一种日本囊对虾放流效果的评估方法
【专利摘要】本发明涉及一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：通过对母性遗传的线粒体序列的扩增和测序，运用相关软件分析遗传距离，系统建树，单倍型分析等，分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率。通过选定一种或者几种具有特异分子标记的特定母虾来繁育放流用的子一代小虾，从而可以在回捕群体中测定个体所占的比例，与放流前这些分子标记的比例相比较，就可以确定该批次的放流效果。本发明工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，本发明还可用于多年连续监测。
【专利说明】一种日本囊对虾放流效果的评估方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海水动物增殖放流领域，特别涉及一种日本囊对虾放流效果的评估方 法。
【背景技术】
[0002] 日本囊对奸，又称日本对奸（Kuruma prawn)，学名 Marsupenaeus japonicas,别 名车虾、斑节虾、竹节虾，在分类学上隶属于甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。原 产日本、中国、菲律宾、澳大利亚等国，广泛分布于印度、西太平洋地区，主要在日本列岛、南 非红海、阿拉伯湾、孟加拉湾日本及我国等海区，以日本的沿海数量最多。栖息地底质以沙 质底为主，有潜沙习性，在自然海域，自仔虾期就潜沙，涨潮时出来觅食，退潮后就潜入浅水 的沙中，当体长达2.5?3cm，逐渐改为晚上活动觅食，白天潜入沙中；分布区的底温范围为 16?31°C，底层盐度范围在28?34之间；没有长距离洄游现象，仅在小范围内移动；不同 生活时期的分布区域有所差异，幼虾主要分布在盐度较低、沙质底的河口水域，随着个体的 成长，逐步移向深水区；产卵期较长，周年均有性成熟个体的出现，但主要产卵期为12?3 月份；产卵盛期，雌性大于雄性，其它时期个体大小大致相等；雌虾体长和体重范围分别为 50?200mm和4?95g，雄ilH本长和体重范围分别为50?175mm和4?57g ;不同的生长 阶段日本囊对虾的饵料组成也不同，总体上以摄食底栖生物为主，兼食底层浮游动物和游 泳动物。
[0003] 日本囊对虾是我国海水虾类养殖的主要种类之一，特别是近年来在对虾养殖业深 受病害侵害的情况下，日本囊对虾以其相对抗病力较强、适应性广、经济效益高、离水性较 好以及适于长距离运输等优点倍受养殖业者的青睐。近年来，由于捕捞强度的不断加大、生 态变迁、水域污染、病害频发以及人工养殖业对野生日本囊对虾的盲目需求等综合因素的 影响，日本囊对虾野生资源数量急剧萎缩。为保护、恢复日本囊对虾种群和渔业资源，大规 模种苗放流后日本囊对虾资源量得到了一定的恢复。不过由于无法准确区分回捕群体中放 流个体和野生个体及数量，因而无法科学评估放流群体对野生资源的补充水平，分析野生 资源的动态变化并制定科学的放流规划，这是日本囊对虾放流迫切需要解决的重大问题。
[0004] 基于线粒体DNA的进化速率为核DNA的5-10倍，筛选到可代表种内变异的分子标 记的概率较高；线粒体为母性遗传，重组率极低，还可应用于分析特定放流群体的后代，可 避免由杂交原因引入的混淆。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种日本囊对虾放流效果的评估方法，该方法 工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日本囊对虾种群资 源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，还可用于多年连续监测。
[0006] 本发明的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括：
[0007] (1)采集日本囊对虾放流区域的野生群体和准备用于放流的繁育群体，选用线粒 体序列中的片段作为研究对象，通过PCR扩增和测序，分析野生群体和繁育群体的序列差 异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率；
[0008] (2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列 特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围（根据日本囊对 虾的自然繁育周期）；
[0009] (3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记 的母虾用于人工繁育放流用的子一代；
[0010] (4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个 体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾 生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
[0011] 所述步骤（1)中的线粒体序列为细胞色素B基因DNA序列、D-loop区序列或C0I 序列。
[0012] 所述细胞色素B基因DNA序列如SEQ ID N0:1所示；对应的PCR扩增引物 MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R序列如SEQ ID N0:2和N0:3所示。用DNA测序的方法确定检测样 本的分子标记。测定的每个个体的CYTB基因序列的碱基与序列有少量差异，从而构成各种 不同的单倍型。
