抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及其识别的抗原表位的制作方法

专利名称：：抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及其识别的抗原表位的制作方法
技术领域：
：本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及两林抗口蹄疫病毒(FMDV)的血清型共享性单克隆抗体以及其中一抹单克隆抗体所识别的抗原表位，本发明上述单克隆抗体及其识别的抗原表位在口蹄疫诊断或防治中的应用，属于口蹄疫的防制领域。
背景技术：
：口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)属于小RM病毒科口蹄疫病毒属的成员，其基因组为单股正链RNA，全长约8.5kb。口蹄疫是严重危害偶蹄动物的重要传染病之一，该病可引起幼畜死亡、产奶量下降、肉食减少、肉品下降、动物的生产性能降低，导致巨大的经济损失。此外，由于贸易的限制和禁止而引起的损失更大，全世界每年由此造成的直接经济损失可达数百亿美元。2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发了Asial型FMD(Asial/JS/CHA/05，GenBank登录号EF149009)，由于在我国江苏省首先分离，被称作Asial型江苏谱系。该语系口蹄疫病毒在我国牛群中一经流行，传播趋势迅猛，造成的损失极为严重。本世纪初0型口蹄疫病毒泛亚语系在中国(0/Tibet/CHA/99，GenBank登录号AJ539138)及周边国家甚至欧洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003,84(Pt6):1583-93)均有流行，给许多国家造成巨大损失。因此，积极开展Asia1型和0型口蹄疫(FMD)的研究，对我国FMD的防控具有重要的意义。口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂，不同血清型、基因型和分离林的口蹄疫病毒其抗原表位和抗原位点都不尽相同，存在广泛的抗原变异。利用单抗逃逸突变株序列分析和交叉中和试验，已鉴定了一些不同血清型FMDV的抗原位点，相关的研究主要来自0、A、C和Asial型FMDV。中和性单抗在保护易感动物抵抗口蹄疫病毒感染过程中起主导作用，而某些相对保守的免疫显性表位可诱导机体产生血清型共享型单抗，对于FMDV感染的诊断具有重要价值。近年来，对于相对保守的VP2蛋白N-末端区域的抗原性研究已有才艮道，Yang才艮道的针对FMDVVP2N-末端的单克隆抗体中，9B4、15F7和F1412SA表位均为胰蛋白S^t感型，用胰蛋白酶处理表位肽后，表位对单抗的活性消失，表明其表位属于构象型，并包含Lys2(K2)-Lys3(K3)或Arg13(R13)残基;可是Freiberg报道的单抗13A6和本发明中单克隆抗体4B2情况类似，识别肽段相同且都是非胰蛋白酶敏感型单抗，表明两者表位区域相同或相似，因此将两单抗重链可变区序列进行比对，结果证明二者有相近之处但并非相同的单抗；2007年Wang等对Asial型毒林YNBS/58的VP1和VP2上主要的抗原区段进行了免疫原性分析，结果发现，D7(VP1的133-163aa)和Bl(VP2的l-33aa)两个区段,都能够诱导豚鼠淋巴组织增生，但D7有中和活性而B1无中和活性。当用D7和B1共同免疫豚鼠时，能够诱导出很高水平的中和抗体反应，说明B1(VP2N-末端)对D7(VP1133-163aa)的免疫原性有促进作用。在VP2的l-33aa区域，存在免疫活性位点，尽管不属于中和性位点，但是该区段内的位点对于主要中和活性位点的免疫反应具有增强和促进作用。对于表位的定位和定性，国外这些研究是用单克隆抗体压力筛选或用合成肽扫描技术，只能确定表位相关的氨基酸或肽段，不能精确地确定表位的位置和性质。我国虽有Asial型和O型FMDV单克隆抗体的文章发表，然而尚未见到共享表位单克隆抗体的报道;有关FMDV共享表位的精确定位和定性，国内外尚无研究报道。
发明内容本发明目的之一是提供两抹能分别分泌抗FMDV血清型非依赖性的单克隆抗体4B2和3D9的杂交瘤细胞系；本发明目的之二是提供由上述单克隆抗体4B2所识别的所有血清型FMDV共有表位氨基酸序列；本发明目的之三是将上述单克隆抗体或共享性表位用于诊断或预防口蹄疫。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株能分泌抗FMDV非血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系4B2，其^f敖生物保藏号是CGMCCNo.3103;分类命名单克隆抗体杂交瘤细胞；保藏时间是2009年5月18日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。上述杂交瘤细胞系4B2所分泌的单克隆抗体。本发明进一步确定了由该单克隆抗体所识别的FMDV非血清型依赖性线性表位，该线性表位基序的氨基酸残基是FMDV-VP2蛋白的Glu6-Thr7-Thr8-X-Leu"-Glu11(SEQIDN0:1),其中，X选自任意一种氨基酸残基，关键性氨基酸残基为Glu6、Thr7、Thr8、Leu"和Glu11，决定性氨基酸为Glu";该表位最佳活性单位为十二肽2KKTEETTLLEDR13(SEQIDNO:2),其中，2KKTE5和12DR13对于表位基本活性单元Glu6-Thr7-Thr8-X-Leu"-Glu"具有增效作用。一林能分泌抗FMDV非血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系3D9,其微生物保藏号是CGMCCNo.3104;分类命名单克隆抗体杂交瘤细胞；保藏时间是2009年5月18日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。由该杂交瘤细胞系3D9所分泌的抗FMDV的非血清型依赖性单克隆抗体。以杂交瘤细胞系3D9分泌的单克隆抗体3D9为捕获抗体，以生物素标记的杂交瘤细胞系4B2分泌的单克隆抗体作为检测抗体，采用抗原捕获ELISA方法，可应用于4全测FMDV。本发明整体4支术方案的详细描述本发明用纯化的全病毒免疫BALB/c鼠制备抗Asial型江苏镨系FMDVAsial/YS/CHA/05和0型FMDV泛亚谱系O/YS/CHA/05才朱的单克隆抗体，分别获得两抹具有强反应活性的单克隆抗体4B2和3D9。ELISA及间接免疫荧光检测表明，该两抹单克隆抗体均属于FMDV共享性单克隆抗体；间接免疫荧光和Westernblot检测表明，4B2识别FMDV—个线性表位，3D9识别FMDV—个构象型表位。本发明进一步利用噬菌体展示随机12肽库筛选上述单抗4B2识别的模拟表位，发现一个表位基序ETTXLE(X代表20种氨基酸残基任意一种)与单抗4B2具有结合活性。鉴于单抗4B2才莫拟表位基序ETTXLE与GenBank中7>布的所有7个血清型FMDV的VP2蛋白N-末端的6~11位氨基酸序列存在高度同源，用大肠杆菌融合表达一系列N-末端区域表位相关短肽，并进行Westernblot分析，确定ETTLLE六肽为单抗4B2表位的基本活性单元。进而确定该表位的最佳活性单位是2KKTEETTLLEDR^对单抗4B2识别表位的基本活性单元6个氨基酸残基逐一进行氨基酸替换分析确定,其中5个氨基酸对于表位活性均是重要的，从而确定该表位的关键性氨基酸残基为Glu6、Thr7、Thr8、Leu'。