一种用于检测猪库博病毒的实时荧光定量pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种可用于病毒检测的特异性引物对及探针，以及包括有特异性引物对及探针的定量检测试剂盒，确切讲本发明是猪库博病毒一步法TapMan实时荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]2010年以来我国仔猪腹泻呈现出全国性的大范围爆发流行，以7日龄内的哺乳仔猪多发，其主要症状为水样腹泻、呕吐(呕吐物多伴有母乳)、脱水且极度消瘦，其流行无季节性，病理刨检小肠内鼓气、肠壁变薄，伴有大量寒色液体，腹股沟淋巴结出血肿胀。该病具有传染性，尤以潮湿季节多发，发病率和病死率高达80%?100%，严重影响出栏率，对养猪业危害巨大。
[0003]猪库博病毒为一种小RNA病毒科的新成员，2008年在匈牙利，猪库博病毒标准株(S-1-HUN)从采集自前年猪场的粪便病料中首次被确认，我国猪库博病毒的最早报道为2009年，研究人员对收集自2006-2007年间河北省322份< 15日龄仔猪的粪便样品进行检测发现有97份猪库博阳性，阳性检出率为30%。2010年以来我国大范围爆发的仔猪腹泻病料中猪库博病毒的检出率高达74.9%，该病毒或许是当前我们仔猪腹泻的重要病因之一，所以建立一种能够快速、敏感和特异的检测猪库博病毒的方法对该病的控制至关重要。
[0004]目前仅有猪库博病毒常规RT-PCR的检测技术的报道，且敏感性不够高、检测耗时和易出现假阳性，最终判定任需病毒核苷酸序列的测定，而且不能准确定量病毒在宿主易感组织中的含量。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种可克服现有技术不足，具有特异、敏感、快速和便捷的可用于定量检测猪库博病毒的特异性引物对及探针的检测试剂盒。
[0006]本发明的一种用于检测猪库博病毒的的引物对基因序列为:SEQ ID N0.1和SEQID N0.2。其中:本发明涉及的引物为:
SEQ ID N0.1: (Kub-F) 5’ - AGATATGGACAAACCCTGGCCC -3’
SEQ ID N0.2: (Kub-R) 5’ -GATCGCCTCCTCCATTGTCAGA-3’。
[0007]本发明是一种用于检测猪库博病毒的实时荧光定量PCR试剂盒中包括:序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的引物对和探针序列SEQ ID N0.3。其中探针序列为:
SEQ ID N0.3: (Kub-Probe) 5’-ACTCGAGGCGGCCGCCGACC-3’(5' HEX, 3' TAMRA)。
[0008]为方便使用，本发明的试剂盒内还有:2X0ne Step RT-PCR Buffer III (含dNTPMixture,Mg2+)、TaKaRa Ex Taq HS (5U/μ L)、PrimeScript RT Enzyme Mix II，不含猪库博病毒的RNA样品和作为阳性对照的含有猪库博病毒的RNA样品。
[0009]在具体应用本发明的用于检测猪库博病毒的实时荧光定量PCR试剂盒时，PCR条件为:42°C 15min,95°C lOsec，I 个循环—95°C 10sec,55°C 30sec,72°C 30sec，40 个循环，其中突光信号收集放置在每个循环的72°C 30sec末端。
[0010]本发明的试剂盒是一种一步法TapMan荧光定量PCR检测的试剂盒，本发明的试剂盒应用中是使用5'端带有荧光物质，3'端带有淬灭物质的TapMan探针进行荧光检测，当探针完整时，5'端荧光物质受到3'端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当TapMan探针被分解后，5'端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在PCR反应中探针和模板杂交，延伸是聚合酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，从而可以达到检测PCR产物扩增量的目的。
[0011]利用本发明试剂盒进行猪库博病毒一步法TapMan荧光定量PCR检测，其优点在于，根据猪库博病毒流行株的3D基因保守涉及到两条特异性引物和探针，在该病毒RNA提取的基础上，对组织样品进行荧光定量PCR扩增，实现对猪库博病毒的定量检测。在PCR使用本试剂盒进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。
[0012]本发明的引物对是在对猪库博病毒3D基因序列比对后，根据保守区域优化设计特异性引物和探针。在使用本发明的试剂盒进行检测时，是对猪库博病毒RNA提取后直接进行定量PCR扩增，同时本发明对反应体系及反应条件进行了优化，并可提高了检测的精准度，一步法TapMan荧光定量在扩增完成后可直接进行标准曲线定量起始病毒拷贝数，同时其操作简单快捷，非常适用于田间样品流行病学调查的应用。
[0013]使用本试剂盒进行Real Time RT-PCR反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，敏感性高，并能有效防止污染。
【附图说明】
[0014]图1:含猪库博病毒3D基因序列重组质粒酶切鉴定电泳图，
其中:M:2000bp DNA Marker
O重组质粒pMD-Kobu-3D双酶切鉴定 2)重组质粒pMD-Kobu-3D单酶切线性化。
[0015]图2:猪病毒病毒一步法TapMan荧光定量PCR的扩增曲线，其中:纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数扩增曲线从左到右表示目的RNA的拷贝数分别为3.44X 108-3.44 X 103。
[0016]图3:猪病毒病毒一步法TapMan荧光定量PCR检测标准曲线，其中:纵坐标代表Ct值。横坐标代表样品的拷贝数，相关系数R2:0.997，扩增效率Eff:98.1%,Y=-3.368*L0G (X) +45.46
图4:是检测方法特异性的扩增曲线。
[0017]图5:是检测方法敏感性的扩增曲线，其中:纵坐标代表荧光量，横坐标代表循环数，扩增曲线自左到右的RNA的拷贝数分别为I X 17-1 X 10°。
【具体实施方式】
[0018]以下结合具体实例和【附图说明】对本发明做进一步说明
1.猪库博病毒荧光定量PCR引物的设计与合成
利用已知的猪库博病毒3D基因序列比对后,根据保守区域利用Primer Express3.0软件设计引物和探针，送宝生物工程(大连)有限公司合成。上下游引物及探针分别为:
SEQ ID N0.1: (Kub-F) 5’ -TCCTTAAACACAACAAGGGAGATATGG-3’
SEQ ID N0.2: (Kub-R) 5’ -GATCGCCTCCTCCATTGTCAGA-3’
SEQ ID N0.3: (Kub-Probe) 5，-ACTCGAGGCGGCCGCCGACC-3’(5' HEX, 3' TAMRA)
2.标准品的制备
(1)3D基因的扩增及克隆鉴定
参考猪库博病毒在NCBI上登陆的序列，通过比较分析后，设计出能扩增3D基因的部分序列的上下游引物，送宝生物工程(大连)有限公司合成。上下游引物分别为:
SEQ ID N0.4:(Kub-3DF) 5’ - TGGACGACCAGCTCTTCCTTAAACAC-3’