[0013] 所述步骤⑴中的PCR反应体系为：30yL反应体系，其中包括3yL10XPCR缓 冲液，引物的浓度均为1〇μΜ，上游引物和下游引物分别为0. 5yL，lyL2. 5mM each dNTP， 0· 5 μ LTaq DNA聚合酶，0· 5 μ L DNA模板；补充23. 5 μ L去离子水至30 μ L。
[0014] 所述步骤（1)中的PCR反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火 45心721：延伸70 8，共28个循环，最后721：延伸71^11，101：保存并结束程序。
[0015] 所述步骤（2)中的变动范围要求不超过5%。
[0016] 所述步骤（3)中放流前对增殖群体的母本、子代预先进行检测，以确定选定的分 子标记的有效性、可检出性，并确定子一代携带的分子标记与用于繁育的母虾一致。
[0017] 连续多年对分子标记进行追踪检测，评估该批次放流的长期效果。
[0018] 不同批次的放流选用不同的分子标记，以分别评估各个批次的放流效果。
[0019] 不同分子标记的探测根据实际需要可以采用直接测序、荧光定量PCR、寡核苷酸探 针、限制性酶切等方法。
[0020] 本发明通过对母性遗传的线粒体上细胞色素B基因DNA序列的扩增和测序，运用 相关软件分析遗传距离，系统建树，单倍型分析等，分析野生群体和繁育群体的序列差异和 单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率。通过选定一种或者几种具有特异分子标记的特 定母虾来繁育放流用的子一代小虾，从而可以在回捕群体中测定具有这些特异分子标记的 个体所占的比例（群体内频率），与放流前这些分子标记的比例相比较，就可以估算放流群 体对该区域所有日本囊对虾生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
[0021] 有益效果
[0022] 本发明工艺简单，成本低，在此方法基础上制定科学的放流规划、有效促进野生日 本囊对虾种群资源恢复，对于放流个体的子代也同样可以检测，本发明还可用于多年连续 监测。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0024] 实施例1
[0025] 日本囊对虾DNA提取和PCR :
[0026] (1)提取 DNA:Trizol 法提取。
[0027] A.取 1000 μ LTris-cl 加入 2ml 离心管中；
[0028] B.取适量的组织（约2_3mg)，并用已经消毒后的剪刀充分剪碎；
[0029] C.浸泡 45min 后，4°C，12000rpm，lOmim ;
[0030] D.弃上清，加入600μ L Tris-buffer，50y L10% SDS，7y L蛋白酶K，55°C水浴2h， 直至完全消化，溶液澄清；
[0031] E.加入350 μ L苯酚，350 μ L氯仿：异戊醇（24:1)，振荡至完全混匀；4 °C， 12000rpm,lOmim ；
[0032] F.取上清于新的2ml离心管中，加入与上清等体积的氯仿：异戊醇（24:1)，振荡至 完全混勻；4°C，12000rpm，lOmim ;
[0033] G.取上清于新的1. 5ml离心管中，加入2倍上清体积的冰无水乙醇，充分混匀后， 于-20°C下静置lh，4°C，12000rpm，15mim，弃上清，室温晾干；
[0034] H.加入 60 μ L ddH20, _2(TC 保存。
[0035] (2)PCR反应体系为：30 μ L反应体系，其中包括3 μ L10XPCR缓冲液、引物的浓 度均为ΙΟμΜ，上游引物和下游引物分别为0. 5yL，lyL dNTP，0. 5yL Taq DNA聚合酶， 0· 5 μ L DNA模板；补充24 μ L去离子水至30 μ L。
[0036] 扩增程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火45s，，72°C延伸70s，，最 后72°C延伸7min，KTC保存并结束程序。
[0037] 技术分析：
[0038] (1)分析野生群体和繁育群体的序列差异和单倍型分布，统计各单倍型的群体内 频率；
[0039] (2)筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列 特异性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围，以变动范围不超 过5%为宜；
[0040] (3)选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记 的母虾用于人工繁育放流用的子一代；
[0041] (4)在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个 体在回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾 生态量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
[0042] 日本囊对虾CYTB测序所得序列用于分析的片段为1136个碱基对，从中截取测序 可信度高，有代表性的731个碱基对的片段作为应用对象，一共发现74个多态性位点，得到 46个单倍型。从中选取5个单倍型（5个单倍型具体序列为如SEQ ID NO:4-8所示），放流 前预备调查中其对应的个体占全部调查基础野生个体的比例范围为6. 3?9. 7%，利用该 5个单倍型的母虾人工繁育的小虾用于放流，放流后第一次回捕调查结果显示，具备该5个 单倍型分子标记的个体占总回捕个体的16.6%。