和Glu11,其中氨基酸残基Glu"对于该表位活性起决定性作用；2KKTEs和uDRu对于表位基本活性单元ETTLLE均有增效作用。鉴于上述两个单抗具有非血清型依赖性，而且在体外FMDV诊断方面具有纟艮高的特异性，本发明进而以单克隆抗体3D9为捕获抗体、生物素标记的单克隆抗体4B2作为检测抗体，建立了4企测FMDV的抗原捕获ELISA方法。确定捕获单克隆抗体3D9的最佳包被浓度为2.5ng/mL,检测单克隆抗体4B2的最佳使用浓度为0.9pg/ml。敏感性试验表明，该方法对AsialFMDV细胞毒的最低检出量为1.8x104TCID5。，对0型FMDV细胞毒的最低检出量为7.9x103TCID5。。符合性试验表明，该方法对细胞毒的检出率为100%，组织毒的4全出率为73.3%。对牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎等病毒进行检测，均为阴性，无交叉反应发生。本研究建立的FMDV抗原捕获ELISA方法，具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可用于FMDV的特异性^r测。本发明中的两抹单克隆抗体及其表位对于FMDV的诊断试剂开发均有重要意义，对于表位疫苗研究也具有潜在的应用价值。图l单抗4A8、4B2和lF6的细胞上清针对0型和Asial型抗原的IFA斗全测；A-E:0型FMDV感染的BHK21细胞抗原;F-J:Asial型FMDV感染的BHK21细胞抗原；A-C、F-H:分别为4B2、1F6和4A8;D、I:阴性血清对照；E、J:阳性血清对照。图2单抗3D9、4B2的特异性IFA鉴定。图3SDS-PAGE鉴定纯化的单克隆抗体3D9、4B2;M:蛋白分子量标记，1:纯化单抗3D9，2:纯化单抗4B2。图4ELISA检测与单抗4B2特异结合的24个噬菌体克隆；ELISA方法筛选单抗4B2特异性亲和的噬菌体；用相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入用单抗4B2包被的微孔板中，并设同种抗体亚型的单抗1F6、含1仰SA的封闭液和原始肽库(PhageLibrary,PL)作为对照。图5七个阳性噬菌体克隆的ELISA才企测；ELISA方法筛选单抗4B2特异性亲和的噬菌体；用相同蚀斑数的各噬菌体克隆加入用单抗4B2包被的微孔板中，并设同种抗体亚型的单抗1F6、含1。/。BSA的封闭液和原始肽库作为对照。图67个阳性噬菌体克隆12肽的氨基酸序列比对。图712肽与GenBank中所有VP2氨基酸序列比对结果。图8载体pGEX-6p-l经BamHI和Xhol酶切鉴定；1:Marker;2:载体pGEX-6p-l。图95条短肽插入载体pGEX-6p-l的PCR鉴定；M:Marker;1:Y15-l;2:Y15-2;3:六肽；4:5肽；5:四肽；6:H20对照。图109条短肽插入载体pGEX-6p-l的PCR鉴定；M:Marker;1-9:L5dDKKTEETTLLEu)，L4GKKTEETTLLEu)，L3GKTEETTLLEu)，L2GXPTTLLEn),LI(5pTTLLEu)，Rl(6ETTLLE^12),R2(6ETTLLE^13),R3(6ETTLLEDRI14)和R4(6ETTLLEDRIL15)。图117条短肽插入载体pGEX-6p-1的PCR鉴定；M:Marker;1-7:Y12(2KKTEETTLLEDR13),S—1(2KKTEATTLLEDR13),S-2(2KKTEEATLLEDR13)，S-3(2KKTEETALLEDRu)，S-4(2KKTEETTALEDR13)，S-5(2KKTEETTLAEDR13)和S-6(2KKTEETTLLADR13)。图12SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析，确定表位基本活性单元为6ETTLLEU。A,B:1.蛋白Marker;2:诱导前PGEX-6P-1;3:i秀导后PGEX-6P-1;4-8:表达的Y15-1，Y15-2，P6，P5和P4。图13设计融合表位蛋白的SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析，结果确定了明显增强表位活性的氨基酸残基为2KL和R13。已标出蛋白Marker;L5dDKKTEETTLLE。，L4(2KKTEETTLLEU),L3GKTEETTLLEn),L2(4TEETTLLE),LI(5|ETTLLE)，Rl(6ETTLLE^2)，R2(6ETTLLE^13)，R3(6ETTLLEDRI14)和R4(6ETTLLEDRIL15)。10图14设计融合表位蛋白的SDS-PAGE(左)和WesternMot分析(右)鉴定表位最佳活性单位为2KKTEETTLLEDR13。1:蛋白Marker;2:Y15-1;3:Y12;4:L4;5:R2;5:Y15-2。图15设计融合表位蛋白的SDS-PAGE(A)和Westernblot(B)分析。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。一、材料和方法1.病毒、细胞、菌4朱和实验动物口蹄疫病毒抹Asial/YS/CHA/05属于Asial型FMDV江苏谱系，该谱系毒林2005年以来在我国江苏、山东、甘肃、北京、河北等地爆发流行(Asial/JS/CHA/05,GenBank登录号:EF149009);O/YS/CHA/05林属于O型泛亚谱系，该语系毒4朱上世纪末本世纪初在中国(O/Tibet/CHA-/99，GenBank登录号:AJ539138)及周边国家甚至欧洲(MasonPWetal.JGenVirol.2003，84(Pt6):1583-93)均有流行，给许多国家造成巨大损失。乳仓鼠肾细胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；质粒pGEX-6p-l和受体菌BL21由本实验室保存；清洁级雌性BALB/c小鼠、SPFli级BALB/c乳鼠购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。2.主要试剂融合剂PEG/DMS0(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、HRP或FITC标记的羊抗鼠IgG、购自Sigma公司;法国白油佐剂MONTANIDEISA206VG购自SEPPIC公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自SouthernBiotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸购自Amresco/^司；二甲基亚石风(DMSO)、邻苯二胺(OPD)、PEG6000购自Solarbio公司;Ph.D.-12'，库试剂盒购自NewEnglandBiolabs/^司；HRP标记抗的M13噬菌体抗体购自于GEHealthcare公司;限制性内切酶5細HI、為I购自TaKaRa公司;T4DNA连接酶购自NewEnglandBiolabs公司；高糖DMEM干粉购自GIBCO公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大JETBiochemical公司。3.鼠免疫与单克隆抗体的制备(1)将0型FMDV细胞适应泰接种于长满单层的BHK-21细胞，待75°/。以上细胞出现病变后收毒。将收获的细胞培养液反复冻融三次，初步裂解细胞，释》文病毒。冻融后的病毒液以l:1OOO加入TritonX-100和4:10000加入甲醛裂解与灭活48h以上，取灭活过的病毒液lmL上BHK-21细胞盲传三代，检测是否灭活彻底。