用于甲状腺癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于甲状腺癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒，所述microRNA生物标志物由如下microRNA组成：hsa?miR?193b?3p、hsa?miR?384、hsa?miR?145?5p、hsa?miR?424?5p和hsa?miR?143?3p。本发明将甲状腺癌与癌旁组织表达差异明显(差异表达量大于2个fold，RT?PCR中CT值小于30)的5种miRNA hsa?miR?193b?3p、hsa?miR?384、hsa?miR?424?5p、hsa?miR?145?5p及hsa?miR?143?3p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，hsa?miR?193b?3p、hsa?miR?384和hsa?miR?145?5p表达下调，hsa?miR?424?5p和hsa?miR?143?3p表达上调。这5种miRNA可以作为甲状腺癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异性。
【专利说明】
用于甲状腺癌诊断的mi RNA生物标志物及检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测，涉及用于人甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物及检测试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 甲状腺癌是常见的内分泌腺恶性肿瘤，占癌症发病率的2.59%，包括甲状腺乳头 状癌(PTC)，甲状腺滤泡癌(FTC)、甲状腺未分化癌(ATC)和甲状腺髓样癌(MTC)，前三者起源 于滤泡上皮细胞，后者起源于滤泡旁细胞，其中PTC约占甲状腺癌的80 %。目前，甲状腺癌的 发病机制尚未清楚，通过对甲状腺癌病因及发生发展机制的研究，对于提高其诊断率、指导 治疗及改善预后具有重要的临床意义。
[0003] MicroRNA(miRNA)是最新发现的长约18-25个核苷酸的非编码小分子RNA，在进化 上高度保守，数量约占基因组的1 %，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联系， 其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋白 质编码基因的表达:通过与其靶基因 mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降解 或抑制其翻译。人类基因组约30%的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等 多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展关系 密切。MiRNA的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随着 miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还涉 及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因治 疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
[0004] 目前，用于人甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物研究较少，尚无可靠的 microRNA生物标志物用于诊断人甲状腺癌。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 用于人甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物，包括:1183-11111?-19313-3。、1183-11111?-384、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-424_5p 和 hsa-miR-143_3p;所述 hsa-miR-193b_3p 的核苷酸 序列如SEQIDN0.1所示；所述hsa-miR-384的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示；所述hsa-miR-145-5p的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示;所述hsa-miR-424-5p的核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示;所述hsa-miR-143-3p的核苷酸序列如SEQIDN0.5所示。
[0008] 进一步地，所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
