与日本囊对虾耐热性相关的snp标记及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产养殖中的虾类耐热群体的检测，尤其是涉及一种与日本囊对虾耐 热性相关的SNP标记及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 日本囊对it!下(Marsupenaeus japonicus)的英文名为Kuruma shrimp，俗称斑节!ti下、 竹节虾、花尾虾、蓝尾虾，是中国海水虾类养殖的重要种类。日本囊对虾属亚热带种类，最适 温度范围为25~30°C，在8~10°C停止摄食，5°C以下死亡，高于32°C生活不正常。日本囊对 虾的养殖受温度影响明显，超过一定的水温临界值，会造成较大面积死亡，在南方地区夏季 高温养殖受限。近年来，为了提高日本囊对虾的生长速度和养殖效率，已有养殖户尝试在高 温后期适当提前放苗，但目前缺少耐高温性状的评价方法以及高温养殖的技术标准，提前 放苗的养殖结果很不稳定。因此亟需深入了解日本囊对虾的耐高温性状，为南方地区的高 温季节养殖和耐高温品系的选育积累生物学资料。
[0003] 国内外关于虾类的耐温研究见于南极磷虾、罗氏沼虾、中国对虾等，开展了温度对 虾类代谢率、临界温度、耗氧率等影响的研究。在日本囊对虾方面，有学者报道了温度对消 化酶活性、生长和成活率(江敏，臧维玲.温度对日本对虾幼虾生长与耗氧的影响[J].渔业 现代化，2002(3) :14-16.)的影响以及成虾和仔虾(李润寅，陈介康，姜洪亮，等.日本对虾仔 虾的温度适宜性实验研究[J].水产科学，2001，20(3): 17-18)对温度适应性的差异。单核苷 酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)即指基因组水平上由单个核苷酸的变 异所引起的DNA序列多态性，作为第三代分子标记，具有数量众多、分布广泛、遗传稳定性更 高、分型方法简易等优势，已经在育种领域具有十分重要的应用价值。在水产动物中研究人 员筛选了一系列跟生长、抗病、抗逆相关的SNP分子标记。在日本囊对虾耐热方面的研究中， 很少有耐热相关SNP筛选与检测的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记及其检测方法。
[0005] 本发明首先利用直接测序法提供一种与日本囊对虾热耐受性相关的SNP标记，所 述与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记是核酸序列为SEQ ID NO. 1的HSP60基因的第3289位 点，其碱基为A或G。
[0006] 本发明还提供一种聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测方法，对直接测 序法得到的MjHSP60基因 3289A/G进行检测，确定该位点与热耐受性状的相关性。
[0007] 用于PCR-RFLP检测的引物，其上下游序列分别为：
[0008] HSP60NF5：CCGTGGCTACATCTCGC；
[0009] HSP60NR5:TCTTCAAGCGGTTCACTACA。
[0010] 与日本囊对虾耐热性相关的SNP标记的检测方法，包括以下步骤：
[0011 ] 1)日本囊对虾耐热性实验步骤；
[0012] 2)热耐受值(Upper thermal tolerance，UTT)的计算步骤；
[0013 ] 3)利用PCR-RFLP技术进行基因分型步骤；
[0014] 4)不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析步骤。
[0015] 在步骤1)中，所述日本囊对虾耐热性实验步骤如下：
[0016] 将日本囊对虾在33°C水体中暂养Id后，以l°C/2h的速率升温直至所有对虾死亡， 找出38°C为死亡率较高拐点；以33°C为初始温度，选取经Id暂养正常的个体放入实验池，以 l°C/2h的速率升温至38°C;38°C之后以0.5°C/4h的速率升温直至所有日本囊对虾死亡;实 验中保持充气，以确保水池中各个部位温度同步;对虾死亡标准为对虾背部朝下倒于水体 无法恢复正常的姿势或躯体始终保持90°弯曲；记录死亡时间、死亡温度、体重，然后装入封 口袋中，以供实验结束后保存样品，保证每l〇min捞取一次死虾并做好记录，当池子中对虾 死亡总数达到100 %时结束耐热实验。
[0017] 在步骤2)中，所述热耐受值(Upper thermal tolerance,UTT)的计算按以下公式： [0018] ?-Ι
[0019]式中，i为分钟数，Ti为在第i分钟的温度，To为实验初始温度33°C，k为个体存活的 分钟数。
[0020]在步骤3)中，所述利用PCR-RFLP技术进行基因分型的具体方法可为：
[0021] a)随机选取40~80尾体重在2.3~3.3g之间的已获得热耐受性状评定指标UTT值 的日本囊对虾，取每尾虾的背部肌肉，置于无水乙醇中，-20°C保存，用于基因组DNA的提取。 提取基因组DNA后，利用特异性引物HSP60F5和HSP60R5进行PCR扩增，扩增产物经限制性内 切酶Bstn酶切，根据酶切后电泳条带确定不同的基因型。酶切体系如下：