将经冻融裂解后的培养液作9OOOrpm(Beckman高速离心机，JA-10转子)、4。C离心90min，回收病毒液上清，弃去细胞沉淀。按病毒液上清的体积加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室温搅拌2h至完全溶解，4。C过夜沉淀。次日将上清9OOOrpm、4'C离心90min，弃上清，回收沉淀。用NET緩沖液于低温下将沉淀轻轻重悬。将重悬的上清2912OOOrpm、4。C离心2h，回收沉淀，于低温下用适量的NET緩冲液轻轻重悬沉淀，充分混匀后分装，-70。C冻存备用。将提纯抗原用NET緩冲液进行IO倍、IOO倍、IOOO倍稀释，用分光光度计测量蛋白质的浓度。(2)用纯化的0型FMDV抗原200ng/200piL加等体积法国白油佐剂206VG,充分乳化后经背部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫；间隔2周后，以不加佐剂的等量抗原进^f于第3次免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d采用尾静脉和脾脏注射相结合的免疫方式进行加强免疫，注射二倍量抗原。(3)细胞融合a)飼养层细胞的制备细胞融合前一天进行饲养层细胞的制备，眼科剪刀、眼科镊子、平皿等试验用具用前高温干热灭菌，HAT完全培养液做无菌检验。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常规方法分离阴性血清。拉颈脱臼处死小鼠，将其浸泡于75%酒精中，10min后移入超净工作台。将小鼠腹部向上固定在鼠架上，用镊子提起腹正中部皮肤，眼科剪刀横向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和镊子上下撕开皮肤，充分暴露腹膜。用镊子轻轻^腹膜，将10ml注射器内吸取的8-10mlHAT完全培养液注入腹腔，切勿刺破脏器和肠道，注射器不要拔出，在腹腔内来回抽吸5-10次，然后用镊子按摩两侧腹部30秒左右，再进行抽吸，重复以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔内液体。注意避开肠系膜及脂肪组织，以免堵塞针头。将从2只鼠中取出的腹腔细胞加入55mlHAT培养液中，吹散混匀细胞，分装于6块96孔培养板，100nl/孔。置于37。C、5%0)2培养箱中培养。b)骨髓瘤细胞的制备融合前36-48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使13细胞处于对数生长期。融合当天，用15mlDMEM基础培养液将细胞从瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中。1000rpm离心10min。将细胞沉淀重悬置20mlDMEM基础培养液中，混匀。取少量骨髓瘤细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。c)免疫脾细胞的制备融合前摘除小鼠眼球采血，制备阳性血清。将小鼠拉颈脱臼致死，浸泡于751酒精中，10min后放于超净台。无菌打开腹腔，分离结締组织并取出脾脏，将脾脏放入装有灭菌尼龙网和盛有15mlDMEM基础培养液的平ini中，用灭菌玻璃注射器内芯研磨脾脏，使脾细胞全部通过网孔进入平皿中。将脾细胞溶液转入50ml离心管中，加DMEM基础培养液大约至30ml，混匀。1000rpm离心8min，弃上清。将细胞沉淀悬于10mlDMEM基础培养液中，混匀。取细胞悬液，台盼兰染色计数，备用。d)脾细胞与骨髓瘤细胞融合取65mlHAT培养液，15ml勤出DMEM培养液和lml50y。PEG于37。C水浴中预热，另备盛有37。C水的200ml烧杯。4安5份脾细胞数力口l份骨髓瘤细胞数拟目应细胞悬液量，加入50ml玻璃离心管中，补力口DMEM基础培养液至30ml，混匀。1OOOrpm离心10min,弃上清，尽可能倒干。用手掌轻击离心管底部，使沉淀细胞+碌均匀呈糊状。将离心管方文入盛有37'C水的200ml烧杯中，一手均匀转动离心管，另一手用lml巴氏吸管吸取37。C50%PEG溶液lml，lmin内加完，静置2min。随后先十曼后快地加入DMEM基础培养液终止反应，37。C水浴静置10min。1000rpm离心10min,弃上清，加入65mlHAT培养基，轻轻地吹散细胞，每孔O.lml接种于已培养有饲养细胞的6块96孔培养板，置37。C、5%的(:02培养箱中培养。5d后半量换液，8d后全换液，待克隆长至孔底面积l/4-l/3时取上清14进行检测并换HT培养液。4.抗体检测ELISA用提纯的病毒抗原包被于微孔板中，加入10(^1杂交瘤细胞培养上清，37。C温育lh后洗涤，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，洗涤后加入底物OPD避光显色1Omin，于波长492nm测定吸光值。5.间接免疫荧光微孔板培养BHK-21细胞至单层，接种口蹄疫病毒4x103TCID5。/well,出现CPE之前用冷无水乙醇进行固定，加入50pl杂交瘤细胞培养上清，37°C温育40min后PBS洗涤三次，加入1:200稀释的荧光素标记羊抗鼠IgG抗体，37°C温育40min,洗涤后在倒置荧光显微镜下观察，以+号数目记录荧光强度。6.微量细胞中和试验(l)病毒毒价的测定将病毒接种于单层细胞，37。C吸附lh后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变(CPE)达75%以上，收获病毒悬液冻融3次，以3000r/min离心10min,取上清液，定量分装成lml小瓶置-7(TC保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。取自-7(TC冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即l(T1，10—2，10—11…...，每孔病毒悬液量为50jii1，每个稀释度作8孑L,每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把培养板置5°化02温箱37。C培养，从48-72h逐日观察细胞病变，记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID5。。15表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)中和试验动物腹水中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫J求蛋白和抗补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清或腹水须经加热56°C30min灭活处理。取已灭活处理的单抗腹水，在96孔微量细胞培养板上，用不含血清的DMEM作一系列倍比稀释,使其稀释度分别为原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、l:64等等，每孔含量为50jal，每个稀释度作4孔。取-7(TC水箱保存的病毒液，将原始毒价稀释至200TCIDs。，50pl(与等量腹水混合，其毒价为100TCID5。)。如病毒价为l(T63，50ja1。所以应将病毒作2x10-43稀释。每孔加入50iil病毒稀释液，封好盖，置于37。C温箱中和lh。在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度血清与病毒中和lh后取出，每孔加入100jul细胞悬液。