[0009] -组人甲状腺癌诊断用microRNA引物、探针的组合，包括hsa-miR-193b_3p引物、 探针，hsa-miR-384 引物、探针，hsa-miR-145-5p 引物、探针，hsa-miR-424-5p 引物、探针， hsa-miR-143-3p引物、探针;所述引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物； hsa-miR-193b-3p的反转录引物序列如SEQIDN0.6所示，定量PCR前引物序列如SEQID NO. 7所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示;hsa-miR-384的反转录引物序列如SEQ IDN0.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDN0.9所示，定量PCR后引物序列如SEQID N0.16所示;hsa-miR-145-5p的反转录引物序列如SEQIDN0.10所示，定量PCR前引物序列 如SEQIDN0.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDN0.16所示 ;hsa-miR-424-5p的反转录 引物序列如SEQ ID NO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 13所示，定量PCR后引物 序列如SEQIDN0.16所示;hsa-miR-143-3p的反转录引物序列如SEQIDN0.14所示，定量 PCR前引物序列如SEQ ID NO. 15所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示；各 microRNA探针的核苷酸序列如SEQIDN0.17所示。
[0010] -种人甲状腺癌的肿瘤诊断试剂盒，包括如上所述的microRNA引物、探针的组合。
[0011]进一步地，所述的人甲状腺癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、 MgCl 2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
[0012]本发明的优点：
[0013]本发明将甲状腺癌组织与配对的癌旁组织表达差异明显（差异表达量大于2个 fold，RT-PCR 中 CT 值小于 30)的 5 种miRNAhsa-miR-193b-3p、hsa-miR-384、hsa-miR-424-5p、 hsa-miR-145_5p及hsa-miR-143_3p进行血清学表达分析，结果表明这5种miRNA在血清中稳 定表达，血清miRNA的表达与组织具有很好的一致性，hsa-miR-193b-3p、hsa_miR-384和 hsa-miR-145_5p 表达下调，hsa-miR-424_5p 和 hsa-miR-143_3p 表达上调。这 5 种 miRNA 可以 作为甲状腺癌诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一 miRNA诊断 的灵敏度和特异性。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0015] 实施例1:甲状腺癌组织差异性miRNA的筛选
[0016] 1对象和方法
[0017] 1.1标本来源
[0018]在取得患者知情同意后，收集江苏省人民医院2013年5月-2014年9月经病理证实 为甲状腺癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本以及配对的距离癌组织3厘米以上范围的 癌旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
[0019] 1.2主要仪器设备
[0020]台式离心机：EppendorfMini spin(美国）Eppendorfcentrifuge 5810R(美国）
[0021 ]核酸浓缩仪：Eppendorfconcentrator 5301(美国）
[0022 ] 紫外分光光度计:DU640、天平(Beckman公司产品）
[0023] 紫外交联仪:GS GENE LINKER UV Chamber(BI〇-RAD公司产品）
[0024] 水浴锅(Memert公司产品）
[0025] 杂交盒、芯片、芯片扫描仪:LuxScan_10K/A(Capitalbio公司产品）
[0026] 水平摇床:TDK-2 (北京通达科技有限公司）；凝胶成像分析仪:GDS-7600 (UPV产品）
[0027] 超净工作台(Memert公司产品）；实时荧光PCR仪:ABI PRISM7500(美国）
[0028] 1.3主要实验试剂
[0029] Tr i zo 1、糖原（Invi trogen公司）；T4RNA连接酶（NEB公司）；Contro 1 RNA (Capitalbio&3);5P'-C-U-Cy3-3'5P'-C-U-Cy5-3'（Dharmacon&3);Ambion'smiRNA Isolation Kit(Ambion公司）；EDPC、甲酞胺、澳酚蓝（Sigma公司）；20XSSC、10%SDS (PIERCE公司）；50XDhardt's(鼎国）；M0PS(Bocherigmer公司）；5XRT Buffer(美国 Promega公司）、M_MLV逆转录酶：200ιι/μ1 (美国Promega公司）；4 X dNTP: lOmM each(上海生 工生物工程有限公司）;RNase抑制剂40ιι/μ1 (大连宝生物工程有限公司）。
[0030] 1.4组织标本总RNA的提取
[0031] Trizol-步法提取组织标本中的总RNA。具体步骤如下：
[0032] (1)准备研钵、匀聚器、勺子、剪刀、镊子、液氮等器材和试剂；
[0033] (2)研钵预冷:往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷；
