利用rs4818多态性检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用rs4818多态性检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒，SNP rs4818位于SEQ ID NO：1所示序列的第790位，该位点为C。本发明采用Taqman?MGB探针技术对COMT基因的第四号外显子SNP位点及其频率分布情况进行了检测。已经发现了COMT基因的第四号外显子第21944位C→G多态性，即其所编码的蛋白质序列中第136位氨基酸Leu(L)→Leu(L)多态。
【专利说明】
利用rs4818多态性检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，具体涉及一种利用 rs4818多态性检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒，特别是一种分离核酸、一种等位基 因特异性的核酸引物和C0MT基因第四号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。
【背景技术】
[0002] 奎硫平(Quetiapine)化学名为11-{4-[2-(2-(羟乙氧基）乙基-1-哌嗪]}二苯并 [13，幻[1，4]硫氮杂草1/2富马酸盐，分子式〇2此飩()23_1/2〇4114()4。喹硫平是一种新型的抗精 神病药，对多巴胺、5-羟色胺等多种神经递质受体均有相互作用。临床研究表明奎硫平不仅 对精神分裂症阳性症状有效，对阴性症状也有一定效果。也可以减轻与精神分裂症有关的 情感症状如抑郁、焦虑及认知缺陷症状。常见不良反应为头晕、嗜睡、直立性低血压、心悸、 口干、食欲不振和便秘。亦可引起体重增加、腹痛，无症状性ALP增高与血总胆固醇和甘油三 酯增高。虽然与经典的抗精神病药相比，喹硫平所致的药物不良反应虽然较少，耐受性较 好，但是一旦发生会造成神经系统、肝胆系统、消化系统及心血管系统的严重损伤。利培酮 (Risperidone)化学名为 3-[2-[4-(6_ 氟-1,2-苯并异噁唑-3-基)-1-哌啶]乙基]-6,7,8,9-四氢-2-甲基-4H-吡啶并[1，2-a]嘧啶-4-酮，分子式为C23H27FN402，是苯异恶唑的衍生物， FDA批准的第二代抗精神病药物。它是一种多巴胺拮抗剂，有抗血清素、抗肾上腺、抗组胺的 功能，能与多种受体结合产生拮抗或者反向激动作用。大脑边缘系统中多巴胺D2受体的阻 断能改善精神分裂症的阳性症状，包括幻觉、妄想、语言和行为障碍。研究表明，奎硫平和利 培酮的药效和药物副作用有明显的个体差异，原因是其代谢受到遗传因素及环境因素的影 响，但遗传因素是最主要的原因。因此开发更多的与奎硫平/利培酮代谢相关的分子标记物 从而对患者实现个体化治疗是非常有必要的。
[0003] COMT(Catechol-O-methyltransferase)基因位于人类第 22号染色体ql 1 · 21上，在 不同的细胞中被翻译成不同长度的蛋白。在大脑的神经细胞中，C0MT基因表达为膜结合的 儿茶酚-0-甲基转移酶蛋白；大脑中的儿茶酚-0-甲基转移酶蛋白主要分布在前额叶皮质 区，它可以保证神经递质如多巴胺等在一个稳定的水平上。在肝、肾及血液等器官中表达为 可溶性的儿茶酚-〇-甲基转移酶蛋白，它可以催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到儿茶酚胺 上，此类物质包括神经递质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等。C0MT基因在代谢治疗高血 压、哮喘、帕金森疾病的儿茶酚药物方面起着重要的作用。由于奎硫平与多巴胺、5-羟色胺 等多种神经递质受体均有相互作用，因此寻找奎硫平和利培酮代谢与C0MT基因多态性的关 系是现有技术急需解决的难题。
[0004] 对现有文献的检索，未发现有本发明的C0MT基因第四号外显子SNP rs4818为奎硫 平和利培酮分子标记物的相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种利用rs4818多态性检测奎硫 平和利培酮用药效果的试剂盒，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物。 本发明通过关联分析找到了COMT基因第四号外显子上的SNP rs4818可以作为奎硫平和利 培酮的分子标记物。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种分离的含单核苷酸多态性位点的核苷酸，所述核苷酸 的序列如SEQ ID N0:1所示，所述单核苷酸多态性位点位于第790位，rs4818为C-G。
[0008] 第二方面，本发明提供一种所述的核苷酸在制备检测奎硫平和利培酮用药效果的 试剂盒中的用途。
[0009] 第三方面，本发明提供一种分离的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所 示，且第790位为C。
[0010] 第四方面，本发明提供一种检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒，所述试剂盒 包括:根据如SEQ ID N0:1所示序列的第790位的上下游设计的引物对，探针。
[0011] 优选地，所述引物对为：
[0012] 正向引物：5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 '
[0013] 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '
[0014]优选地，所述探针为：
[0015] 正向 5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3，
[0016] 反向5 ' -VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。
[0017]第五方面，本发明提供一种所述的试剂盒的非诊断目的使用方法，其特征在于，包 括如下步骤：
[0018] 步骤一，提取样品DNA;
[0019]步骤二，利用所述引物进行扩增，得扩增产物；
[0020] 步骤三，采用Taqman-MGB分型方法，结合探针，检测样品中是否存在如SEQ ID N0: 1所示的单核苷酸多态性位点rs4818。
[0021] 优选地，步骤三包括如下步骤:采用ABI7700荧光定量PCR仪，对所取样品的位点 rs4818进行分型，检测第790位否存在单核苷酸多态性。
[0022]优选地，所述扩增产物的长度为50_150bp。
[0023] 优选地，所述引物的长度为15_25bp。
[0024] 优选地，步骤二中，所述扩增的具体条件如下:反应体系总体积为5μ1，其中： 2 XMaster Mix 2. 5M-1? 40 XTaqraan genotype assay 1, 25Pl, DNA 模板 5-lOng,
[0025] ΙΟρΜ SEQ ID So. 3 0. 2μ1；? 10pM SEQ ID No. 4 0. 2μ1, 双蒸水 补足至.5_u.l;.