置5%C0237。C温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，120h终判。为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照。阳性和阴性(sp2/0)腹水与待检腹水进行平行试验,阳性腹水对照应不出现细胞病变，而阴性腹水对照应出现细胞病变。每次试-验每一块板上都设立病毒对照，先将病毒作0.1、1、10、100、1000TCID5。稀释，每个稀释度作4孑L，每孔加50m1。然后每孔100ju1细胞悬液。0.lTCIDTCIDs。应不引起细胞病变，而且100TCIDs。必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。为检查被检腹水本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检腹水毒性对照是必要的。即在组织细胞中加入低倍稀释的待检腹水(相当于中和试验中被检腹水的最低稀释度)。正常细胞对照即不接种病毒和待检腹水的细胞悬液孔。正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。当病毒回归试一验，阳性、阴性、正常细胞对照相，腹水毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检腹水孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释腹水中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的腹水稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果。表2固定病毒-稀释血清法中和抗体效价计算<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>用Reed和Muench两氏法(或Karber法)计算结果80%-50%距离比例=-=0.580%-20%IgPDs。-高于50%血清稀释度的对数-距离比例x稀释系数的对数IgPD50=-1.5-0.5x(-0.3)=-1.35贝'JPD50=10—L36，50ja1因10—135=l/22,即1:22的血清可保护50%细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。7.生物淘洗将腹水先经辛酸-硫酸铵法粗提，然后用MbProteinGSpinPurificationKit(PIERCE)进行亲和层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度后用于生物淘洗，用M13噬菌体展示随机线性十二肽库对单抗进行表位作图。生物淘洗参照试剂盒说明书进行第l轮淘洗于微孔板中包被l(^g单抗，第2、3轮分别包净皮5pg、lpg,4°C过夜；0.05%TBST洗涤后，用10g/LBSA封闭，加入1.5xl011pfu/100jLil展示十二肽的M13噬菌体，室温轻摇lh，TBST洗涤10次后，用洗脱緩沖液将结合的噬菌体于室温轻摇10min洗脱下来，加入緩冲液中和洗脱的噬菌体，接种大肠杆菌ER2738进行扩增。对扩增后的噬菌体进行回收并测定滴度，取1.5x10"pfu噬菌体进入下一轮淘洗。第4轮淘洗釆用ProteinG捕获法进行液相结合，单抗使用量为300ng。挑取单个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其活性，最后对阳性噬菌体的单链DNA进行序列分析。8.噬菌体亲和捕获ELISA于96孔聚乙烯酶标板中包被100ng单抗(每孔10(^1,0.1M》友酸氢钠pH8.6)，4'C过夜，设立重复孔，同时设立识别不同表位的来源于同一只小鼠制备的单克隆抗体，1仰SA封闭液为对照。室温封闭2h后，用0.1。/。TBST稀释噬菌体克隆至1(Tpfu/10(^l,加入每孔，室温轻摇反应lh,用0.1%TBST洗六次后，加入1:5000稀释的HRP标记的鼠抗M13喧菌体抗18体,用底物ABTS[2，2'-azinobis(3-ethylbenzthiazo1inesulfonicacid)]显色后于"5nm测吸光度，以P/N〉2.1作为待检样品的阳性结果判定标准。9.噬菌体单链DNA模板的制备与测序在第3、4轮淘洗后，随机挑选噬菌体克隆，分别接种到含lml1:100稀释的ER2738对数中期培养物，于37。C震荡培养4.5h。12OOOrpm离心10min,各取500pl上清到新管中，每管加入200plPEG/NaCl，混匀后，静置10min，12OOOrpm离心10min,沉淀溶于100jal石典化钠緩冲液中，再加入250pl无水乙醇，室温静置10min,12OOOrpm离心10min,弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤，自然干燥后，用30fi1纯水溶解，即可作为测序才莫板。测序由上海生物工程有限公司完成，测序引物为-96gl11,序列为5，-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3，。10.SDS-PAGE和Westernblot分析SDS-PAGE、转印、封闭等操作，按实验室常规方法进行，再与封闭液稀释的腹水单抗(1:1000)37。C反应lh,Tris-Cl洗液洗涂3次，每次10min,然后与l:5000倍稀释HRP标记的羊抗鼠IgG室温反应lh，洗涤3次，每次10min，最后置于MB底物显色液中显色，观察记录结果。1911.大肠杆菌融合表达表位相关短肽人工合成编码表位和截短表位DNA的两条互补寡核苷酸链，如表3、4、5所示。插入片段上游引入&顶HI粘性延伸末端(小写部分)，下游引入终止密码子以及Eol粘性延伸末端(下划线部分)，并才艮据大肠杆菌密码子偏好对该表位基因进行密码子优化。表3.表位基本活性单元鉴定相关短肽及鉴定引物编码DNA的互补寡核苷酸链短肽互补寡核苷酸链DKKTEETTLLEDRILETTIXEDRILTTRNGETTLXETTLLEPCR鉴定引物15-1-叩5'gatccGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTGTAAe:15-l匿low:5'^gagTTACAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTGTCg15-2-叩5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTGACTACCCGCAACGGGTAAg315-2-low:5'Jeg^gTTACCCGTTGCGGGTAGTCAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg6-叩5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGTAAg3'6-low:5'^eg^gTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'5-up:5'gatccACCACTCTTCTTGAGTAAs3'5-low:5'ieg^gTTACTCAAGAAGAGTGGTg3'4匿up:5'gatccACTCTTCTTGAGTAAs3'4-low:5'teg^gTTACTCAAGAAGAGTg3,Up:5'AACCGAGGAGACCACTCTTCTTG3'Low:5'CGCTCGTCGTTTGGTATGGCT3'20表4.