[0034] (3)带上手套，口罩，迅速从液氮罐中用镊子取出样本，在分析天平中称重，一次提 取的组织块重量在0.3-0.5g之间。组织块放入用液氮预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加 液氮，整个过程都不要使组织块融化。
[0035] (4)粗研磨后，在超净工作台中，用小勺迅速将研碎的组织移入装有Trizol试剂的 勾装器中，按l〇〇mg组织加入lml Trizol，匀浆至肉眼看不到组织样本颗粒为止。
[0036] (5)用滴管将匀浆液转移到1.5ml离心管中，每管放入约，室温放置以上，保存至- 80°C冰箱中直至分析。
[0037] (6)勾衆标本常温解冻，按0.2ml氯仿/lml Trizol的比例加入氯仿，vortex 30秒， 室温放置3min，然后4°C，12000rpm离心15min。
[0038] (7)离心后溶液分层，分成底层酚-氯仿、中间层和上层水相。RNA仅存在水相中，用 加样器将上清转移到另一新的1.5ml离心管中，不要吸取中间层。按0.5ml异丙醇/lml Trizol的比例加入异丙醇，混勾，室温放置10min以上，12000rpm 4°C离心15min。
[0039] (8)弃去上清，异丙醇不要回流过多，可再短暂离心，用加样器将剩余的异丙醇吸 出，加入lml 75% 乙醇，vortex，7500rpm 4°C离心5min〇
[0040] (9)弃去75%乙醇，通风橱中自然干燥30min，不要真空离心干燥，RNA不要完全干 透，以防不能完全溶解，用DEPC水溶解RNA，每管溶于30μ1，60-65Γ助溶5min。
[0041 ] (10)RNA定量，吸取ΙμL的RNA样品，加入49μ1 DEPC水中，用加样器上下吹打混匀， 稀释50倍。用溶解RNA的DEPC水标记空白，吸取50μ1加入比色杯中。用紫外分光光度计DU-640测量0D值，计算比值0D260/0D280比值和RNA浓度。
[0042] RNA浓度= 0D260 X 40μg/ml X 稀释倍数。
[0043] 1.5总RNA中miRNA的分离提取
[0044] 取50_100yg总RNA用Ambion's miRNAIsolation Kit分离miRNA，具体步骤如下：
[0045] (1)取50_100yg总RNA加入EP管，定容至适量体积。加入5倍体积的Lysis/Binding Buffer，混勾。
[0046] (2)加十分之一体积的111丨1?熟!1〇1]1〇861^丨6 4(1(1;[1:;^6，振荡混勾，置于冰上孵育10分 钟。
[0047] (3)加三分之一体积的100 %乙醇，充分混勾。
[0048] (4)将上述混合液加入滤管中，5000rpm离心1分钟，收集滤液(小RNA在滤液中）。
[0049] (5)在滤液中加入三分之二体积的100 %乙醇，充分混匀。
[0050] (6)更换滤管，将步骤(5)的混合物进行过滤，5000rpm离心1分钟，弃去滤液，收集 管继续使用。
[0051 ] (7)将滤管放在收集管中，用700μ1 的miRNAwashing solution 1 洗滤管，5000rpm 离心1分钟，弃去滤液。
[0052] (8)用500μ1 的miRNAwashing solution 2洗滤管，5000rpm离心 1 分钟，弃去滤液； 再用miRNAwashing solution 2洗一遍;将滤管连同收集管lOOOOrpm离心1分钟，除去滤管 中残留的液体。
[0053] (9)将elution solution加热到95°C ;更换一个新的收集管，将50μ1 95°C的 elution solution加入滤器，合上盖子，室温孵育2分钟；lOOOOrpm离心1分钟，收集滤液，小 RNA在滤液中。重复步骤(9)。
[0054] 1.6miRNA 芯片筛选
[0055] 1.6.1miRNA 芯片
[0056] 哺乳动物miRNA芯片V3.0针对人677、大鼠 292、小鼠 461个成熟microRNA，由于人、 大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集，一共设计了924条探针（sanger miRNA数据库：mi RNABaselO · 0)。把这些探针用芯片点样仪Smart-Array TM(Capitalbio Corp，Bei j ing，China)点制在一张 75 X 25mm、经过化学修饰的载玻片上。点制在芯片上的样 品还包括人的U6、tRNA作为内标;8个人工制备的30个碱基长度RNA对应的探针作为芯片的 外标(21口5、21口13、21口15、21口21、21口23、21口25、￥2、￥3)，!161作为点样阳性对照，，50%0150 作为杂交阴性对照。
[0057] 1.6.2miRNA样品的荧光标记 [0058] 具体步骤如下：
[0059] (1 )miRNA的荧光标记：取2-5yg癌组织miRNA经聚乙二醇沉淀，用0 · lmgATP、50mM HEPES、3.5m M DDT、20mM MgCl2、10mg/ml BSA、10%DMS0、500ng Cy3标记的5P'-C-U-Cy3-3 '（来自Dharmacon公司）和20单位的T4RNA连接酶，用枪头吹打，轻轻混匀。锡纸包裹样品 管，在0°C标记反应2小时。同理用Cy5标记癌旁组织miRNA。两种标记后的miRNA混勾。
[0060] (2)miRNA的纯化:在上述荧光标记后的样品内加入DEPC水，补齐至100μΙ，加入十 分之一体积_20°C预冷的3mmol/L醋酸钠(ρΗ5.2) 10μ1、糖原10yg、2.5倍体积无水乙醇，于-20°C静置1小时。
