检测葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测葡萄灰皮诺病毒的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测试 剂盒及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄灰皮诺病毒（Grapevine Pinot gris virus，GPGV)属于线形病毒科 (Betaflexiviridae)，纤毛病毒属（Trichovirus,)，病毒粒子为弯曲状，长640_760nm，核 酸为单分子线形正义ssRNA，长约7. 5kb，核酸约占病毒粒子重量的5 %。寄主受GPGV侵 染后，叶片出现变色、卷叶和坏死症状，果实表面出现坏死斑点，葡萄产量和品质明显降低。 GPGV主要通过嫁接传播和机械传播。到目前为止。GPGV在韩国、意大利、斯洛文尼亚、斯洛 伐克、捷克斯洛伐克和希腊被发现。
[0003] 目前，国内外已报道检测植物病毒的方法有指示植物法、分子杂交、ELISA、RT-PCR 和基因芯片技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交 叉污染，出现假阳性结果。RT-qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量 技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针（TaqMan探针），探针 与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过 程。该技术可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其中绝对定量是目前采 用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在RT-qPCR定量检测中，这些外 标准品的制备成为其能否准确定量的关键。RT-qPCR整个过程在全封闭的状态下进行扩增 及产物分析，有效地减少污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵敏度高、自动化程 度高、检测简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。
[0004] 目前RT-qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检 测、线虫检测等诸多领域，但对葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测尚未见公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测葡萄灰皮 诺病毒的寡核苷酸，包括引物和探针。
[0006] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测葡萄灰皮诺 病毒的RT-qPCR检测试剂盒。
[0007] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种检测葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检 测方法。
[0008] 为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一组检测葡萄灰皮诺病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 3所 示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分别为检测葡萄灰皮诺病毒的正义 引物和反义引物，序列SEQ ID No. 3为检测葡萄灰皮诺病毒的荧光探针，具体为：
[0010] 引物 GPGV-FP :5'-ACAATTTACCCCACCACAATGG-3'，（SEQ ID No. 1);
[0011] 引物 GPGV-RP :5，-CAGCTAGGCTGTATTCCTTCACG-3,，（SEQ ID No. 2);
[0012] 探针 GPGV-P :5'-TCATGAATCTTTTAATCCTTCCCTGCCGG-3'，（SEQ ID No. 3);探针的 5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQl。上述引物和探针扩增的目标片 段长度为82bp。
[0013] 为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0014] 本发明提供了一种检测葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测试剂盒，包括以下组分：
[0015] (I) RT-qPCR反应液，其包括序列表SEQ ID No. 1所示的正义引物，序列表SEQ ID No.2所示的反义引物，序列表SEQ ID No.3所示的荧光探针，该探针的5'端标记报告荧光 基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQl ;
[0016] (2)阴性对照：采用无葡萄灰皮诺病毒感染葡萄叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充 分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；
[0017] (3)阳性对照：采用感染葡萄灰皮诺病毒感染葡萄叶片，液氮研磨后，加入DEPC水 充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；。
[0018] 进一步地，上述RT-qPCR反应液还包括常规RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选 地，本发明所述的RT-qPCR反应液还包括：10 XPCR缓冲液（含Mg2+)，dNTP混合物，反转录 酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。
[0019] 为解决第三个技术问题，本发明还提供了检测葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测方 法，包括如下步骤：
[0020] (1)提取样品 RNA ;
[0021] 取携带葡萄灰皮诺病毒的葡萄叶片，经RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取 植物总RNA，也可以使用现有技术中已知的提取RNA的方法进行提取；
[0022] (2)对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增：
[0023] 表I RT-qPCR反应体系
[0024]
【主权项】
1. 一组检测葡萄灰皮诺病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No. 3所示；其中序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分别为检测葡萄 灰皮诺病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No. 3为检测葡萄灰皮诺病毒的荧光探针。
2. 根据权利要求1所述的检测葡萄灰皮诺病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探 针序列SEQ ID No. 3的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1。
3. 权利要求1或2所述的检测葡萄灰皮诺病毒的寡核苷酸在制备检测葡萄灰皮诺病毒 试剂盒中的应用。
4. 一种葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分： (1) RT-qPCR反应液，其包括：序列表SEQ ID No. 1所示的正义引物，序列表SEQ ID No. 2 所示的反义引物，序列表SEQ ID No. 3所示的荧光探针，所述荧光探针的5'端标记报告荧 光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1 ; (2) 阴性对照； (3) 阳性对照。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液还包括：含Mg2+的 PCR缓冲液，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水。
6. -种葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 提取样品RNA ; (2) 对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增；其中，使用序列表SEQ ID No. 1所示的正义 引物，序列表SEQ ID No. 2所示的反义引物，序列表SEQ ID No. 3所示的荧光探针，所述荧 光探针的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1 ; (3) 根据RT-qPCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
【专利摘要】本发明公开了一种检测葡萄灰皮诺病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸。具体地，本发明提供了一组检测葡萄灰皮诺病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测葡萄灰皮诺病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测葡萄灰皮诺病毒的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂盒及其检测方法，可达到准确检测待测样品中GPGV的目的。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-94
【公开号】CN104611467
【申请号】CN201510059445
【发明人】邓丛良, 周琦, 赵晓丽, 边勇, 吕玉峰, 张百怡
【申请人】中华人民共和国北京出入境检验检疫局
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月4日