表位增效氨基酸鉴定相关短肽编码DNA的互补寡核苷酸链短肽互补寡核苷酸链ETTLLEDR7-up:R7-low:gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACTAAe3'mgigTTAGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETT1XEDRR8-up:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAs3'R8-low:5'IsgigTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETTLLEDRIR9-up:R9-low:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCTAAe3'5'tSg5gTTAGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'ETTIXEDRILR10隱up:5'gatccGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCATCCTCTAAs3'R10-low:5'tegagTTAGAGGATGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCg3'EETTLLEL7-up:5'gatccGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'L7隱low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCg3'TEETTLLEL8-up:L8-low:5'gatccACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAg3'5'Jeg5gTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTg3'KTEETTLLEL9-up:5'gatccAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'L9-low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTg3'KKTEETTLLEL10-up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAs3'L10-low:5'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'DKKTEETTLLEL11-up:Lll-low:gatccGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGTAAe3'tegagTTACTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTGTCg3'21表5.表位关键性氨基酸鉴定相关短肽及鉴定引物编码DNA的互补寡核苷酸链短肽互补寡核苷酸链Y12:;KKTEETTLLEDR12-up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-l:KKTEATTLLEDR12-1up:5'gatccAAGAAAACCGAGGCGACCACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-1low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTGGTCGCCTCGGTTTTCTTg3,S隱2:KKTEEATLLEDR12-2up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGGCGACTCTTCTTGAGGACCGCTAAe3'12-2low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGAGTCGCCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-3:KKTEETALLEDR12-3up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCGCGCTTCTTGAGGACCGCTAAe3,12-3low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGAAGCGCGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-4:KKTEETTALEDR12-4up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTGCGCTTGAGGACCGCTAAs3,12-4low:5'tcgagTTAGCGGTCCTCAAGCGCAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-5:KKTEETTLAEDR12-5up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTGCGGAGGACCGCTAAe3'12-5low:5'tegagTTAGCGGTCCTCCGCAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg3'S-6:KKTEETTLLADR12-6up:5'gatccAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTTGCGGACCGCTAAe3'12-6low:5'tcgagTTAGCGGTCCGCAAGAAGAGTGGTCTCCTCGGTTTTCTTg鉴定引物up:5'CTGGGATCCAAGAAAACCGAG3'low:5'CGCTCGTCGTTTGGTATGGCT3'将两条互补链直接退火形成带粘性末端的双链DM,插入pGEX-6p-1的化/HHI和Xi3oI之间，转化BL21感受态细胞，用PstI酶切鉴定重组质粒，分别命名(表3-5)。挑取单个阳性菌落过夜培养并测序验证，然后1:IOO稀释接种于新鲜的液体LB培养基中，37。C震荡培养至OD6。。^0.6,加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L,37。C继续培养5h,收集菌体并用适量的PBS重悬，备用。12.SDS-PAGE电泳和Westernblot检测SDS-PAGE电泳(15%Tris-glycine)分离融合蛋白，转印至硝酸纤维素滤膜上(90V,45min),用5W脱脂乳-PBS封闭液于4。C封闭过夜，与单抗8E8于37。C温育lh,与HRP标记的羊抗鼠IgG于室温作用lh,DAB(6mg/10mL)显色。13.单克隆抗体的纯化及生物素标记将单克隆抗体3D9、4B2先经辛酸-硫酸铵法初步提纯，然后用PIERCE公司NAbTMSpinPurificationKits进行亲和层析纯化。13.1辛酸-硫酸铵法初步提纯主要步骤如下(1)取3ml预处理过的腹水加6ml0.06mol/LPH4.8醋酸i爰冲液，搅拌均匀；腹水中加99^1辛酸(水浴下逐滴加入辛酸)搅拌30分钟，4。