[0001] 说明书核苷酸和氨基酸序列表 SEQUENCE LISTING <110>中国水产科学研究院东海水产研究所 <120> -种日本囊对虾放流效果的评估方法 <130〉 1 <160> 8 <170^ Palcnlln version 3.3 <210 1 <211> 1247 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1 tlaclaacac Ulltllggl cctllacgci laicalctla aiaalgacaa taccaattcg 60 laaalclcac cccUallla aaallclaaa iggagcagla gtcgalUac cagccccagc 120 caalaillcl acaclllgaa atlUggglc Iclcltaggt tlatglUag laatccaaat 180 tgllaclggg ctciuuag cialacacia tacagcccac gugaccltg cauuccag 240 tglagclcac dltgccgag algllaatta tggUgaclc dacgaaclc tcacgccaa 300 tgglgculcc tlctlcltla UlgcLLata tatgcacaca ggacgaggla tUattalgg ttccLlccu laccttcacg (cigatcagi aggagUgia attetaette cglgaiggc 420 aaclgccltc clLggUatg tccllccclg agglcagala Iccitclgag gagcaaclgl 480 caLlactacH； cUlluLcgg ccaLccctUi taUgggcua galtiagtec aatgacitilg 540 aggaggtttc gcagtagata acgcaacact aacacgcttc ttacctttc sctttctgtt 600 cxcaUcalt gtagcagcag clacaalcal IcacaltcU iUattcacc aaacaggtlc 660 laacaalccc cUtggaalcg ttagaaalgL agataaagta caltccalc dliitutac 720 allcaaagac atcaccggal ttatcgtaat actaaclgcc cliattttat taaclUaci 780 [0002] aaaccctlal (ttclaggag acccagacaa LLttaltccc g;taacccll Lagttacccc 840 ggcccaialc cagcccgaal ggtalUlU alllgcaial gccatcttgc gatctaU.cc 900 laalaagtia gggggagtaa UgccLlggt tataiclatc UgaltcUc Icatctlacc 960 Utlacacal gcagciaaat Ucggagcci lacaUUac cclcllaacc agaccatatt 1020 cigalcliia glaaglalig lallcclacl lacaigaall ggagclcgcc cigligaaga 1080 IccttatgU atlacaggac aaatcclaac cglgctUat Uclcatatl acaltaltaa 1140 cccaclcacc cicatctggl gagalaaaal aclagallaa gltaltiggc tgacaggaaa 1200 gcacglgttt tgaaagclcg ctaiaggggl tgaalcctc feataac 1247 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <4()0> 2 gatllaccag teccagc 17 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 ggalltgtcc tglaataaca tiag 24 <210> 4 <211> 731 <212> DNA <213>人工序列 <4()()> 4 aggaatagal qjlaagalgg catatgcaaa tiaaaaatac Gittcgggct ggiatgggc 60 cgggglaacl aaagggllag cgggaalaaa allglclggg tcicclaaaa giiaagggll 120
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[0005] <210> 7 <211〉 731 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7 aggaalagat cgcaagatgg calalgcaaa laaaaaatac caitcgggct ggatatgggc ({) cgggglaacl aiagggltag cgggaataaa altgtctggg tlcctaaaa gilaagggtl 120 tagtaaagtt aataaaataa gggragttag tattacgata aitccggtga gtctttgaa 180 tgtaaaataa ggatggaatg gtactttatc