一种与橡胶树茎围相关的snp标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种与橡胶树茎围相关的SNP标记及其应用。其中，该SNP标记为SEQIDNO：1所示核苷酸序列自5’端起第132bp位点处的碱基为G或T。本发明的SNP标记与橡胶树的茎围紧密相关，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种。
【专利说明】
一种与橡胶树茎围相关的SNP标记及其应用
技术领域
[00011本发明涉及一种SNP标记及其应用，尤其涉及一种与橡胶树茎围相关的SNP标记及 其应用。
【背景技术】
[0002] 橡胶树是一种在世界经济和军事发展中扮演重要角色的热带树种，其生产的天然 橡胶树是一种重要的工业原料和战略物资。目前，中国适宜种植橡胶树的面积有限，实际种 植面积已达极限，已经没有扩大种植面积来增加产量的空间，大幅度提高橡胶树单位面积 产量是一条适合中国橡胶事业发展和缓解天然橡胶供需矛盾压力的可行性途径。
[0003] 橡胶树杂交育种一直是橡胶树育种的常规方法，然而常规育种周期长，以及种质 资源的匮乏，均制约橡胶树良种培育和产业发展。随着现代分子生物技术的发展，分子标记 辅助选择育种能在一定程度上解决上述问题，推动橡胶树育种进程。分子标记辅助选择育 种，即分子育种，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法，利用DNA分子标 记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要经济性状。近年来，橡胶树分子标记开发 和利用工作已取得了一定进展，但远不能满足橡胶树分子育种的需求。
[0004] 橡胶树的茎粗(茎围）生长是衡量橡胶树长势、木材材积量以及橡胶产量的主要指 标，也是植胶生产技术管理和经济管理的重要依据，现阶段挖掘有效的橡胶树茎粗(茎围） 性状相关的分子标记，以实现早期选种和提高育种准确性，从而取得更大育种及遗传进展。
【发明内容】
[0005] 本发明在于克服现有技术中的不足，提供一种与橡胶树茎围相关的，能够有效用 于橡胶树选育的SNP标记及其应用等。
[0006] 其中，SNP(singlenucleotidepolymorphism，SNP，即单核苷酸多态性）是1996年由 美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指 基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到 单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。
[0007] 本发明的第一个方面是提供一种与橡胶树茎围相关的SNP标记，其特征在于，所述 SNP标记的序列如SEQIDN0:1所示，所述SEQIDN0:1所示序列自5 '端起第132bp位点处的碱基 是G或T。根据本发明，SEQIDN0:1所示核苷酸序列如下：
[0009]发明人发现，该SNP标记的位点处基因型为杂合GT及纯合TT的橡胶树的茎围显著 粗于此处基因型为纯合GG的橡胶树。进而，根据本发明，通过检测橡胶树的上述SNP，能够有 效地确定其茎围性状，具体地，如前所述，该SNP位点基因型为杂合GT及纯合TT的橡胶树的 茎围显著粗于此处基因型为纯合GG的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合GT或纯合ΤΤ 时，则能够确定待测橡胶树的属于莖围粗的个体。由此，发明人确定，本发明的SNP标记与橡 胶树的茎围性状紧密相关，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种。进而能够根据实际 育种需求对橡胶树育种材料进行早期选择，进一步能够有效提高育种的效率和准确性，提 高橡胶树繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、高效地选育出橡胶树优良品种。此外，利用 本发明的SNP标记进行橡胶树分子标记辅助育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确 性高的优点。
[0010] 本发明的第二个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的引 物对，所述引物对具有SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。具体地，所述引物对的序 列如下所示：
[0011] 上游引物:GAAGCACTA AGACGGTCCATAG(SEQIDN0:2);
[0012] 下游引物:GGAGACAGATTACAATCTGACAGC(SEQIDN0 :3)。