C静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调PH至7.4(只需加1^1左右即可)；(2)在4。C下加入饱和硫酸铵至50°/。饱和度，水浴搅拌作用30分钟，4。C静置2小时以上；11000转离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5ml0.1M的PH7.4的PBS中；(3)向沉淀悬浮中便搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30%—40%,冰浴搅拌作用30分钟，4度静止2小时以上；11000转离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2ml0.1M的PH7.4的PBS中；(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，4。C用0.1M的PH7.4的PBS透析，2小时^:液一次，透析2天。13.2亲和层析纯化操作步骤如下(1)涡旋混匀蛋白G填料，吸取200ju1蛋白G加入吸附柱；(2)加入300ju1结合緩冲液，轻轻混匀；(3)5000xg离心lmin,取出吸附柱，弃去收集管中的液体；(4)重新将吸附柱放入收集管中，加入400jil结合緩冲液，混匀后5000xg离心lmin;(5)取出吸附柱，弃去收集管中的液体，将吸附柱重新放入收集管；(6)加入200n1辛酸-硫酸铵法初步提纯的单抗样品到吸附柱中，室温作用30min，不时地摇动确保凝胶填料始终处于悬浮状态；(7)5000xg离心lmin，将吸附柱移入一个新的收集管中；(8)向吸附柱中加入400jLi1结合緩冲液，混匀悬浮凝胶填料，5000xg离心lmin.弃去收集管中的液体.将吸附柱重新移入收集管中.重复两次；(9)将吸附柱移入一新的收集管，加入400ja1洗脱緩冲液，混匀凝胶填料5min;(10)5000xg离心lmin，然后将吸附柱转入新的收集管，收集蛋白洗脱液；(11)紫外分光光度计测定洗脱液蛋白含量，小量分装，-2(TC冻存备用。13.3生物素标记单抗4B2:用EZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒对单抗4B2进行生物素化，按照产品说明书上的方法进行生物素标记，具体步骤如下(1)Sulfo-NHS-LC-生物素的配制。从-20。C水箱中取出Sulfo-NHS-LC-生物素，在打开之前使其温度与室内温度保持一致。取2.2mgSulfo-NHS-LC-生物素，溶于400nl的去离子水中，配制为10mMSulfo-NHS-LC-生物素，现用现配。(2)MAb纯化物的配制。取出亲和层析纯化的单抗，将其用PBS配制成2mg/ml的蛋白液。(3)MAb纯化物的生物素化。4要照MAbs纯化物摩尔数Sulfo-NHS-LC-生物素为1:20(Sulfo-NHS-LC-生物素充分过量)的比例进行混合，将27jil的10mMSulfo-NHS-LC-生物素加入至lml2mg/mlMAbs纯化物中，放置水中孵育2h。(4)透析去盐。采用试剂盒所带的Zeba去盐柱将未发生反应的生物素小分子和盐类清除掉。(5)收集透析后的生物素化的MAb。二、试验结果(一)4B2和3D9单克隆抗体的制备及4B2识别表位的鉴定1.针对FMDV非血清型依赖性线性表位单克隆抗体的筛选和鉴定免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合的杂交瘤细胞培养上清，用间接ELISA检测和IFA验证，阳性判定标准为，以杂交瘤培养上清对FMDV抗原的0D"2光吸收值与正常BALB/c小鼠血清、SP2/0细胞上清对FMDV抗原0D^值之比均大于2.1,且杂交瘤细胞上清对正常BHK-21细胞的免疫荧光结果为阴性，判为阳性杂交瘤细胞。经篩选和三次有限稀释法克隆，获得2抹阳性杂交瘤细胞，分别命名为4B2和3D9。用杂交瘤上清鉴定2抹杂交瘤细胞分泌抗体的免疫球蛋白亚类，结果显示，3D9重链类型为IgG2b,4B2重链类型为IgGl,2株单抗轻链均为k类型(表6)。与0/YS/CHA/05抹和Asial/YS/CHA/05病毒抹的中和试^r显示单抗3D9和4B2都未能达到1:32的稀释比，判定为无中和活性。对2林单抗进行了全病毒Westernblot分析，3D9未见特异性反应条带，而4B2有明显反应条带。因此认为，所获得的2株单抗3D9识别构象型表位、而4B2识别线性表位。表6抗Asial型口蹄疫病毒单克隆抗体生物学特性鉴定单抗抗体亚类间接免疫荧光试验中和试验Westernblot3D9IgG2b/K++++4B2IgGl/K+++++2.4B2免疫荧光;f企测在单抗的血清型特异性分析时，用4B2和另外24朱0型FMDV单抗进行0型和Asial型抗原的IFA才佥测(图l)。结果证明，4B2能够识别所有检测对象，可确定该单抗为非血清型依赖性FMDV共享表位单克隆抗体。3.3D9、4B2与多血清型FMDV抗原的间接免疫荧光检测分别用Asial型、0型和A型FMDV各个基因型代表毒株感染BHK-21细胞，同时设立BHK-21细胞对照，经无水乙醇固定后进行间接免疫荧光实验，鉴定单抗3D9、4B2与不同血清型和基因型FMDV的反应性，结果如图2显示，单抗3D9、4B2与全部6个FMDV代表毒林均有反应。从而，确定单抗3D9、4B2为FMDV各个基因型共享性单克隆抗体。4.单克隆抗体3D9、4B2纯化单克隆抗体3D9、4B2经辛酸-硫酸铵和亲和层析纯化后，经SDS-PAGE鉴定纯度，结果如图3所示，分别大约在55kDa和25kDa处可见Ig重链和轻链两条特异性条带，与预期相符；经紫外分光光度计测定两者的蛋白含量分别为2.5mg/mL、2.6mg/mL。(二)4B2识别表位的精确定位及鉴定1.单抗4B2识别的模拟表位基序为ETTXLE为鉴定单抗4B2识别的线性表位，本实4全利用一个展示随^^线性十二肽的噬菌体文库对纯化的单抗4B2进行4轮生物淘洗(表7),在第3、4轮共挑取36个噬菌体克隆进行扩增，用噬菌体亲和捕获ELISA鉴定其反应活性，设立同一只鼠制备的同种抗体亚型的单抗1F6和封闭液BSA作为对照，以排除抗体恒定区以及BSA的干扰，最终获得24个针对抗体可变区的阳性噬菌体克隆(图4),均具有较高的亲和力。对这些阳性噬菌体克隆的单链DNA进行序列分析，获得7条不同的12肽序列，命名为P9、P12、P14、Pll、P22、P16和P8。再将该7个不同噬菌体阳性克隆进一步用ELISA检测，并按照3次实验平均值大小排序建图(图5)。将7条不同的12肽氨基*列进行序列比对，从结果中可以推导出7个噬菌体克隆均含有一个特征性序列ETTXLE(x代表20种氨基酸残基任意一种)(图6)，将其暂定为单抗4B2识别的线性表位的基序。将基序ETTXLE与GenBank中所有7个血清型FMDVPl蛋白氨基酸序列比对，发现其与VP2N-端的第6-ll位氨基酸(6ETTLLEU)显示出极高的相似性(图8)，而且，该区域在所有血清型FMDV中高度保守。因此提出4B2可能为所有血清型FMDV共享型单抗。在基序推导时，本发明人注意到，P9、P12、P14和P11对于TTXLE的确定起到关键作用，尤其P14中的氨基酸序列TTXLE更具说服力。P22、P16和P8对于E6的确定作用也很明确。在氨基酸性质和功能方面，S与T、D与E由于氨基酸性质和功能相似可以相互替换；而E与G也在氨基酸的某些方面有相近的地方，例如结构和溶解性等。因此，虽然P8的反应活性降低，但依然能为4B2所识别。