tacatttcta acgatlccta ggggatigtt 240 agaacctgll Igglgaataa aaagaatgtg aatgaligta gdgctgcla caatgaatgg 300 gaacagaaag igaaaggtaa agaagcgtgt lagtgttgcg Uatctactg cgaaacclcc 360 Icaaattcat tggactaaat ciggiccaat ataagggatg gccgagaaaa ggtlagtaat 420 gacagtlgct cctcagaagg alatclgacc tcagggaagg acataaccaa ggaaggcagl 480 tgccattacg agaagtagaa ttacaaclcc lactgaicag gcgigaaggt aaaggaagga 540 accataaiaa atacclcgcc ctgtglgcat ataiaagcaa ataaagaaga aggaggcacc 600 a^ggcgigg agagttcgta ggagtcaacc ataattaaca tctcggcaaa tgtgagclac 660 actggaaaat gcaaggtcta cgtgggctgt atagtgtata gctaaaaaga gcccagtaac 720 aalUggalt a 731 <210> 8 <211〉 731 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 aggaalagal cgcaagatgg calalgcaaa laaaaaatac catlcgggcl ggalalgggc 60 aggggtaact saagggttag cgggaataaa aitgtctggg Ctcctaaaa gitaagggtt 120
[0006]
【权利要求】
1. 一种日本囊对虾放流效果的评估方法，包括： (1) 采集日本囊对虾放流区域的野生群体和准备用于放流的繁育群体，选用线粒体序 列中的片段作为研究对象，通过PCR扩增和测序，分析野生群体和繁育群体的序列差异和 单倍型分布，统计各单倍型的群体内频率； (2) 筛选出代表日本囊对虾种内差异的单倍型作为分子标记，确定该标记的序列特异 性，计算分子标记在野生群体中所占的比例，定期监测比例变动范围； (3) 选定在野生群体中历年所占比例变动小的分子标记，将带有选定的分子标记的母 虾用于人工繁育放流用的子一代； (4) 在捕捞期回捕放流区域的个体，检测分子标记，计算带有选定的分子标记的个体在 回捕群体中的比例，确定比例变动情况，从而估算放流群体对该区域所有日本囊对虾生态 量的贡献值，最终确定该批次的放流效果。
2. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步 骤（1)中的线粒体序列为细胞色素B基因DNA序列、D-loop区序列或COI序列。
3. 根据权利要求2所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述细 胞色素B基因DNA序列如SEQ ID NO: 1所示；对应的PCR扩增引物MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R 序列如SEQ ID NO:2和NO:3所示。
4. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步 骤⑴中的PCR反应体系为：30μ?反应体系，其中包括SyLlOXPCR缓冲液，引物的浓度 均为ΙΟμΜ，上游引物和下游引物分别为0. 5yL，lyL2. 5mM each dNTP，0. 5yL Taq DNA聚 合酶，0. 5 μ L DNA模板；补充23. 5 μ L去离子水至30 μ L。
5. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步 骤（1)中的PCR反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s，50°C退火45s，72°C延伸70s， 共28个循环，最后72°C延伸7min，10°C保存并结束程序。
6. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步 骤（2)中的变动范围要求不超过5%。
7. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：所述步 骤（3)中放流前对增殖群体的母本、子代预先进行检测，以确定选定的分子标记的有效性、 可检出性，并确定子一代携带的分子标记与用于繁育的母虾一致。
8. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：连续多 年对分子标记进行追踪检测，评估该批次放流的长期效果。
9. 根据权利要求1所述的一种日本囊对虾放流效果的评估方法，其特征在于：不同批 次的放流选用不同的分子标记，以分别评估各个批次的放流效果。
【文档编号】C12Q1/68GK104099412SQ201410247079
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月5日 优先权日:2014年6月5日
【发明者】蒋科技, 胡敬环, 张凤英, 宋炜, 马凌波, 程家骅, 李圣法, 姜亚洲, 马春艳, 张丹, 房娅博, 乔振国 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所