[0013] 根据本发明，利用本发明的引物对能够有效地对待测橡胶树的上述与茎围性状相 关的SNP标记所在的片段进行PCR扩增，进而通过测序能够有效实现对该SNP标记的检测，确 定待测橡胶树该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测橡胶树的茎围性状。具体 地，该SNP标记位点处基因型为杂合GT或纯合TT的橡胶树的茎围显著粗于此处基因型为纯 合GG的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合GT或纯合TT时，则能够确定待测橡胶树的属 于茎围粗的个体。由此，用检测前面所述的本发明的SNP标记的引物对，能够有效用于橡胶 树的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优 良品种。
[0014] 本发明的第三个方面是提供一种用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的试 剂盒，其包含本发明第二个方面所述的引物对。即本发明的试剂盒中包含具有SEQIDN0:2和 SEQIDN0:3所示的核苷酸序列的引物对。根据本发明，利用本发明的试剂盒中所包含的引物 对，能够有效实现对待测橡胶树的第一个方面所述的与茎围性状相关的SNP标记的多态性 检测，确定待测橡胶树该SNP标记位点的基因型，进而能够有效确定待测橡胶树的莖围性 状。具体地，该SNP标记位点处基因型为杂合GT及纯合TT的橡胶树的茎围显著粗于此处基因 型为纯合GG的橡胶树，例如该SNP位点的基因型为杂合GT或纯合TT时，则能够确定待测橡胶 树的属于茎围粗的个体。由此，本发明的用于检测本发明第一个方面所述的SNP标记的试剂 盒，能够有效用于橡胶树的分子标记辅助育种，进而能够辅助早期实现短时间、低成本、高 准确性地选育橡胶树优良品种。
[0015] 本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的SNP标记、本发明第二个 方面所述的引物对或本发明第三个方面所述的试剂盒在橡胶树选育中的用途。
[0016] 如前所述，通过能够用于检测本发明的与橡胶树茎围性状相关的SNP标记的试剂， 例如本发明第二个方面所述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，能够有效地检测确定待 测橡胶树的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型能够有效确定待测橡胶树的茎 围性状，从而能够有效辅助橡胶树选育。
[0017] 进而，本发明的第五个方面是提供一种检测橡胶树茎围性状的方法，通过对待测 橡胶树进行本发明第一个方面所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的茎围性状。
[0018] 具体地，可以通过能够用于检测本发明的与橡胶树茎围性状相关的SNP标记的试 剂，例如本发明第二个方面所述的引物对或包含该引物对的试剂盒等，对待测橡胶树进行 PCR扩增、测序，以便检测确定待测橡胶树的上述SNP标记的基因型，进而基于获得的基因型 能够有效确定待测橡胶树的茎围性状。其中，如前所述，该SNP标记位点处基因型为杂合GT 及纯合TT的橡胶树的茎围显著粗于此处基因型为纯合GG的橡胶树，例如当该SNP位点的基 因型为杂合GT或纯合TT时，则待测橡胶树的属于茎围粗的个体。由此，本发明的检测橡胶树 茎围性状的方法，能够快速、高效、准确地检测橡胶树茎围性状，进而能够有效用于橡胶树 的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡胶树优良 品种。
[0019] 其中，对待测橡胶树进行SNP标记检测的方法不受特别限制。测序、单链构象多态 性聚合酶链式反应?〇^;[1^1681:抑11(1(3011；1^01'1]1&1:;[0即0150]1〇印1118111，？0?-330?)、限制性片段 长度多态性聚合酶链式反应（PCR -restriTCionfragmentlength polymorphism，PCR-RFLP) 及飞行时间质谱等技术均可以实现SNP的检测。其中，测序是一种准确性最高、灵活性强，通 量大、检测周期短的检测技术。只需在SNP位点的两侧设计一对引物，扩增200-1000bp的产 物，再通过测序即可直接检测SNP位点的基因型。因而，本发明采用测序的方法进行SNP标记 检测。根据本发明，通过对待测橡胶树进行前面所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶 树的茎围性状，进一步包括:提取待测橡胶树的基因组DNA;利用本发明第二个方面所述的 弓丨物对，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得PCR扩增产物;对所述PCR扩 增产物进行测序，以便获得测序结果;基于所述测序结果，确定所述待测橡胶树的所述SNP 标记的基因型；以及基于所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型，确定所述待测橡胶树的 茎围性状。由此，能够有效提高检测橡胶树茎围性状的效率。
[0020] 本发明中，提取待测橡胶树的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知 的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。根据本发明的一些具体示例，采用CTAB法提取待测橡 胶树的基因组DNA。由此，能够有效获得质量好、纯度高的基因组DNA，便于后续步骤进行。