表7利用噬菌体展示肽库对4B2进行4轮生物淘选结果RoundsInputOutput产率(%)Ist1.5x10"4x1052.7x10-42nd1.5x10116x1074x10—23rd1.5x10"9x1076xl(T24th1.5x10112x1061.3xl(T31.4B2表位精确定位为详细描述4B2表位，首先需要验证4B2是否能与ETTLLT发生特异的反应。本发明的策略是，用大肠杆菌融合表达VP2N-末端包含6ETTLLEU的两个15aa重叠肽Y15-l(^KKTEETTLLEDRI！^)和Y15-2(6ETTLLEDRILTTRNG2。)、六肽(6ETTLLEU)及其N-端截短的五肽(7TTLLEU)和四肽(8TLLEU)。通过WesternMot分析，确定六肽(6ETTLLE)是否为该表位活性的基本单元。其次，在基本单元左右两侧分别逐一增加氨基酸残基以融合表达9条寡肽，Rl(6ETTLLEQ12)、R2(6ETTLLE^13)、R3(6ETTLLEDRI14)、R4(6ETTLLEDRIL15)、LI(5pTTLLEu)、L2Gj^ETTLLEn)、L3(3KTEETTLLEn)、L4(2KKTEETTLLEU)和L5dDKKTEETTLLEu),以一验证哪两个氨基酸(左)和(右)均能明显增强该基本单元活性，;現为强化该表位活性的临界氨基酸。结果证明2K3K和Ru为明显增强该基本单元活性的临界氨基酸。在此勤出上，设计表达Y12(2KKTEETTLLEDR13)，经与先前各肽连同Y15-1、L4、R2和Y15-2进行Westernblot分析，比4交验证，确定Y12为该表位最佳活性单元。继而以Y12为参考肽，将其中基本活性单元(2ETTLLEU)的氨基酸残基逐个用丙氨酸(A)替换，Westernblot分析显示，以确定对该表位活性有贡献性的氨基酸，即关键性氨基酸。2.1酶切及产物连接鉴定结果载体pGEX-6p-l经BamHI和Xhol酶切鉴定结果，表明载体已经^皮准确切割，大小在4900bp左右，如图8所示。所设计的5、9和7条短肽插入片段与载体pGEX-6p-l连接后经酶切鉴定结果,设计包括酶切位点在内的片萃更大小约1000bp，如图9、10和11所示。结果证明，外源片段连入正确，可以用于下一步的融合表达及Westernblot分析。2.24B2表位基本活性单元为六肽(6ETTLLEU)融合表达寡肽Y15-1(J)KKTEETTLLEDRIL丄5)、Y15-2(6ETTLLEDRILTTRNG20)、六肽P6(6ETTLLEU)、五肽P5(7TTLLEU)和四肽P4(8TLLE),与4B2进行Westernblot分析。同时设空载体对照。结果显示，Y15-l与4B2呈强反应；Y15-2次之；六肽最弱；五肽、四肽和载体对照均无条带。由此可确定六肽(6ETTLLEn)为表位活性的最小单位(图12，B)。为确保结果的真实性，本试验采用SuperEclPlus超敏显色试剂盒和FUJIFILM发光成像分析仪LAS-3000,对于反应条带进行了高灵敏性分析。2.34B2表位活性最佳单位为12肽2KKTEETTLLEDR13根据前面的实-3^i殳计，融合表达R1(6ETTLLE仏2)、R2(6ETTLLE2E13)、R3(6ETTLLEDRI14)、R4(6ETTLLEDRIL15)、LlG旦ETTLLEn)、L2(4HETTLLE)、L3(3KTEETTLLEU)、L4(2KKTEETTLLE)和L5dDKKTEETTLLEn)，以L5-R4的表达产物(定量)分别与纯化的4B2100ug/lane进行SDS-PAGE(图4-13，A)和Westernblotv(图13，B)分析。结果显示，从L4与R2开始，反应条带随着2{^和1113的分别加入而明显增强，说明2U(和Ru的重要参与对该表位免疫反应均有明显的强化作用。从而可以判定2K3K和1113为对于表位活性基本单元活性增强的临界氨基酸。因此，基本上确定了增强基本单元ETTLLE活性的最小范围。才艮据前面结果,再融合表达Y12(2KKTEETTLLEDRJ,连同Y15-l、L4、R2和Y15-2进行SDS-PAGE(图14，A)和Westernblot(图14，B)分析。结果发现，Y15-1和Y12的条带明显强于其它L4、R2和Y15-2,此结果进一步验证了Y12的强活性。由于要选择氨基酸序列更短且活性最强的表达肽，因此，比较而言，选择Y12(2KKTEETTLLEDRJ作为表位最佳活性单元较为合理。3.4B2表位中关键性氨基酸Glu6(E6)、Thr7(T7)、Thr8(T8)、Leu"(U)和Glu"(En)以Y12为参考肽，对表位中基本活性单元6ETTLLEn的氨基酸逐一用丙氨酸(A)替换，命名为S-1(KKTEATTLLEDR)、S-2(KKTEEATLLEDR)、S-3(KKTEETALLEDR)、S-4(KKTEETTALEDR)、S-5(KKTEETTLAEDR)和S-6(KKTEETTLLADR)。原核表达各置换的短肽并以Westernblot检l全各置换肽的活性消减情况。表达的寡肽和Y12—同进行SDS-PAGE和Westernblot分析，结果显示，S-2、S-3和S-5反应明显减弱，而S-6无反应，说明6ETTLLEn中T7、T8、U和En对该表位均有贡献;其中Eu对该表位活性起决定性作用，一经替换，导致该表位不被4B2所识别(图15)。结合2.4结果，最后确定&、T7、T8、L,。和Eu均为该表位的关键性氨基酸。对VP2蛋白进行同源建模显示，4B2表位所在的VP2蛋白N-末端刚好处于三重轴附近的蛋白底部，并恰好覆盖了病毒粒子上的Ca2+位点。该位置虽然具有隐蔽性，但仍能被特异性抗体识别。因此，单抗4B2可克服FMD诊断的血清型限制，应用于通用型诊断试剂的开发。试验例1本发明单抗的应用效果试验1.包被单抗和检测单抗4吏用浓度的确定采用实施例1中13.1方法包被单抗和检测单抗使用浓度，结果表明当捕获单抗3D91:1000稀释(2.5ng/mL)、生物素标记检测单抗4B2为1:100稀释(0.9ng/ml)时，OD45^值接近1.0而且P/N比值最大。结果如表8所示。表8捕获单抗最佳包被浓度及检测单抗最佳使用浓度方阵滴定结果检测抗体稀释梯度Asial型O型细胞对照Asial型O型细胞对照1000.708961.290060.133820.468620.805070.11512000.593181.125610.111260.366530.716680.09583楊0.507830.895590.092160.313060.566380.088858000.41730.857290.074280.269750.49690.0846616000.310560,693670.08550.204030.458780.0772232000.221880.493070.076160.163310.318640.0693264000.156440.322160.076680.124480.230140.07961128000.114230.223280.071520.100730.161810.06689捕获抗体稀释梯度1000100010002000200020002.敏感性试验将AsialFMDV细胞毒(TCID5。=106'75)和0型FMDV细胞毒(TCID5。=106.5)进行梯度稀释，进行ELISA检测，结果显示，该方法对AsialFMDV细胞毒的最低检出量为1.8x104TCIDs。，对0型FMDV细胞毒的最低检出量为7.9x103TCID5。。如表9所示。_表9敏感性实验测定结果_细胞毒稀释度1:11:101:1001:2001:3001:4001:5001:600Asial1.138960.906440.325840.207320.171290.12750.110040.10116O型1.418450.965790.306310.202890.161550.141770.120550.1119细胞对照0.064310.067020.062370.059970.061890.061020.065690.06744将1:50倍稀释抗Asial型FMDV阳性牛血清、抗0型FMDV阳性豚鼠血清及相应的阴性血清分别与Asial型和0型FMDV等体积混合，37°C水浴2h。