[0022]
[0023] 反应条件:37°C水浴，15min;
[0024] b)利用PCR-RFLP方法对SNP标记3289A/G进行分型，经BstXI酶切后，3289A型等位 基因产生长度分别为333bp和68bp的两种片段，而3289G由于不能为酶所识别，基因片 段长度仍为401bp;酶切产物经1.5%电泳检测后，发现存在2种基因型：3289AA基因型和 3289AG基因型。
[0025] 在步骤4)中，所述不同基因型日本囊对虾个体热耐受性分析的具体方法为：
[0026]对具不同基因型的日本囊对虾个体(2.3~3.3g)进行热耐受性方差分析对比。 [0027] 本发明利用直接测序法、PCR-RFLP法给出MjHSP60基因多态性，并对SNP多态性与 日本囊对虾热耐受性进行关联分析，为筛选耐高温的SNP分子标记，开展日本囊对虾耐热品 系的分子育种提供理论参考。
【附图说明】
[0028]图1为日本囊对虾及拟穴青蟹HSP60基因组织结构图对比。在图1中，方框代表外显 子，直线代表内含子。
[0029]图2为位点3289A/G不同基因型电泳结果图。
【具体实施方式】
[0030] 本发明根据日本囊对虾MjHSP60mRNA(GenBank登录号：JQ972715.1)和拟穴青蟹 (3〇711&口&瓜111&1]1〇8&;[11)批?60基因全序列(66111^111<:登录号:几 262230.1)，在相邻外显子两 端设计引物，最后利用交叉引物验证是否有未扩出的内含子。通过对所有扩增片段的重叠 比对和拼接获得MjHSP60基因。该基因 DNA全长4637bp，共含8个外显子和7个内含子，其中 0RF长度为1740bp，编码579个氨基酸。
[0031]本发明根据M jHSP60基因 SNP多态性与日本囊对虾热耐受性的相关性，初步筛选出 第3289位点，其碱基为A或G。并利用PCR-RFLP技术对其验证，其结果可为日本囊对虾耐热遗 传育种奠定基础。
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
[0033] 实施例1:日本囊对虾HSP60基因 cDNA和DNA序列克隆，包括以下步骤：
[0034] 1)日本囊对虾肌肉DNA的提取；
[0035] 2)HSP60基因内含子的扩增；
[0036] 3)获得MjHSP60目的基因全长序列。
[0037]在步骤1)中，所述日本囊对虾肌肉DNA的提取的具体方法可为:用酚/氯仿抽提，再 琼脂糖TBE凝胶电泳检测DNA。
[0038]在步骤2)中，所述HSP60基因内含子的扩增的具体方法可为：
[0039] a)引物设计
[0040] 根据日本囊对虾MjHSP60mRNA(GenBank登录号：JQ972715.1)和拟穴青蟹（Scylla paramamosain)HSP60基因全序列(GenBank登录号:JX262230.1)，在相邻外显子两端设计引 物，最后利用交叉引物验证是否有未扩出的内含子。MjHSP60内含子扩增所用引物序列如表 1所示。
[0041]表1
[0042]
[0043] b)PCR扩增，反应体系如下：
[0044]
[0045] c)PCR扩增程序：①95°C5min;②30个循环：94°C30sec，退火温度30sec，72°C 30sec;③72°C10min;④4°CPause。注:PCR扩增根据不同的引物分别设置相应的退火温度。 取5yL PCR加样于1.5%琼脂糖凝胶，在0.5 X TBE的缓冲体系中以160V电压进行电泳，30min 后，通过凝胶成像系统观察拍照，查看目的条带。
[0046] d)PCR产物的回收和纯化、感受态细胞的制备、目的片段与pMD 19-T Vector连接、 重组质粒的转化；
[0047] e)重组子的PCR鉴定与序列测定
[0048]每个目的片段的克隆平板随机挑取8个菌落，分别置于含有Amp(100yg/mL)的700μ L LB液体培养基中，37°C、180rpm振荡培养4h，以每管菌液作为模板，采用pMD19-T通用引物 进行PCR扩增鉴定。反应体系如下：
[0049]
[0050] f)PCR扩增程序：①95。C5min;②30个循环：94。C30sec，55。C30sec，72。Clmin ;③72 °C10min;④4°CPauSe<3PCR检测阳性菌液送交华大基因公司进行测序，通过对所有扩增片段 和引物序列的重叠比对和拼接获得MjHSP60基因编码区全长序列。
[0051] 在步骤3)中，所述获得MjHSP60目的基因全长序列的具体方法可为：
[0052]通过对所有扩增片段的重叠比对、拼接获得MjHSP60基因编码区全长序列（参见图 1)。该基因共含8个外显子和7个内含子，其基因组织结构图与拟穴青蟹较为一致，从图1中 可以看出，二者的外显子分布和大小几乎一致，对两者外显子进行BLAST比对发现相似度达 94%，而内含子差异较大。
[0053]实施例2:日本囊对虾HSP60基因中与耐热性相关SNP标记的筛选，包括步骤如下：
[0054] 1)实验对虾
[0055] 基因组DNA的提取（同上）
[0056] 2)不同群体日本囊对奸M jHSP60基因 SNP检测
[0057] a)利用直接测序法进行SNP的筛选