[00611 (3)miRNA沉淀的漂洗:弃去上清，加入-20°C预冷的75%乙醇800μ1，充分混匀后4 °CTl2000rpm离心5分钟。重复2次。弃去上清，在空气中干燥10min，吹干后用于芯片杂交。 [0062] 1.6.3miRNA 芯片杂交 [0063] 具体步骤如下：
[0064] (1)将 RNA 溶于 16μ1 杂交液中（15% 甲酰胺 2.4yl;0.2%SDS 3.2yl;3XSSC 2·4μ1; 50 X Denhardt ' s 1 · 6μ1，DEPC处理水6 · 4μ1)。
[0065] ⑵恒温金属浴加温，溶解，振荡，混匀。
[0066] (3)取出，放置-20 °C冰箱内10分钟，使之降温。
[0067] (4)95°C 变形 3min。
[0068] (5)冰上迅速冷却，全部滴加到哺乳动物microRNA芯片V3.0上，加盖硅化盖玻片。 [0069] (6)杂交盒内消毒后经双蒸水湿润的滤纸保持湿度，42°C杂交过夜，通常16小时以 上。
[0070] (7)杂交结束后，先在42°C左右含0.2%SDS、2XSSC的液体摇床中漂洗4分钟，而后 在室温中含有0.2 X SSC液体摇床中室温洗4分钟，玻片置于管中，1600rpm离心1分钟甩干后 即可用于扫描。
[0071] 1.6.4芯体扫描及数据处理
[0072] 芯片用Luxscan 10K/A双通道激光扫描仪(Capitalbio公司）进行扫描。数据提取 采用Luxscan 3.0图像分析软件(Capitalbio公司）对芯片图像分析，把图像信号转化为数 字信号。
[0073] 1.7miRNA芯片结果real time RT-PCR验证
[0074] 1.7.1miRNAreal time RT-PCR引物设计
[0075] 特异的茎环引物(反转录引物序列）约56个核苷酸，其5'端的48个核苷酸序列是固 定的，形成一个莖环的结构，其3'端的8个核苷酸就与microRNA互补。正向引物(PCR前引物） 长约30-31个核苷酸，在3'端有约16-17个核苷酸与对应的microRNA互补，而剩余14个核苷 酸的Tm值高于65摄氏度。通用的反向引物(PCR后引物)约为23nt，其中18个核苷酸对应特异 反向引物的莖环结构，而5'端的5个核苷酸的Tm值高于65摄氏度。
[0076] 1.7.2miRNAreal time RT-PCR
[0077] 1.7.2. lcDNA逆转录合成
[0078] 组织标本总RNA逆转录合成cDNA，反应体系如下：
[0080] 反应条件：16Γ，30π?η;42Γ，60π?η;85Γ，5min;4°C，hold。
[0081] 1.7.2.1miRNAreal time RT-PCR反应
[0082] miRNA real time RT-PCR反应体系如下：
[0084] 反应条件：95Γ 预变性 10π?η;95Γ58、60Γ348Χ40。
[0085] 1.8统计学分析
[0086] 基因芯片筛选的结果米用Cluster 3.0和Significance Analysis ofMicroarrys (SAM，version2.1)进行分析。数据以（土表示，组间比较采用检验，采用软件进行分析处理， 为差异有统计学意义。Real time RT-PCR数据以（X土s)表示，组间比较采用t检验，采用 SPSS 17.0软件进行分析处理，P<0.05为差异有统计学意义。
[0087] 2 结果
[0088] 2.1miRNA基因芯片筛选结果
[0089] 利用miRNA芯片对8对甲状腺癌组织及配对的癌旁组织中924种miRNA表达情况进 行分析，共筛选出20种差异性表达的miRNA，其中hsa-miR-ASA-SpAhsa-miR-AgTAsa-miR-HS-Sp表达上调， hsa-miR-381 、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa_miR-384、hsa-miR-335、hsa-miR-99a、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-125b、has-let-7b、hsa-miR-10a、hsa-miR-126、hsa-miR-30a、hsa_miR-141、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-19b、hsa_miR-26a、rn〇-miR-324_3p表达下调。
[0090] 2.2miRNA基因芯片筛选结果的real time RT-PCR验证
[0091] 用miRNA real time RT-PCR对芯片筛查的结果进行验证，共筛选出9种差异性表 达的miRNA，其中，118&-11111?-424-5卩、118&-11111?-143-3卩和118&-11111?-497表达上调，118&-11111?-384、hsa-miR-145-5p、hsa_miR-381、hsa-miR-497、hsa-miR-99a、hsa-miR-193b_3p 表达下 调。对其中表达差异性明显的5种miRNA，hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-384、hsa-miR-424-5p、 hsa-miR-145_5p及hsa-miR-143_3p进行进一步的血清学表达分析。
[0092] 实施例2:甲状腺癌组织中差异性miRNA的血清学分析
[0093] 1对象和方法
[0094] 1 · 1标本来源
