与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于遗传生物学领域，具体设及与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其 应用。
【背景技术】
[0002] SNP单核巧酸多态性位点主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核 巧酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅设及到单个碱基的变异，表现的形 式有替换、插入和缺失等。
[0003] SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA忍片、飞行时间质谱、W及最新 的高通量二代测序等技术。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种 W及遗传多样性等研究领域。
[0004] 转录因子TBX3(T-Box hanscription factor 3)是调控生长发育关键基因之一， 它广泛的存在于胚胎组织中，在胚胎干细胞、屯、脏传导系统的发育中起重要作用。它的缺失 或突变会引起尺骨-乳腺综合症。在中国德保矮马、伊準马和蒙古马群体中进行全基因组关 联分析和全基因组选择信号筛选，发现TBX3基因座位的多态性变异对中国家马的体尺性状 的影响达到显著水平。
[0005] 矮马个体矮小而灵活，脾气溫顺，特别适合作为青少年马术教学用马。随着青少年 马术俱乐部在全国各地的快速发展，矮马在文化教育产业的经济前景不可估量，然而，目前 国内马术俱乐部全部依赖进口矮马，每匹引入成本约5万元人民币。然而国产矮马由于选育 程度低，育种标记缺乏，开发利用程度低，都导致了我国矮马资源优势无法转化为经济优 势。目前国外已经通过全基因组扫描定位到HMGA2等影响矮马体尺性状的基因位点，然而前 期研究也表明国内外矮马具有各自独立的形成机制，因此，有必要开发国内矮马特异的分 子标记，应用于国内矮马的选育。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种辅助鉴定中国家马矮小性状的SNP标记及其应 用。
[0007] 本发明的另一个目的是提供用于检测与中国家马矮小性状相关的SNP标记的引物 及含有该引物的试剂盒。
[000引为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种与中国家马矮小性状相关的 SNP标记，所述SNP标记位于马第8号染色体第18101000碱基对(gi 194246389 :18100500-18101500Equus caballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 8, EquCab2.0,whole genome shotgun sequence)0
[0009]发明人对来自不同地区和品种的中国家马马匹进行了大量的基因型与身高表型 相关性研究，发现本发明所提供的SNP位点与家马身高显著关联(P<7. Ie-Il)。等位基因 A在 矮马中的频率高达80.65%，而在伊準马和蒙古马中频率只有18.85%。基因型AA只出现在 矮马中，基因型为AA的马匹的平均身高显著矮于基因型为GG的马匹（卡方检验P值<2.2e- 16)，对于通过基因型区分和筛选出矮小性状的中国家马具有较大的指导意义，当中国家马 的基因型为AA时可W判定马匹具有矮小性状，当中国家马的基因型为GG为时可W判定马匹 具有高大性状，可W提高家马身高筛选的准确率和效率。
[0010]本发明中，对矮马身高的界定与国际上通行的对矮马的身高界定相同，即马背的 高度低于106厘米的属于矮马，高于或等于106厘米的属于高马。
[ocm]本发明还提供了用于检测本发明所述SNP标记的特异性引物，包括：
[0012] 正向引物：5'-CCAACAACACCTGCCTTTTT-3' ；
[0013] 反向引物：5' -GCGACTTCGAAGAGGAGAAA-3'。
[0014] 本发明还提供了所述的SNP标记在鉴定中国家马矮小性状品种中的应用，包括W 下步骤：
[001日]1)提取待测马匹的基因组DNA;
[0016] 2) W待测马匹的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增 产物片段；
[0017] 3)检测PCR扩增产物片段的第489bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则判定待测马 匹具有矮小性状，若碱基种类为G，则判定待测马匹具有高大性状。
[0018] 其中，步骤2)中所述的特异性引物包括：
[0019] 正向引物：5'-0：44〔44〔4(：口'60：1'1'1'1'1'-3'；
[0020] 反向引物：5 ' -GCGACTTCGAAGAGGAGAAA-3 '。
[0021] 其中，所述扩增产物片段的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述SNP位点位于SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列的489bp处。在SEQ ID N0.1中，第489bp处用字母r进行标识，r表 示此处的碱基为腺嚷岭或鸟嚷岭。
