一种日本囊对虾g642a单核苷酸多态性位点的筛选及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及日本囊对虾，尤其是涉及一种日本囊对虾G642A单核苷酸多态性位点 的筛选及检测方法。
【背景技术】
[0002] 日本囊对奸（Marsupenaeus japonicus)分布于印度、西太平洋地区，在我国主 要分布在长江口以南近海。其肉质鲜嫩可口，可活体运输，且销售价格高，是我国主要的 养殖虾类之一。目前我国用于养殖的日本囊对虾苗种基本是未经选育的海捕野生亲虾 的后代，苗种的生长速度、抗病能力参差不齐，养殖户经常因为苗种质量问题导致养殖失 败。开展日本囊对虾的品种选育有利于其产业的可持续和健康发展。日本囊对虾因为特 殊的纳精囊结构，精荚移植技术至今未能有效突破，选育个体和家系系谱需要大量的DNA 分子标记才能准确鉴定。Jerry等人曾开展过日本囊对虾谱系鉴定工作，因为采用的微卫 星标记数量有限且无效等位基因等因素导致谱系鉴定准确率不到50% (Moore S S，Whan V,Davis G P, et al. The development and application of genetic markers for the Kuruma prawn Penaeus japonicus[J].Aquaculture, 1999, 173(1): 19-32)。可见足够 数量DNA分子标记是日本囊对虾个体识别、系谱鉴定的重要前提保障。然而，与其他养殖 对虾种类相比，目前日本囊对虾虽然已有随机扩增多态性DNA标记和微卫星DNA标记开 发的报道，但标记的数量和质量尚不能满足系谱鉴定、遗传连锁图谱等研究的需求（宋林 生，相建海，李晨曦，等.日本对虾野生种群和养殖种群遗传结构的RAH)标记研究[J].海 洋与湖沼，1999(3) :261-266 ;庄志猛，孔杰，石拓，等.日本对虾野生和养殖群体遗传多 样性的 RAPD 分析[J]·自然科学进展，2001 (3):28-33 ;Zhao Y, Li Q.Characterization of expressed sequence tag - derived microsatellites from the kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus[J]. Molecular ecology notes,2007,7 (6):1248-1250)〇
[0003] 作为新一代的DNA分子标记，单核苷酸多态性标记是基因组中含量最丰富的 分子标记，并且遗传稳定性高、分型准确，易于实现高通量、自动化的检测，是当前日本 囊对虾选育群体遗传背景调查、个体选育、家系系谱鉴定和高密度遗传连锁图谱构建的 首选DNA分子标记之一。但日本囊对虾基因组DNA信息匮乏，有关其单核苷酸多态性 标记开发、应用的研究尚未见报道。在对奸科中，Yang Yu等人和Matthew Baranski等 人分别报道 了凡纳滨对奸（Litopenaeus vannamei) (Yu Y, Wei J, Zhang X，et al. SNP Discovery in the Transcriptome of White Pacific Shrimp Litopenaeus vannamei by Next Generation Sequencing [J]· PloS one, 2014, 9(1) :e87218)和斑节对虫下（Penaeus monodon) (Baranski M, Gopikrishna G, Robinson N A, et al. The Development of a High Density Linkage Map for Black Tiger Shrimp(Penaeus monodon)Based on cSNPs[J]. PloS one，2014, 9(1) :e85413)的SNP标记筛选，所采用的检测分型方法分别是重新测序分 型和基因芯片分型，标记筛选、验证及应用的成本较高，并且由于对虾种类的不同，二位学 者所筛选的标记不能直接应用于日本囊对虾的相关研究中。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种日本囊对虾G642A单核苷酸多态性位点的筛选及检 测方法。
[0005] 本发明包括以下步骤：
[0006] 1)提取20个日本囊对虾个体的肝胰腺总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接日 本囊对虾肝胰腺参考转录本，比对定位测序读端（reads)到参考转录本筛查单核苷酸多态 性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上、次要等位基因频率高 于20%的位点为候选序列；
[0007] 2)其候选complll69的基因序列为：
[0008] GATGTCGTATTAATGTCTTTATCCAATTAAAAAATCATCATTTATAATTCTAAGCATCTGACGACTATA ATATGTAGGTATAACATTGTACTTATACATGGAGAGTCGAAATCTTGAATCATTTAACCTGTTCCTACAATATCACA AGAGACAAGTAATTGAACCAATCACAATCACAAAAGTAAAGGAAAGAAAGATAGAAAAAAAAAGCAAGCGAAGGAGA AATACATATAAATGTTTCCAACTCTTCCCAACCGCCTTTTAGAAGCGCGCCATTTTTTTTACTTCCTGCGCGCGCAT TCGCTGGCGTACAAATTGTTAATCTGGTTGGCGTCGCTCTGCTCCATGTGATCCTTGTCGTAGGCCTCGACGAGAAT CACGTTAGGATCCGTGGGCACGATGGTTTCGGCGACGCCCCAGTTCACGGAGAAGGAGTAGGTGCCGTAGTGCATGA TGCTCTCGTAGTTGTATCCTTCGCCCACGTACTGCCAGTAGGAGTCCTTGTTGAACTGGGACTCCATGCCAGGCTGC