[0095] 在取得患者知情同意后，收集江苏省人民医院2013年5月至2014年7月165例经病 理诊断明确的甲状腺癌患者和120例健康人清晨空腹静脉血6ml作为对照。所有甲状腺癌患 者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗治疗。120例健康对照组为未患有 恶性肿瘤及其他疾病，同时年龄匹配的健康人群。
[0096] 1.2血清样本采集及处理
[0097]抽取清晨空腹静脉血6ml置于不含抗凝剂的管中，静置30分钟，于4°C1300g(或 4000rpm)离心15分钟，取上层血清每300μ1分装至RNase-free EP管置于-80°C冰箱储存。 [0098] 1.3主要仪器设备
[00"] Eppendorfcentrifuge(美国）；水平层流洁净工作台（memert公司）；紫外分光光度 计nano(Thermo科技）；水浴锅(memert公司）；定时定量PCR仪CFX96(德国BIO-RAD) ;Vortex 漩涡震荡仪(美国SI);超低温冰箱(Thermo科技）;Mi 11 i Q纯水器(Synthesis公司）。
[0100] 1.4主要实验试剂
[0101]血液总RNA快速提取试剂盒（北京百泰克公司）；裂解液RLS;去蛋白液RE;漂洗液 RW;RNase_free H2〇;70% 乙醇；RNase-free吸附性RA;miRcute miRNA cDNA第一链合成试 剂盒（TIANGEN) ;E · coli Poly(A)Polymerase(5U/ml); 10 XPoly(A)Polymerase Buffer; 5 XrATP Solution ； 10 X RT Prime； 10 XRT Buffer； Super Pure dNTP Mixture ； Rnasin ； Quant RTase;RNase_Free ddH2〇;miRcute miRNA焚光定量检测试剂盒（TIANGEN) ;2X miRNA premix(SYBRROX)；Reverse primer；50XROXReference Dye;Chloroform(Sigma公 司）。
[0102] 1.5引物设计
[0103]
[0104] 1.6实验方法
[0105] 1.6.1血清样本总RNA提取
[0106] (1)每250μ1血清加入750μ1裂解液RLS，用加样枪吹打样品几次，裂解液RLS和液体 样品的终体积比总是3:1。
[0107] (2)将样品剧烈震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
[0108] (3)4°C条件下12000rpm离心10分钟，小心取上清转入新的RNase free的离心管 中。
[0109] (4)每毫升RLS加 0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并室温下放置3分钟。
[ΟΙ10] (5)于4°C 12000rpm离心10分钟，样品会分成三层:下层有机相，中间层和上层无色 的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加 RLS体积的70%，把水相转移到新管 中，进行下一步操作。
[0111] (6)加入1倍体积70 %乙醇，颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能 沉淀一起转入RA柱中（吸附柱套在收集管内）。
[0112] (7) lOOOOrpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
[0113] (8)加500μ1去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃掉废液。
[0114] (9)加入700μ1漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
[0115] (10)加入700μ1漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃掉废液。
[0116] (11)将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂 洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0117] (12)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加30μ1 事先在65°C水浴中加热的RNase free water，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，将得到 的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。
[0118] 1.6.2cDNA 转录
[0119] 在血清样品总RNA提取后，采用在miRNA 3'末端加多聚A尾Poly(A)，再使用oligo (dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。
[0120] 1.6.2.1miRNA 3'末端进行Poly(A)处理
[0121] (1)在冰上预冷RNase free的反应管内加入以下试剂至总体积20μ1 (最后加入 E.coli Poly(A)Polymerase)〇
[0123] (2)移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37 °C反应60分钟，继续实 验。
[0124] 1.6.2.2Poly(A)修饰的miRNA进行逆转录反应，按照下表组分进行反应液的配制。