[0022] 本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可W利用本领域常规 的检测方法进行，优选的，可W利用飞行时间质谱方法来检测待测中国家马的基因型。
[0023] 其中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系计为：50-100ngAU模板DNA化1， 10口111〇1/41正向引物和反向引物各化1，10111111〇1/1(1^?1111又2.041，51]/^11'日姐魁聚合酶 0.12化1，10 X PCR反应缓冲液2.化1，余量为双蒸水。
[0024] 其中，步骤2)中PCR反应的条件为：94°C预变性5分钟；94°C变性30秒，57°C退火30 秒，72 °C延伸60秒，共34个循环;72 °C保溫5分钟。
[0025] 本发明还提供了含有所述特异性引物的辅助鉴定中国家马矮小性状的试剂盒。
[0026] 优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、化q DNA聚合酶、Mgh、PCR反应缓冲液中的一种 或多种。
[0027] 优选的，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0028] 本发明所述的特异性引物还可W与其他用于中国家马表型检测的特异性引物相 结合用于中国家马分类和育种研究。
[0029] 与中国家马矮小性状相关的SNP标记在中国家马分子标记辅助育种中的应用也属 于本发明的保护范围。
[0030] 本发明的与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：
[0031] (1)本发明提供的分子标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的 早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势矮马品种的育种进 程。
[0032] (2)检出中国家马TBX3基因单核巧酸多态性的方法准确可靠，操作简便。
[0033] (3)中国家马TBX3基因的SNP位点的检出，为中国家马的身高大小的标记辅助选择 提供了科学依据。
【附图说明】
[0034] 图1为S种基因型测序峰图；
[0035] 其中，（a)为AA型；（b)为GG型；（C)为AG型。
[0036] 图2为S种基因型的飞行时间质谱SNP分型聚类分析图；
[0037] 其中，横轴区域表示GG基因型个体;纵轴区域表示AA基因型个体；中间区域表示GA 基因型个体;No cal 1表示个别个体基因型缺失;Other表示其他基因型个体。
[0038] 图3为SNP位点的分析结果。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0040] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0041] 实施例1中国家马TBX3基因多态性位点的鉴定。
[0042] 1.1提取待测中国家马血液中的基因组DNA
[0043] 采集来自中国西南地区127匹矮马（包括37匹来自德保地、31匹来自百色、31匹来 自罗平、11匹来自贵州、17匹来自文山）和150匹正常体高的马（包括30匹来自藏区，45匹来 自西北，32匹来自内蒙古，43匹来自东北）的血样，采用常规的方法提取血液中的基因组 DNA。
[0044] 1 . 2扩增含SNP位点的核巧酸片段：根据NCBI数据库收录的T B X 3基因座位 (gil94246389:18100500-18101500Equus caballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 8,EquCab2.0,whole genome shotgun sequence)的序列设计 引物，包括正向引物尸：5'-(：〔44〔44〔4(：(：16(：(：1'1'1'1'1'-3'和反向引物1?:5'-GCGACTTCGAAGAGGAGAAA-3'，Wl. I中的基因组DNA为模板，扩增出待巧USNP所在的核巧酸片 段，如SEQ ID NO. 1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的489bp处，此处碱基为A或G。
[0045] 其中PCR反应使用的扩增体系计为：IOOng/山模板DNA化1，IOpmol/山引物 F和R各化l，10mmol/L dNTP mix 2.0山，5U/山化姐魁聚合酶0.12扣iaOXPCR反应缓冲液 2.化1，余量为双蒸水。
[0046] 其中PCR反应的条件为:94 °C预变性5分钟;94 °C变性30秒，57 °C退火30秒，72 °C延 伸60秒，共34个循环;72 °C保溫10分钟。
[0047] 1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记