[0026] PCR反应条件：94°C2mins; 40 X (94°C30s; 58°C30s，72°C30s)72°C 1 Omins。
[0027] 第六方面，本发明提供一种用于检测所述核苷酸的SNP位点的引物对，所述引物对 为：
[0028] 正向引物：5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 '
[0029] 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '。
[0030] 第七方面，本发明提供一种用于检测所述核苷酸的SNP位点的探针，所述探针为：
[0031] 正向 5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3，
[0032]
[0033]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:本发明为研究C0MT基因多态性与 临床用药安全的关系奠定了基础，为临床用药个体化提供理论基础，同时也为基于药物基 因组学理念的新药研发提供指导依据。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常规条件，例如Sambrook等 人的分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0035]本发明采用的样品来自上海市精神卫生中心的995个精神分裂症患者，年龄18~ 60岁。全体参与者均由患者及家属在正式的知情同意书上同意签字。
[0036]本发明采用Taqman-MGB探针技术对C0MT基因的第四号外显子SNP位点及其频率分 布情况进行了检测。已经发现了 C0MT基因的第四号外显子第21944位C-G多态性(对应SEQ ID N0:1的第790位），即其所编码的蛋白质序列中第136位氨基酸Leu(L)4Leu(L)多态。 [0037]具体方法如下：
[0038] 在C0MT基因第四号外显子上的SNP rs4818上下游设计Taqman-MGB引物，扩增产物 长度50-150bp;在上下游引物之间设计Taqman-MGB探针，探针长15-25bp。然后用ABI7700荧 光定量PCR仪对所取样品C0MT基因 SNP位点rs4818进行分型，发现⑶MT基因第四号外显子 SNP(即第21944位C-G多态性）。经分析发现，该SNP导致第136位氨基酸由Leu(L)-Leu(L)。
[0039] C0MT基因第四号外显子的cDNA序列列于SEQ ID N0:1，其所编码的氨基酸序列列 于SEQ ID Ν0:2<Χ0ΜΤ基因第四号外显子的基因组序列可以从GenBank(ID:1312)中获得。
[0040] 本发明有大量的分析技术可用于检测C0MT基因第四号外显子中所述位点是否存 在单核苷酸多态性。这些技术包括(但并不限于）：DNA测序、杂交测序;酶促错配切割、异源 双链分析、点杂交、寡核苷酸阵列(DNA芯片）、Mini-sequencing、分子信标等，变性高效液相 色谱法（DHPLC)。另一方面，本发明的检测方法被用于评估个体C0MT基因第四号外显子 SNPrs4818多态性与奎硫平和利培酮代谢的关系。用于本发明的测试样品没有特别限制，对 于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于C0MT基因第四号外 显子活性而言，可以任何含有C0MT基因第四号外显子的样品，如血液等。
[0041] 本发明为研究我国人群中C0MT基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为 临床用药个体化提供理论基础，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依 据。
[0042]更具体地，本发明是通过如下方法实现的：
[0043] 一种核酸的分离和测序
[0044] 引物设计：
[0045] 采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库C0MT基因（ID:1312)第四号外显子以及外 显子与内含子接合部位序列为模板设计一对引物，由Invitrogen公司合成。
[0046] 引物信息：
[0047]扩增C0MT基因第四号外显子SNP位点的DNA序列引物信息：
[0048] 正向引物（SEQ ID No.3):5'-ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3'
[0049] 反向引物（SEQ ID No.4):5'-TTCACGCCAGCGAAATCCA-3'
[0050] Taqman-MGB 探针
[0051] 正向5，-FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA(SEQIDNo·5)-NFQ-MGB-3，
[0052] 反向5，-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA(SEQIDNo·6)-NFQ-MGB-3，
[0053] PCR扩增条件：（体系各项试剂除DNA外均由ABI公司提供）