用单抗3D9包被好的酶标板，37。C封闭lh后，依次加入上述阻断样品和未阻断的样品，4企测单抗，HRP标记的链霉亲和素，底物显色液，测定OD值。按照文献阻断率％=[(阴性血清阻断OD值-阳性血清阻断OD值)/(阴性血清阻断OD值-空白OD值)]x100%;若阻断率大于50%，则判定为阳性。表IO所示。表io特异性阻断试验口蹄疫病毒来源阻断率％江苏谱系78.56Asial新疆谱系68.15A型A型(疫苗林)58.34O型泛亚语系89.67东南亚谱系79.45中国型74.50同时，用建立的抗原捕获ELISA方法对牛结核病、牛肺疫、牛流热、赤羽病、牛传染性鼻炎(牛传鼻)等抗原进行;险测，设立标准FMDV阳性和阴性对照。结果表明，检测样品全为阴性，无交叉反应发生。3.抗原捕获ELISA方法检测FMDV细胞毒和组织毒53.1抗原捕获ELISA方法检测各个基因型FMDV细胞毒分别用Asial型、0型和A型FMDV各个基因型代表毒抹感染朋K-21细胞后获取13份细胞毒，用抗原捕获ELISA方法进行检测，结果显示13份细胞毒均为阳性，检出率分别为100°/。。样品顺序依次为细胞对照、Asial标准细胞毒、0型标准细胞毒、Asial-1、Asial-2、Asial-3、10Asial-4、Asial-5、Asial-6、泛亚-1、泛亚-2、泛亚-3、东南亚、A型、中国型-1、中国型-2。结杲如表ll所示。表11抗原捕获ELISA方法检测各个基因型FMDV细胞毒反应结果样品OD值OD值样品OD值OD值阴性对照0.107660.10693Asial-60.669290.6735Asial0.770580.75137泛亚-11.450921.320260型1.433271.32598泛亚-21.352191.45247Asial-l0.913350.90147泛亚-30.257410.21494Asial-20.376420,35612东南亚0.811020.83157Asial-30.412560.40852A型(疫苗抹)0.452370.46307Asial-40.612560.62254中国型-l0.610550.63121Asial-50.779010.78924中国型-20.926410.912723.2抗原捕获ELISA方法检测各个基因型FMDV组织毒对本实验室保存的13份FMDV组织病料,用抗原捕获ELISA方法进行检测，结果显示13份细胞毒均为阳性，检出率分别为73.3%。样品顺序依次为阴性对照、Asial标准乳鼠毒、0型标准乳鼠毒、Asial-l、Asial—2、Asial-3、Asial-4、Asial-5、Asial-6、；乏亚-1、；乏亚-2、；乏亚-3、东南亚、中国型-1、中国型-2、中国型-3。表12抗原捕获ELISA方法检测各个基因型FMDV组织毒反应结果样品OD值OD值样品OD值OD值阴性对照0.132090.12113Asial-60.127490.13159Asial0.756230.77973泛亚-11.012431.11145O型0.697210.71483泛亚-20.339760.32795Asial-l0.陽50.80571泛亚-30.357520.36688Asial-20.272510.26625东南亚0.503290.49783Asial-30.591620.57252中国型-10.066560.06742Asial-40.920460.91125中国型-20.146710.14896Asial-50.076290.07458中国型-30.538850.54331序列表-确定稿20090731.txt序列表<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及其识别的抗原表位<130〉KLPI05676<160>2<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211>6<212>PRT<213>Footandmouthdiseasevirus<400>1GluThrThrXLeuGlu15<210>2<211>12<212>PRT<213〉Footandmouthdiseasevirus<400〉2LysLysThrGluGluThrThrLeuLeuGLuAspArg1510权利要求1、一株能分泌抗口蹄疫病毒的非血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系4B2，其微生物保藏号是CGMCCNo.3103。2、由权利要求1所述杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。3、4又利要求2所述单克隆抗体所识别的口^帝疫病毒VP2蛋白N-末端的线性表位的基序，其特征在于该线性表位的基序是由口蹄疫病毒的VP2蛋白N-末端上的氨基^列所组成，其#^*列为SEQIDN0:1所示，其中，X为任意一种氨基酸残基。4、按照权利要求3所述的线性表位的基序，其特征在于其关键性氨基酸残基为Glu6、Thr7、Thr8、Leu"和Glu11;其中，决定性氨基酸残基为Glu11。5、按照权利要求3或4所述的线性表位的基序，其特征在于该表位序列为七个血清型FMDV共享，最佳活性单位是十二肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。6、一抹能分泌抗FMDV非血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系3D9,其孩i生物保藏号是CGMCCNo.3104。7、由权利要求6所述杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体。8、权利要求1或6所述的杂交瘤细胞系在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的用途。9、权利要求2或7所述的单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂或药物中的用途。10、权利要求3或4所述的线性表位的基序在制备诊断、预防或治疗口蹄疫的试剂、疫苗或药物中的用途。全文摘要本发明公开了抗口蹄疫病毒血清型共享单克隆抗体及识别的抗原表位和应用，属于口蹄疫防制领域。本发明获得两株能分泌抗口蹄疫病毒的非血清型依赖性单克隆抗体的杂交瘤细胞系(其微生物保藏号分别是CGMCCNo.3103、CGMCCNo.3104)以及由该杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体4B2和3D9。ELISA及间接免疫荧光检测表明，两株单克隆抗体均属于FMDV共享性单克隆抗体；其中，4B2识别FMDV一个线性表位，3D9识别FMDV一个构象型表位。分别以3D9为捕获抗体，4B2作为检测抗体，采用抗原捕获ELISA方法，可用于FMDV的特异性检测，该检测方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点。文档编号C12N5/20GK101643720SQ20091016134公开日2010年2月10日申请日期2009年7月31日优先权日2009年7月31日发明者力于,于永忠,周国辉申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所