[0126] 1.6.3real time RT-PCR
[0127] (1)室温融化2XmiRNA premix(SYBR)和Reverse primer。
[0128] (2)将2XmiRNA premix(SYBR)上下颠倒轻轻混匀，避免起泡，然后轻轻微离心后 再使用。
[0129] (3)将试剂置于冰上，并按照下表配制反应体积。
[0131 ] PCR反应程序按照下表设置
[0133] 1.6.4PCR 数据处理
[0134] PCR扩增结果用CT值来表示，CT值的含义是PCR反应液中荧光信号达到所设定的阈 值时的循环数。样品目的基因的相对表达率(RQ)采用AACT方法计算，RQ=2_ 〃（CT表示 反应的实时焚光强度显著大于背景值时的循环数，ACT sample = CT sample-CT U6sample , ACT control = CT control-CT U6control，AACT = ACT sample-ACT control)〇
[0135] 1.7统计学分析
[0136] 采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量资料以（x土s)表示，组间比较采用t 检验，血清miRNA相对表达量与甲状腺癌临床病理特征的关系采用Mann Whiney检验及 Kruskal Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
[0137] 2 结果
[0138] 2.1血清目标miRNA的real time RT-PCR检测
[0139] 本研究对165例甲状腺癌患者和120例健康对照组血清中目标miRNA表达情况进行 了定量分析，用U6作为内标，结果表明miRNA在血清中稳定表达，用U6作为内参稳定可靠。
[0140] 2.2甲状腺癌患者及对照组血清中目标miRNA表达情况
[0141 ]对照组与甲状腺癌组 hsa-miR-384、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-143-3p及hsa-miR-193b-3p相对表达量比较，差异均有统计学意义(Ρ<0·05)。
[0142]数据见下表。
[0144] 本发明利用miRNA芯片对8对甲状腺癌组织及配对的癌旁组织中miRNA表达谱进行 了分析，共筛选出20种差异性表达的miRNA，实时荧光定量RT-PCR对芯片结果进行了验证， 共筛选出 9 种差异性表达的 miRNA，其中hsa-miR-424-5p、hsa-miR-143_3p 和 hsa-miR-497 表 达上调，118&-11111?-384、118&-11111?-145-5卩、118&-11111?-381、118&-11111?-497、118&-11111?-99&、118已-miR-193b-3p表达下调。肿瘤的发生是一系列分子生物学行为改变累计的结果，涉及到细胞 周期、细胞凋亡、增殖分化等各个方面，因此应该有一系列miRNA表达的改变参与肿瘤的发 生，基因芯片的结果验证了这一假设，多种miRNA的表达发生了改变。
[0145] 表达差异明显（差异表达量大于2个f old，RT-PCR中CT值小于30)的5种!1^1?^，118&-miR-193b-3p、hsa-miR-384、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-145-5p 及 hsa-miR-143_3p 进行进一 步的血清学表达分析。结果表明miRNA在血清中稳定表达，血清miRNA的表达与组织具有很 好的一致性，118&-111丨1?-19313-3。、118&-111丨1?-384和118&-111丨1?-145-5。表达下调，118&-111丨1?-424-5口 和hsa-miR-143-3p表达上调。结果表明，这5种miRNA可作为甲状腺癌诊断的生物标志物。
[0146] 实施例3:受试者工作特征曲线(R0C)分析
[0147] 构建R0C曲线来比较5个血清miRNA区分甲状腺癌病人和健康对照的诊断能力。5个 miRNAROC曲线下面积（AUC)分别为：hsa-miR-193b-3p，0.802(95%置信区间：0.760-0.920) ;hsa-miR-384,0.809(95%置信区间：0.736-0.902) ;hsa-miR-145-5p，0.804(95% 置信区间：〇 · 734-0 · 894); hsa-miR-424-5p，0 · 803 (95 % 置信区间：0 · 765-0 · 920); hsa-miR-143-3p，0.734(95%置信区间：0.644-0.832)。在最佳的cut off值下，miRNA的灵敏度和特 异性如下：hsa-miR-193b-3p，分别为83.3 % 和82.7 % ; hsa-miR-384，分别为64.8 % 和 94.2%;1183-11^1?-145-5?，分别为90.7%和61.5%;1183-1^1?-424-5?，分别为70.4%和 82.5% ;hsa-miR-143-3p，分别为67.3 %和74.1 %。这5个miRNA联合起来的AUC可以达到 〇 . 985，灵敏度和特异性分别为93.1 %和93.7 %，明显优于单个miRNA。该结果表明，1^&-miR-193b-3p、hsa-miR-384、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-424-5p 和 hsa-miR-143_3p 联合起来 对甲状腺癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。
[0148] 实施例4:人甲状腺癌诊断用试剂盒