[0021] 本发明中，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根 据本发明的一些具体示例，该PCR扩增的扩增体系以25μ1计为：100-200ngAU模版DNA ΙμL， ΙΟμΜ的SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的正向引物和反向引物各ΙμL，10 X PCR反应缓冲液2.5μ 1，2.5mM dNTP 2. ΟμL，5UAU的TapDNA聚合酶0.2μ1，水余量。该PCR反应条件为:95 °C预变性 5min后，941€3〇8,6〇1€3〇8,72°(：11^11共30个循环，72°(：延伸51^11。由此，能够快速、高效、准 确地扩增本发明的SNP标记所在的片段，获得目标扩增产物，便于后续步骤的进行。
[0022] 本发明中，对所述PCR扩增产物进行测序的方法不受特别限制，只要能够有效获得 PCR扩增产物即SNP标记所在的片段的序列即可。根据本发明的一些具体示例，可以采用选 自HISEQ2000、S0LiD、454和单分子等测序方法的至少一种对所述PCR扩增产物进行测序。由 此，能够高通量、快速、高效、准确地获得测序结果。
[0023] 本发明基于测序结果，通过比对橡胶树参考基因组序列，能够有效确定待测橡胶 树的所述SNP标记的基因型为GT、TT还是GG。
[0024]本发明中，所述SNP标记的GT基因型及TT基因型个体的茎围显著粗于GG基因型个 体。即本发明前面所述的SNP标记与橡胶树的茎围性状紧密相关。由此，基于确定的待测橡 胶树的该SNP标记的基因型，能够准确有效地确定待测橡胶树的茎围性状，例如该SNP位点 的基因型为GT或TT时，则待测橡胶树的属于茎围粗的个体。进而本发明的方法能够有效用 于橡胶树的分子标记辅助育种，从而能够辅助早期实现短时间、低成本、高准确性地选育橡 胶树优良品种。
[0025]本发明的有益效果：
[0026] (1)本发明提供的SNP标记不受橡胶树的年龄等限制，可用于橡胶树的早期选育， 可显著促进橡胶树的育种进程；
[0027] (2)检测橡胶树如SEQIDN0.1所示自5 '端起第132bp的SNP位点的方法，准确可靠， 操作方便；
[0028] (3)橡胶树如SEQIDN0.1所示自5 '端起第132bp的SNP位点的检出，为橡胶树茎围性 状的标记辅助选择提供了科学依据。
【发明内容】
[0029]
[0030] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
[0031] 实施例1:与橡胶树茎围相关的SNP标记的获得
[0032] 1.1橡胶树种质材料获得
[0033]所采用的群体为橡胶树1981'IRRDB种质，种植于中国热带农业科学院橡胶研究所 国家橡胶树种质资源圃，其遗传背景主要来源于巴西亚马逊河流区域阿克里州(Acre)，马 托格罗索州(Mato Grosso)和朗多尼亚州（Ronddnia)三个州。2014年6月，采集34份种质幼 嫩叶片液氮冻存带回实验室备用。
[0034] 1.2橡胶树种质材料DNA提取
[0035]取冷冻保存的橡胶树叶片，采用CTAB法提取基因组DNA: (1)称取lg橡胶树嫩叶，液 氮速冻后研磨成细粉末，转移到50ml离心管中。（2)加入10ml65°C预热的2XCTAB提取缓冲 液(已提前加入2%的β-巯基乙醇），轻轻转动离心管使植物组织在抽提缓冲液中分散均匀， 65°C温育lh，并不时轻轻转动离心管。（3)混合物冷至室温加入等体积的Tris-酚:氯仿：异 戊醇（25 :24:1)，然后颠倒离心管使其混匀，注意：不要振荡，防止打断DNA。（4)室温， 12000rpm离心10min使其分相。（5)吸取水相至另一离心管中，加人等体积的氯仿：异戊醇 (24:1)，颠倒混匀。室温，12000rpm离心1 Omiη。（6)吸取水相至另一离心管中，加入等体积的 异丙醇，颠倒混勾，室温放置20min。（7)室温，14000rpm离心20min。弃上清，沉淀用lml冰预 冷的75%乙醇漂洗2次。（每次漂洗时，室温，14000rpm离心10min)。（8)弃上清，超净工作台 上晾干DNA沉淀。然后溶于200μ1 TE(pH 8.0)缓冲液或ddH20中。加人ΙμL Rnase A(10mg/ 1111)，37°(：水浴3〇1^11，-20°(：保存备用。
[0036] 1.3采用Sanger法测序获得橡胶树茎围相关的SNP标记
[0037] 基于Sanger法测序平台，对上述群体中9个样本进行产量相关基因测序，分析其核 苷酸多态性位点，采用Tassel 3.0_standalone软件分析SNP位点与已知农艺性状的相关 性，找到一个与橡胶树茎围相关的SNP位点。该位点位于SEQ ID NO: 1所示序列的132bp位点 处，在SEQ ID NO: 1序列中用X表示该处位点，且此处位点的碱基为G或T。该位点处基因型为 杂合GT或纯合TT的橡胶树的茎围显著粗于此处基因型为纯合GG的橡胶树。
[0038]实施例2:与橡胶树茎围相关的SNP标记的测序验证与应用
[0039] 2.1扩增含SNP位点的核苷酸片段