[004引对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中第489bp处的碱基为 A，则待测中国家马属于优势矮马品种。S种基因型的测序峰图如图1所示。
[0049] 1.4基因型判定:通过飞行时间质谱的分析方法对待测中国家马的基因型进行检 测;根据飞行时间质谱的结果判定SNP位点在待测群体中的基因型。根据样品的信号分布位 置，基因型可分为AA型，GG型和AG型。S种基因型的分型结果如图2所示。
[0050] 实施例2中国家马不同基因型与身高大小的关联分析与检测应用。
[0051] 按照实施例1中的方法提取32份矮马、32份伊準马和32份蒙古马的基因组DNA样品 进行DNA忍片分型检测，TBX3基因如SEQ ID NO. 1所示序列489bp位点的基因型分型结果如 图3所示。运用化INK软件中FDR矫正和"adaptive"模型进行全基因组关联分析，发现上述 SNP位点与身高显著关联(P<7. Ie-11)。等位基因 A在矮马中的频率高达80.65 %，而在伊準 马和蒙古马中频率只有18.85%。基因型AA只出现在矮马中，基因型为AA的马匹的平均身高 显著矮于基因型为GG的马匹。
[0052] 实施例3对277匹中国家马的TBX3基因座位的多态性位点进行扩大群体分析。运用 R软件的卡方检验进行分析，上述SNP位点在矮马中的等位基因 A的频率显著高于在其他普 通身高马匹（非矮马）中的等位基因 A的频率(P<2.2e-16)。进一步验证了该处SNP位点的等 位基因 A与中国家马的矮小性状的相关性(如表1所示）。
[0053] 表1SNP位点在中国矮马与非矮马品种中的基因型频率W及等位基因频率
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与中国家马矮小性状相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记位于马第8号染色体 第18101000碱基对。2. 用于检测权利要求1所述SNP标记的特异性引物，其特征在于，包括： 正向引物：5 ' -CCAACAACACCTGCCTTTTT-3 ' ； 反向引物:5 ' -GCGACTTCGAAGAGGAGAAA-3 '。3. 权利要求1所述的SNP标记在鉴定中国家马矮小性状品种中的应用，包括以下步骤： 1) 提取待测马匹的基因组DNA; 2) 以待测马匹的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物 片段； 3) 检测PCR扩增产物片段的第489bp处的碱基种类，若碱基种类为A，则判定待测马匹具 有矮小性状，若碱基种类为G，则判定待测马匹具有高大性状； 其中，所述特异性引物包括： 正向引物：5 ' -CCAACAACACCTGCCTTTTT-3 ' ； 反向引物:5 ' -GCGACTTCGAAGAGGAGAAA-3 '。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25μ1 计为:50_100ng/yl模板0ΝΑ1μ1，10ρηιο1/μ1 正向引物和反向引物各lyl，10mmol/L dNTP mix2. ΟμL，5UAU TaqDNA聚合酶0.125μ1，10 X PCR反应缓冲液2.5μ1，余量为双蒸水。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应的条件为:94°C预变性5 分钟;94 °C变性30秒，57 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，共34个循环;72 °C保温5分钟。6. 含有权利要求2所述特异性引物的辅助鉴定中国家马矮小性状的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合 酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。8. 根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。9. 权利要求1所述与中国家马矮小性状相关的SNP标记在中国家马分子标记辅助育种 中的应用。
【专利摘要】本发明涉及与中国家马矮小性状相关的SNP标记，所述SNP标记位于马第8号染色体第18101000碱基对。本发明的与中国家马矮小性状相关的SNP标记及其应用具有如下优点：(1)本发明提供的分子标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势矮马品种的育种进程。(2)检出中国家马TBX3基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。(3)中国家马TBX3基因的SNP位点的检出，为中国家马的身高大小的标记辅助选择提供了科学依据。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105713982
【申请号】CN201610232732
【发明人】马月辉, 蒋琳, 刘雪雪, 阿地力江·卡德尔, 浦亚斌, 何晓红
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所