[0054] 反应体系总体积为5μ1，其中 2 X Mas ter Mix 2. 5:μΙ， 40XTaqman genotype assay 1, 25)^1, DNA 模板 5-1.0n:g:，
[0055] ΙΟρΜ SEQ ID No. 3 G. 2μ1? 10pM SEQ ID No：, 4 0,2W, 双蒸水 补足至5ul;
[0056] PCR 反应条件：94Γ2π?η8;40Χ(94Γ308;58Γ308,72Γ308)72Γ?0π?η8。
[0057] 上述PCR反应在96孔板中进行，置于ABI7700荧光定量PCR仪中，可以读出各个样品 中C0MT基因第四号外显子SNPr s4818多态性。比较发现C0MT基因第四号外显子SNP有多态性 (即第21944位C-G)。经分析发现，该SNP导致第136位氨基酸由L eU(L)-LeU(L);关联分析 发现C0MT基因第四号外显子SNPr s4818的C基因型与G基因型患者用奎硫平治疗前后的P值 为0.007(见表1)，用利培酮治疗前后的P值为0.039(见表2)，两种药物治疗前后都有显著的 个体差异。
[0058] C0MT基因⑶S及其多态性位点的⑶S序列如SEQ ID N0.1所示;C0MT基因⑶S及其多 态性位点的氨基酸序列如SEQ N0.2所示。
[0059] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
[0060] 表 1
【主权项】
1. 一种分离的含单核苷酸多态性位点的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示，所述单核苷酸多态性位点位于第790位，rs4818为C-G。2. -种如权利要求1所述的核苷酸在制备检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒中的 用途。3. -种分离的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0:1所示，且第790位 为C。4. 一种检测奎硫平和利培酮用药效果的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:根据如 SEQ ID NO: 1所示序列的第790位的上下游设计的引物对，探针。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述引物对为： 正向引物:5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 ' 反向引物：5 ' -TTCACGCCAGCGAAATCCA-3 '6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征是，所述探针为： 正向 5 ' -FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。7. -种如权利要求4至6任一项所述的试剂盒的非诊断目的使用方法，其特征在于，包 括如下步骤： 步骤一，提取样品DNA; 步骤二，利用所述引物进行扩增，得扩增产物； 步骤三，采用Taqman-MGB分型方法，结合探针，检测样品中是否存在如SEQ ID N0:1所 示的单核苷酸多态性位点rs4818。8. 如权利要求7所述的使用方法，其特征是，步骤三包括如下步骤:采用ABI7700荧光定 量PCR仪，对所取样品的位点rs4818进行分型，检测第790位否存在单核苷酸多态性。9. 如权利要求7所述的使用方法，其特征是，所述扩增产物的长度为50-150bp。10. 如权利要求7所述的使用方法，其特征是，所述引物的长度为15-25bp。11. 如权利要求7所述的使用方法，其特征是，步骤二中，所述扩增的具体条件如下：反 应体系总体积为5μ1，其中： 2 XMaster Mix 2. 5μ1, 40Χ Taqman genotype assay 1. 25Μ?. DNA 模板 5-IQng， ΙΟρΜ SEQ ID Nq, 3 ：〇, 2P-1, ΙΟρΜ SEQ ID No. 4 0* 2.μ1, 双蒸水 补足至5u]_; PCR反应条件：94 °C 2mins; 40 X (94 °C 30s; 58 °C 30s，72 °C 30s) 72 °C lOmins。12. -种用于检测如权利要求1所述核苷酸的SNP位点的引物对，其特征在于，所述引物 对为： 正向引物:5 ' -ACGCCGTGATTCAGGAGCA-3 ' 反向引物：5'-TTCACGCCAGCGAAATCCA-3'。13.-种用于检测如权利要求1所述核苷酸的SNP位点的探针，其特征在于，所述探针 为： 正向 5 ' -FAM-AGGCTCATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 ' 反向5 '-VIC-AGGCTGATCACCATCGAGA-NFQ-MGB-3 '。
【文档编号】C12Q1/68GK105950724SQ201610297944
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】秦胜营, 周伟, 徐青青, 施烨, 沈陆, 贺林
【申请人】上海交通大学