Snp标记及其应用、检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及SNP标记及其应用、检测方法。
【背景技术】
[0002] 我国蜜蜂饲养历史悠久，蜜蜂种质资源丰富，但是长久以来，我国境内仅发现存在 东方蜜蜂，并无西方蜜蜂。东方蜜蜂采集能力稍次于西方蜜蜂，伴随着西方蜜蜂的引进，我 国养蜂者越来越多的开始饲养西方蜜蜂，我国原生蜂种质资源受到威胁。如果能够在我国 境内找到原生的西方蜜蜂对我国蜜蜂种质资源有着重要意义。中国蜜蜂种质资源委员会主 任石巍老师与新疆自治区蜂业管理站工作人员一直从事加强对新疆原有伊犁黑蜂保护的 工作，经过多年的努力，首次在中国新疆伊犁境内发现欧洲黑蜂自然种群，并且与目前国际 上已知的西方蜜蜂亚种至少存在9万年的分化，证明中国也是西方蜜蜂的原产地，结束了我 国没有西方蜜蜂自然种群分布的历史，这在畜禽资源研究方面具有很大的突破性意义。中 国西域黑蜂个体较大、越冬性能好、抗逆性强、抗螨能力十分突出，而且蜂王产卵力强，能维 持强群和蜂群极大的采集能力，既可作为推广普及的新品种，也可以作为育种素材，作进一 步的深入育种研究，具有很好的发展前景。
[0003] 中国发现西方蜜蜂，在国内外产生了较大的影响，为了更加深入的保护中国西域 黑蜂，有效的利用中国西域黑蜂为我国蜜蜂育种工作服务，在"蜂产业技术体系""物种资源 保护"等课题的资助下，我们对中国西域黑蜂的研究工作取得突破性进展，利用全基因组重 测序技术鉴定了中国西域黑蜂特有的21个SNP位点。
[0004] 全基因组测序，即对一种生物的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基 序列。全基因组测序覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息，准确性高。每个个体 从受精卵开始就继承了父母的DNA遗传信息，并且携带一生，不易改变。全基因组测序就是 通过运用新一代高通量DNA测序仪，进行10-20倍覆盖率的个体全基因组测序，然后与该物 种基因组精确图谱比较，得到完整的个体全基因组序列，破译个体全部的遗传信息的过程。 全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到特定物种（品种)特有的大量的单核苷酸 多态性(SNP)位点。
[0005] 目前，研究人员通常采用线粒体DNA的SNP位点信息来鉴定蜂种信息。线粒体DNA的 SNP位点检测方法是首先提取个体基因组DNA，然后进行线粒体DNA的PCR扩增，进而测序，获 得线粒体DNA序列SNP信息。
[0006] 目前存在的技术问题：
[0007] (l)SNP位点信息少；
[0008] (2)蜂种鉴别准确性低；
[0009] (3)具有片面性。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明提供了 SNP标记及其应用、检测方法。本发明采用全基因组测序 对中国西域黑蜂大量个体进行全基因组测序，获得了中国西域黑蜂中21个特有的SNP信息， 成为鉴定中国西域黑蜂的标志SNP位点。
[0011] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0012] 本发明提供了一种SNP标记，其特征在于如下所示：
[0015] 本发明还提供了所述SNP标记在物种鉴定中的应用;所述物种为中国西域黑蜂。
[0016] 本发明还提供了所述SNP标记在中国西域黑蜂分子标记辅助育种中的应用。
[0017] 本发明还提供了所述SNP标记在物种资源遗传多样性中的应用。
[0018] 本发明还提供了所述SNP标记在物种适应性进化中的应用。
[0019]本发明还提供了用于检测所述SNP标记的引物对。
[0020]本发明还提供了用于检测所述SNP标记的试剂盒，含有所述的引物对。
[0021 ]本发明还提供了所述SNP标记鉴定中国西域黑蜂的方法，包括如下步骤：
[0022]步骤1:获得待测物种的DNA，用如权利要求6所述的引物对扩增，获得扩增产物；
[0023]步骤2:对步骤1获得扩增产物进行单核苷酸多态性检测，检测标准如下所示：
[0026] 在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的所述SNP标记鉴定中国西域黑蜂 的方法中，如果所述待测物种满足所述检测标准的95%以上，则所述待测物种为中国西域 黑蜂;如果所述待测物种不满足至少两项所述检测标准，则所述待测物种不为中国西域黑 蜂。
[0027] 本发明采用全基因组测序对中国西域黑蜂大量个体进行全基因组测序，获得了中 国西域黑蜂中21个特有的S NP信息，成为鉴定中国西域黑蜂的标志S NP位点。本发明提供的 中国西域黑蜂蜜蜂特有的SNP位点在中国西方蜜蜂与其它地区西方蜜蜂的分化及中国西方 蜜蜂对本地环境的适应性进化具有重要作用。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029] 图1示利用形态鉴定数据对中国西域黑蜂和其他主要蜂种进行的主成份分析图； 从图中可以看出，中国西域黑蜂和欧洲黑蜂聚到了一起，不能区分；
[0030] 图2示利用线粒体DNA测序数据数据对中国西域黑蜂和其他主要蜂种构建的进化 树;从图中可以看出，中国西域黑蜂和欧洲黑蜂聚到了一起，不能区分。
【具体实施方式】
[0031] 本发明公开了 SNP标记及其应用、检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例 进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应 用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032] 1.样品采集。采集活体蜜蜂样品，并尽快放入75%酒精中保存;此外，样品保存，除 了 75%酒精保存，也可以用纯度更高的酒精(90%)，或者液氮、干冰等低温保存方式。
[0033] 2.提取样品高质量DNA;
[0034] 3.将DNA样品进行Illumina高通量测序，获得DNA序列原始数据;DNA高通量测序可 采用任何高通量测序平台，除上述Illumina平台外，还可以选用SOLiD平台，454测序等。 [0035] 4.过滤掉低质量序列。过滤规则包括：1)末端"N"的个数应小于等于序列长度的 10% ;2)测序质量低于5的碱基数应不超过序列长度的50% ;
[0036] 5.以西方蜜蜂(Apis mellifera)在NCBI公共数据库上的基因组为参考基因组 (apiMel4.5)，利用BWA软件进行序列比对，比对参数为"_t_k 32-M-R"；参考基因组最新版 本为apiMel4.5,更新版的参考基因组发布后，可采用新版参考基因组。
[0037] 6.利用SAMtools'mpileup程序获得群体的SNP基因型，将获得的基因型进行过滤， 获得最后的结果。过滤的规则有：1)质量值应不小于20; 2)在序列间隔处5个碱基以内的SNP 应过滤掉;3)测序深度应当大于等于4,小于等于1000;4)去掉有三个或更多基因型的SNP位 点；获得SNP基因型的程序可以是各种变异检测的程序，包括上述的SAMtools，和GATK、CLC 等程序。
[0038] 7.检测各个待测样本基于21个SNP位点的基因型，如果所有待测样本均满足如下 (1)-(21)的95%以上标准，则待蜜蜂群体为候选的中国西域黑蜂群体，即满足1-21个SNP中 的任意20个或21个，即为中国西域黑蜂。
[0039] (1 )NW_003378074 · 1，位置935827，SNP 信息 T;
[0040] (2)NW_003378158.1，位置846767，SNP 信息 A;
[0041 ] (3)NW_003378051 · 1，位置292887，SNP 信息 C;
[0042] (4)NW_003378051 · 1，