ACATTTTCGAAGTGAATAGTGACGTAGTAGTCGCGGTCGTTACGGGTGTGCTCGTGGTAGAAGCCGACAGCGTGCAT GAGCTCGTGGATGGCCGTGCCCTTGTAGATGCAGCCGTTGCTGTCTAGAGAGACCCTCTGCTTGCCTCCAATGGTGC CTACGTATGACCAGCATCCGCTGTCGTTCGTGACGATTTCGATGTAGTTGCCCTGAGTGGTTCTCTCGACGAAGCGG ATGCAGGTGCGGGCGTGGAAGTCGTCCATCGCGGAGAGGATGAGGGACCTCTGGTAGCTGGTGACAGAACTGCCAAA CACATAGGGAACGACTCCACCGGGCCACAAGTACTGCTCCCCAAGGATGGCAGCGCGTTCCTTCCCTGGTTCCTGTC CTGCAATACCCTTAATGTCACCCTGGAAGAGGTCAGGGTTGTACATGGCCTGAGCCGCCCTTGGGACAACAGGGGTC GCGCCGGCCACGGCCACGACTGCAAGTAAGGCAACGAGCAACATGCTGGTGCGAAGATGAAGGAGAAAGAGAGGAAA CGTGT，其中加粗、加下划线的碱基为候选G642A_SNP位点；
[0009] 3)米用PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法设计特 异性引物为：
[0010] 正链引物一 ：5, -TAAAACGTGCCCTTGTAGATGAAG-3,；
[0011] 正链引物二：5 ' -AAAACCCCTAAAACGTGCCCTTGTAGATTCAA-3 ' ；
[0012] 负链引物：5' -TTCGTCGAGAGAACCACT-3' ；
[0013] 4)提取日本囊对虾背部肌肉的基因组DNA，将其稀释为50ng/yL;
[0014] 5) PCR 扩增；
[0015] 在步骤5)中，所述PCR扩增的PCR反应体系为30 μ L，包括50ng/μ L日本囊对虾 基因组DNA溶液lμL，10XPCRbuf?er3μL，2·5mMdNTPMixs2·4μL，25mMMgCl 24μL， 5U/μ L Taq DNA聚合酶0.15 μ L，IOuM正链引物一、正链引物二及反链引物各0.5 μ L，加 CldH2O 至 30yL;其 PCR 反应程序为：94°C变性 IOmin ;94°C 30sec，6(TC 30sec，72°C 30sec， 40个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0016] 6)聚丙酰胺凝胶电泳检测分型：将PCR扩增反应产物进行6%变性聚丙酰胺凝胶 电泳，并使用银染进行检测分型，在凝胶成像系统下观察，若某一个单核苷酸多态性位点在 不同的个体中可以扩增出长度差异为8个碱基大小的2种片段，则可认为该位点为多态位 点，其中单个条带的个体为纯合体，两个条带的个体为杂合体，可根据片段长度准确判定个 体的基因型。
[0017] 本发明米用 PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法 设计特异性引物，可方便、快捷通过聚丙酰胺凝胶电泳进行日本囊对虾单核苷酸多态性标 记验证及基因分型，并具有筛选检测费用低、操作简便快速等优点，填补了日本囊对虾在单 核苷酸多态性标记筛选及应用等研究上的空白，有利于日本囊对虾系谱鉴定、遗传连锁图 谱构建等研究开展。另外，本发明可以在没有已知的日本囊对虾基因组DNA单核苷酸多态 性位点的信息下，通过转录组混合样测序，利用生物信息学分析筛选G642A单核苷酸多态 性位点；并采用PAMSA方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成日 本囊对虾G642A单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快 速。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明实施例1提供的单核苷酸多态位点G642A_SNP对日本囊对虾24个 个体的检测图谱（编号1?24是日本囊对虾24个个体，AA、AG、GG是不同个体的基因型， 100bp、150bp是Marker不同片段的长度）
[0019] 图2是本发明实施例2提供的单核苷酸多态位点G642A_SNP对日本囊对虾G642A_ SNP GG型个体测序峰图。
[0020] 图3是本发明实施例2提供的单核苷酸多态位点G642A_SNP对日本囊对虾G642A_ SNP AG型个体测序峰图。
[0021] 图4是本发明实施例2提供的单核苷酸多态位点G642A_SNP对日本囊对虾G642A_ SNP AA型个体测序峰图。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
[0023] 首先提取日本囊对虾肝胰腺的混合样的总RNA，转录组测序，拼接日本囊对虾肝胰 腺参考转录本，比对定位测序读端（reads)到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛 选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上、次要等位基因频率高于20%的位 点为候选序列；米用 PAMSA(PCR amplification of multiple specific alleles)方法来 设计候选序列的特异性引物；提取日本囊对虾背部肌肉基因组DNA并稀释备用，使用设计 的特异性引物对不同个体的日本囊对虾基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行6 %的变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并根据电泳片段长度不同确定不同个体的基因型。
[0024] 实施例1 :
[0025] 1、利用生物信息学分析，获得含有候选单核苷酸多态位点的拼接序列，具体过程 如下：首先进行混合样品的日本囊对虾肝胰腺的转录组测序，并使用trinity软件按默认 参数拼接肝胰腺参考转录本，使用BWA软件按默认参数比对定位转录组测序