[0149] 上述实施例表明，hsa-miR-193b_3p、hsa-miR-384、hsa-miR-145_5p、hsa_miR-424-5p和hsa-miR-143-3p联合起来对甲状腺癌检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此， 可基于]18&-11111?-19313-3卩、118&-11111?-384、118&-11111?-145-5卩、118&-11111?-424-5卩和118&-11111?-143-3p制作用于人甲状腺癌诊断用的试剂盒。该试剂盒包括hsa-miR-193b-3p引物、探针;hsa-miR-384 引物、探针;hsa-miR-145-5p 引物、探针;hsa-miR-424-5p 引物、探针；hsa-miR-143-3p引物、探针。引物具体包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。当然，该试剂盒 中还应该包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、MgCl 2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。下 表为引物和探针的一种设计。
[0151] 引物和探针的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。
[0152] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离 本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 用于人甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于包括:hsa-miR-193b-3p、 hsa-miR-384、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-424_5p 和 hsa-miR-143_3p;所述 hsa-miR-193b_3p 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述hsa-miR-384的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所 述hsa-miR-145-5p的核苷酸序列如SEQ ID如.3所示;所述118311丨1?-424-5口的核苷酸序列 如SEQIDN0.4所示;所述hsa-miR-143-3p的核苷酸序列如SEQIDN0.5所示。2. 根据权利要求1所述的用于人甲状腺癌诊断的microRNA生物标志物，其特征在于:所 述m i cr oRNA生物标志物为人血清m i cr oRNA生物标志物。3. 人甲状腺癌诊断用microRNA引物、探针的组合，其特征在于:包括hsa-miR-193b-3p 引物、探针，hsa-miR-384 引物、探针，hsa-miR-145-5p 引物、探针，hsa-miR-424-5p 引物、探 针，hsa-miR-143-3p引物、探针;所述引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引 物 ;hsa-miR-193b-3p的反转录引物序列如SEQIDN0.6所示，定量PCR前引物序列如SEQID NO. 7所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示;hsa-miR-384的反转录引物序列如SEQ ID NO. 8所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 9所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID N0.16所示;hsa-miR-145-5p的反转录引物序列如SEQIDN0.10所示，定量PCR前引物序列 如SEQIDN0.11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDN0.16所示 ;hsa-miR-424-5p的反转录 引物序列如SEQ ID NO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQ ID NO. 13所示，定量PCR后引物 序列如SEQIDN0.16所示;hsa-miR-143-3p的反转录引物序列如SEQIDN0.14所示，定量 PCR前引物序列如SEQ ID NO. 15所示，定量PCR后引物序列如SEQ ID NO. 16所示；各 microRNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。4. 一种人甲状腺癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于:包括如权利要求3所述的microRNA 引物、探针的组合。5. 根据权利要求4所述的人甲状腺癌的肿瘤诊断试剂盒，其特征在于：还包括逆转录 酶、缓冲液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及标准品和/或对照品。
【文档编号】C12N15/11GK105950730SQ201610339115
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月21日
【发明人】崔学俊
【申请人】崔学俊