用于检测口蹄疫病毒的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及口蹄疫病毒基因芯片及检测方 法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的以口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性瘆为主要症状的急 性、烈性、接触性传染病，又称为"口疮"、"辟癀" "5号病"等。FMDV主要侵害猪、牛、羊等 主要家畜和其他家养、野生偶蹄动物，宿主范围广泛，易感动物多达70多种。该病传播途径 多，速度快。大多数国家都属于"口蹄疫疫区"，非口蹄疫的国家或区域仅占少数。2013年， 全球口蹄疫疫情集中在亚、非地区以及与亚洲相邻的欧洲部分地区暴发，全球共有44个国 家或地区报告发生口蹄疫疫情或分离到口蹄疫病毒。多次世界范围内的暴发流行，造成巨 大的政治、经济损失。
[0003] FMDV 属于微 RNA 病毒科（Picornaviridae)的 口蹄疫病毒属（Aphthovirus)，与所 有微RNA病毒一样含有单股正链RNA基因组，其长度约8300nt，其功能如同mRNA，编码病毒 聚蛋白。FMDV包括A型、0型、C型、亚洲I (Asial)型、SAT I型、SAT II型和SAT III型7个 血清型，每个血清型又有许多不同的亚型，各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各 亚型之间仅有部分交叉免疫，使得口蹄疫的诊断和防控更加困难。在我国，口蹄疫的流行形 势比较严峻，目前仅分离得到A型、0型和Asia 1型。近年来，A型和0型口蹄疫疫情不断 发生，给养殖户造成重大的经济损失。不同血清型、不同遗传谱系口蹄疫病毒的混杂存在及 周边国家口蹄疫疫情复杂、流行毒株跨境传播的威胁，进一步加大了我国口蹄疫防控的复 杂性和难度。因此，建立一种快速检测口蹄疫病毒及区分血清型的方法有助于该病的防控 和诊治。在动物及其副产品的进出口检疫中也有着重要意义。
[0004] 口蹄疫与水疱性口炎、猪水疱病等疾病临床症状相似，需依靠实验室诊断进行确 诊。病毒分离技术是诊断口蹄疫的金标准，但该方法操作繁琐，且对实验室级别要求严格。 补体结合试验是检测口蹄疫最早的标准化方法，但受到灵敏度的限制。1991年，Meyer等 根据编码的FMDVRNA多聚酶基因序列设计合成了一对引物和探针，首次应用PCR技术对口 蹄疫进行检测，随后出现大量用于口蹄疫检测的PCR方法。随着分子生物学技术的不断发 展，出现了很多新型的诊断技术，例如：免疫层析快速诊断试纸条、核酸杂交技术、寡核苷酸 指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、基因芯片技术等。基因芯片（Gene chip)是由 DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形 成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样 品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判 断样品种类，完成病菌病毒检测和基础研宄等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微 量化、自动化、低成本的优点。Baxi MK等基于口蹄疫病毒的不同血清型及亚型建立了 cDNA 芯片，实现了口蹄疫病毒的高通量检测。寡聚核苷酸芯片比cDNA芯片具有更高的灵敏度和 特异性。寡聚核苷酸芯片在口蹄疫病毒的检测中应用较少。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有检测方法的不足，本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节 时省力并且易于观察结果的微阵列芯片，用于检测口蹄疫病毒，并同时能够区分口蹄疫病 毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型和口蹄疫病毒O型。
[0006] 为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于口蹄疫病毒检测的基因芯片检 测装置，包括：PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH 20、检测芯 片、芯片探针的点样分布、口蹄疫病毒A型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒亚洲I 型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒O型的一条检测探针核苷酸序列、口蹄疫病毒 通用型的一条检测探针核苷酸序列、芯片盖片、芯片围栏、杂交液、杂交阳性对照和杂交盒。
[0007] 采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修 饰的醛基基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控 探针区内设置下述分区：
[0008] 点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针：SEQ ID N05.;
[0009] 杂交阳性质控分区P2,包含至少一个杂交阳性质控探针：SEQ ID NO. 6 ;
[0010] 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；
[0011] 所述待测样品探针区内包括下述至少一个待测样品探针的分区：
[0012] 口蹄疫病毒A型探针分区，
[0013] 口蹄疫病毒亚洲I型探针分区，
[0014] 口蹄疫病毒通用型探针分区，
[0015] 口蹄疫病毒0型探针分区。
[0016] 各个探针序列如下：
[0017] 口蹄疫病毒A型探针：SEQ ID NO. 1 ;
[0018] 口蹄疫病毒亚洲I型探针：SEQ ID NO. 2 ;
[0019] 口蹄疫病毒通用型探针：SEQ ID NO. 3
[0020] 口蹄疫病毒0型探针：SEQ ID NO. 4。
[0021] 利用上述基因芯片检测口蹄疫病毒以及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I 型及口蹄疫病毒〇型的检测方法，具体步骤如下：
[0022] (1)待测样品制备：按照商品化RNA提取试剂盒使用说明书提取待检组织或病毒 的细胞增殖液的全基因组，进行反转录制备待测样品cDNA，用作待测样品DNA ;
[0023] (2) PCR 扩增：25 μ L PCR 反应液包含：rTaq 酶 12.5 μ L、引物 Mix 6.6 μ L、待测样 品DNA 3 μ L、无核酸酶灭菌水2. 9 μ L ;
[0024] 其中，所述引物Mix含有：
[0025] 20 μ mol/L 口蹄疫A型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 7 0.2 μ L，
[0026] 20 μ mol/L 口蹄疫A型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 8 0.2 μ L，