[0040]以前述提取获得的各待测橡胶树的基因组DNA为模版，利用正向引物F:5'-GAA GCACTAAGACGGTCCATAG-3'（SEQIDN0:2)和反向引物R:5'-GGAGACAGATTACAA TCT GAC AGC-3'（SEQ ID如:3)，扩增出待测3即所在的核苷酸片段。其中，？0?反应体系为 25μ1:100-200ng/yl模版DNA ΙμL，ΙΟμΜ引物F和R各ΙμL，10 X PCR反应缓冲液2 · 5μ1，2 · 5mM dNTP 2 · ΟμL，5υ/μ1的Tap DNA聚合酶0 · 2μ1，水余量;PCR反应条件为:95 °C预变性5min后，94 1€3〇8,6〇1€3〇8,72°(：1111丨11共30个循环，72°(：延伸511^11。
[0041 ] 2.2测序识别SNP位点基因型
[0042]将上述步骤中获得的PCR产物经琼脂糖电泳检测、回收并将其插入pMD 18-T载体 中，每个样品选择6个单克隆进行测序(生工生物工程上海有限公司），识别SEQ ID NO: 1序 列中132bp处（即本发明的SNP标记）的基因型。34个待测橡胶树个体该SNP位点的基因型及 其茎围如下表1所示。
[0043]表1 34个待测橡胶树个体该SNP位点的基因型及其茎围
[0045] 2.3 SNP位点基因型与茎围的关联分析
[0046] 基于表1的结果，利用Tassel 3.0_standalone软件的一般线性模型分析SNP位点 的基因型与茎围的关联性，发现该SNP位点的基因型与茎围的相关性达到了极显著水平(R2 = 0.28209743，p = 0.00606920)。采用DPS软件分析SNP位点基因型频率及茎围之间的差异 关系如表2，其中GT杂合型及TT纯合型个体茎围均值较高，GG纯合型个体茎围均值较低，且 GT杂合型及TT纯合型个体茎围均值与GG基因型个体茎围均值的差异达极显著水平（P〈 0.01)，即含有等位基因 T的个体(GT杂合型及TT纯合型个体)茎围均粗于GG基因型个体。进 而，证明SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列自5'端起第132位碱基G或T与橡胶树茎围性状显著相 关，为橡胶树茎围性状相关的SNP标记，该SNP标记的GT杂合型及ΤΤ纯合型个体的茎围显著 粗于GG基因型个体，即含有等位基因 Τ的个体(GT杂合型及ΤΤ纯合型个体)茎围均粗于GG基 因型个体。
[0047]表2本发明SNP位点基因型频率及茎围之间的差异关系
[0049]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种与橡胶树茎围相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的序列如SEQIDNO: 1所 示，所述SEQIDN0:1所示序列自5'端起第132bp位点处的碱基是G或T。2. 根据权利要求1所述的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的杂合GT基因型及纯合TT 基因型橡胶树的茎围显著粗于纯合GG基因型橡胶树。3. -种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核 苷酸序列如SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3所示。4. 一种用于检测权利要求1或2所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求 3所述的引物对。5. 如权利要求1或2所述的SNP标记、权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂 盒在橡胶树选育中的用途。6. -种检测橡胶树茎围性状的方法，其特征在于，通过对待测橡胶树进行权利要求1或 2所述的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的茎围性状。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过对待测橡胶树进行权利要求1或2所述 的SNP标记的检测，确定所述待测橡胶树的茎围性状，进一步包括： 提取待测橡胶树的基因组DNA; 利用权利要求3所述的引物对，将所述待测橡胶树的基因组DNA进行PCR扩增，以便获得 PCR扩增产物； 对所述PCR扩增产物进行测序，以便获得测序结果； 基于所述测序结果，确定所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型；以及 基于所述待测橡胶树的所述SNP标记的基因型，确定所述待测橡胶树的茎围性状。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP标记的杂合GT基因型及纯合TT基 因型橡胶树的茎围显著粗于纯合GG基因型橡胶树。
【文档编号】C12Q1/68GK105950729SQ201610335314
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】龙翔宇, 方永军, 唐朝荣, 何斌, 赵庆洲
【申请人】中国热带农业科学院橡胶研究所