR扩增反应程序以及扩增反应，凝胶电泳均参照(3)完成，共获得 了 217个多态性位点。(5)利用Joinmap3.0软件构建遗传连锁图谱，作图采用Kosambi函数，设定LOD 值7.0，构建了含有190个位点，34个连锁群，覆盖基因组700.9cM，约占基因组15.75% 的RIL群体分子连锁图谱，25个连锁群定位到了染色体上。
(6)结合RIL群体纤维品质的测定结果，利用Windows QTL Cartographer2.5进行 QTLs作图，设定LOD值为2.5,进行1000次排序测验，筛选与多环境下稳定表达的纤 维强度主效QTL，筛选到6个纤维强度性状的QTLs，其中5个为多环境稳定的主效QTLs， 分别位于染色体c25 (2个)、c7 (2个)及cl3上。FS1、 FS2位于染色体c25上，FS3、 FS4位于染色体c7上，FS5位于染色体c13上。与FS1连锁的标记为NAU21 1933Q，附近 的其它标记BNL3806!卯、TMK19180、 BNL3 8 06230、 NAU105 4220、 NAU105 432o CM67145 在Shen (2005) 、 Lacape (2005) 、 Shen (2007)及本实验室张建宏(2007)的研究中 已报道；与FS2连锁的标记为BNL2572125、 BNL1064 0、 DPL08 742H)，附近的其它标记 JESPR215140、 BNL144 0240在张建宏(2007)的研究中已报道；与FS4连锁的标记为 NAU104 825o、 NAU26 2 735o;与FS5连锁的标记为BNL14212q。、 NAU27 3 045q。在具有亚 洲棉渐渗的高强纤维种质0-153及中棉所41选系sGK9708杂交构建的RIL群体中，FS1 在四个环境下分别解释表型变异的19.12%、 14.25%、 15.38%、 18.43%，加性效应分别为 1.0510、 0.8067、 0.9823、 1.1026 cN/tex; FS2在四环境下分别解释表型变异的21.36%、 18.05%、 14.69%、 17.47%，加性效应分别为1.1216、 0.9083、 0.9646、 1.0785 cN/tex; FS4 在四个环境下分别解释表型变异的2.79%、4.87%、6.54%、5.66%，加性效应分别为0.4037、 0.4737、 0.6341、 0.5982 cN/tex; FS5在两个环境下检测到，分别解释表型变异的6.87%、 3.80%，加性效应分别为0.5338、 0.4741 cN/tex。
另外，我们构建了 一套陆地棉双交F2群体，利用与FS1相连锁的标记TMK19和CM067 对纤维强度性状进行辅助聚合育种研究(董章辉，2008)，发现聚合有该QTL的材料纤 维强度的差异达到了显著或极显著差异，说明利用与这些QTL相连锁的标记进行纤维品 质性状的标记辅助选择，可以大大提高陆地棉的纤维品质。
权利要求
1、与棉花纤维强度主效基因位点FS1、FS2、FS4、FS5相关的分子标记，其特征在于FS1、FS2位于染色体c25上，FS3、FS4位于染色体c7上，FS5位于染色体c13上，与FS1连锁的标记为NAU2119330；与FS2连锁的标记为BNL2572125、BNL1064110、DPL0874210；与FS4连锁的标记为NAU1048250、NAU2627350；与FS5连锁的标记为BNL1421200、NAU2730450。
2、 根据权利要求1所述的与棉花纤维强度主效基因位点FS1、 FS2、 FS4、 FS5相关 的分子标记，其特征在于是通过以下方法获得的1)利用大田推广的陆地棉栽培品种中棉所41选系sGK9708和具有亚洲棉高强纤维基 因渐渗的陆地棉优质品系0-153为亲本构建F2、 F2: 3群体；2) F2: 3群体家系内每世代自交，直至F2:6代，在F2: 6代进行一次家系内单株选择， 用以家系提纯，再种植两代至^8;3) 选用己公布的5742对SSR引物进行亲本间多态性筛选，分子标记初步筛选结果 表明有191对SSR引物在亲本间有差异，用多态性引物对196个Fe: 8家系群体进行扩增， 获得了 217个多态性位点，构建RIL群体连锁图谱；4) 进行多环境下的纤维强度主效QTL筛选，共筛选出6个来自0-153的棉花纤维强 度性状的QTLs，其中5个为多环境稳定的QTLs,即FS1、 FS2位于染色体c25上，FS3、 FS4位于染色体c7上，FS5位于染色体cl3上，与FS1连锁的标记为NAU21 1933。；与FS2 连锁的标记为BNL2572125、 BNL1064 。、 DPL087421。；与FS4连锁的标记为NAU1048250、 NAU262735。；与FS5连锁的标记为BNL14212。。、 NAU2730柳。
3、 根据权利要求2所述的与棉花纤维强度主效基因位点FS1、 FS2、 FS4、 FS5相关 的分子标记，其特征在于第3)步选用已公布的5742对SSR引物进行亲本间多态性筛 选，PCR反应体系为10 u 1，其中超纯水6. 40 u 1， 10xBuffer 1. Op 1， lOmM dNTPs 0. 50y 1， 10uM正向引物0. 50u 1，10uM反向引物0. 50u l，30ng/u 1模板DNA1.0n 1 ， 5U/u lTaq DNA聚合酶0. 10ii 1， PCR反应程序为94。C预变性45s; 94'C变性30s， 57'C退火45s， 72。C延伸lmin， 29个循环；94。C变性60s， 57'C退火45s， 72'C延伸2min, PCR反应在 TGRADIENT及PTC-200上进行，扩增产物在8%的聚丙烯凝胶中进行电泳，记录结果。
全文摘要
与棉花纤维强度主效基因位点相关的分子标记，用以下方法获得的利用陆地棉栽培品种中棉所41选系sGK9708和陆地棉优质品系0-153为亲本构建F₂、F_2:3群体；F_2:3群体家系内每世代自交，直至F_2:6代，在F_2:6代进行一次家系内单株选择，再种植两代至F_6:8；用SSR引物进行亲本间多态性筛选，构建RIL群体连锁图谱；进行多环境下的纤维强度主效QTL筛选，筛选出6个来自0-153的棉花纤维强度性状的QTLs，5个为多环境稳定的QTLs，FS1连锁标记NAU2119₃₃₀；FS2连锁标记BNL2572₁₂₅、BNL1064₁₁₀、DPL0874₂₁₀；FS4连锁标记NAU1048₂₅₀、NAU2627₃₅₀；FS5连锁标记BNL1421₂₀₀、NAU2730₄₅₀。本发明通过筛选来自优异纤维品质材料中与棉花高强纤维主效基因连锁的SSR分子标记，利用这些分子标记进行DNA水平上的早期辅助选择可以提高棉花纤维强度的选择效率。
文档编号C12Q1/68GK101613761SQ20091016273
公开日2009年12月30日 申请日期2009年8月12日 优先权日2009年8月12日
发明者刘爱英, 商海红, 孙福鼎, 巩万奎, 张建宏, 李俊文, 涛 王, 王淑芳, 石玉真, 袁有禄, 龚举武 申请人:中国农业科学院棉花研究所