[0027] 20 μ mol/L 口蹄疫亚洲I型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 9 0. 2 μ L，
[0028] 20 ymol/L 口蹄疫亚洲I型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 10 0. 2 μ L，
[0029] 20 μ mol/L 口蹄疫通用型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 11 0.2 μ L，
[0030] 20 ymol/L 口蹄疫通用型病毒特异下游引物SEQ ID NO. 12 0.2 μ L，
[0031] 20 μ mol/L 口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 13 0.2 μ L，
[0032] 20 μ mol/L 口蹄疫0型病毒特异上游引物SEQ ID NO. 14 0.2 μ L，
[0033] 20 μ mol/L PCR 通用上游引物 SEQ ID NO. 15 4 μ L，
[0034] 20 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID NO. 16 I yL ;
[0035] 按如下步骤进行扩增：94°C 5min ;94°C 30sec，58°C 30sec，72°C 25sec 循环 12 次； 94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C 25sec 循环 30 次；72°C IOmin ;
[0036] (3)杂交：首先配制杂交液：杂交缓冲液7. 8 μ L、PCR扩增产物7 μ L、杂交阳性对 照0. 2 μ L，混匀后95°C变性8min，冰上放置5min，然后采用15 μ L杂交液进行杂交；
[0037] (4)结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说 明对照，判定结果。
[0038] 本发明根据我国常见的口蹄疫病毒A型、0型及亚洲I型的基因序列，选择保守区 域设计探针用于口蹄疫病毒的检测。另外，根据三种血清型的差异序列设计探针用于区分 不同血清型。从而可以区分出三种不同的血清型。该检测为口蹄疫疫病的"早发现、早隔 离、早处理"提供了有效保证。
[0039] (1)成功地构建了 FMDV检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选 探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。
[0040] (2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、 灵敏度高，可达IO 2拷贝/ μ U稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
[0041] (3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效 的手段，为今后出入境动物和其副产品的检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进 出境动物检疫工作的需要，控制口蹄疫病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有 十分重要的意义。
【附图说明】
[0042] 图1芯片探针分布不意图；
[0043] 图2 口蹄疫病毒A型杂交结果示意图；
[0044] 图3 口蹄疫病毒亚洲I型杂交结果示意图；
[0045] 图4 口蹄疫病毒0型杂交结果示意图；
[0046] 图中：Pl-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；1- 口蹄疫病毒A型探针分 区；2- 口蹄疫病毒亚洲I型探针分区；3- 口蹄疫病毒通用型探针分区；4- 口蹄疫病毒0型 探针分区；5-水疱性口炎病毒探针分区；6-猪水疱病病毒探针分区；7-蓝舌病病毒探针分 区；8-小反刍兽疫病毒探针分区；N-杂交阴性质控分区；
[0047] 杂交说明：Pl :探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；
[0048] P2 :杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；
[0049] N :杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；
[0050] 口蹄疫A型病毒c DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，1号、 3号探针壳；
[0051] 口蹄疫亚洲I型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外， 2号、3号探针壳；
[0052] 口蹄疫O型病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，3号、 4号探针壳。
【具体实施方式】
[0053] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于 以下实施例。
[0054] 实施例1，本发明是基于对口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型及口蹄疫病毒O 型的细胞增殖，提取病毒基因组。选取不同的特异保守序列设计了 4条寡核苷酸探针，可与 相应的病毒cDNA的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，通用上游引物5' 端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在50°C下进行杂交。根据荧光信号位置、 强度判断杂交结果，以此来鉴定口蹄疫病毒及区分口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型及 口蹄疫病毒O型。根据Genbank网站上公布的口蹄疫病毒不同型的基因序列利用Primer Premier 5. 0 生物软件设计 PCR 引物 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16克隆基因序列，并进行测序、比对分析，选取差异性序列在利用Primer Premier生 物软件设计所述6条特异性寡核苷酸探针，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6。通过上述引物和探针，可快速、特异、敏感的鉴别区分 口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒亚洲I型和口蹄疫病毒0型。
[0055] 每条探针的Y端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列 如下：
[0056] 口蹄疫病毒A型探针SEQ ID NO. 1为：
[0057] 5' -nh2-t15-atgacagtggctcgaatcgcaccgaagttgaaagaag ;
[0058] 口蹄疫病毒亚洲I型探针SEQ ID NO. 2为：
[0059] 5' -nh2-t15