miR-4443及其靶基因在诊治软骨母细胞型骨肉瘤中的应用
【专利摘要】本发明涉及miR?4443及其靶基因在诊治软骨母细胞型骨肉瘤中的应用。对软骨母细胞型骨肉瘤患者及健康对照miRNA和mRNA进行高通量测序，获得其表达数据，生物信息学分析选取候选基因，进而采用RT?PCR实验验证及干扰实验验证靶标，结果表明本发明提供的miR?4443及其靶基因与软骨母细胞型骨肉瘤密切相关，为临床诊断及预防奠定了很好的研究基础，具有很好的应用前景。
【专利说明】
mi R-4443及其朝基因在诊治软骨母细胞型骨肉瘤中的应用
技术领域
[00011本发明涉及疾病诊疗领域，具体的涉及miR-4443及其靶基因在诊治软骨母细胞型 骨肉瘤中的应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)是一类长约19-23个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，大 量的研究表明microRNA是一类重要的调控因子，曾经被认为是非常不稳定的miRNA却可以 稳定存在于血液和其他体液中，更加重要的是，细胞外miRNAs被发现和多种疾病密切相关， 它们可以作为诸如肿瘤等各种疾病的非侵入性生物标志物。越来越多的研究表明，miRNA的 表达具有时序特异性和组织特异性。每种miRNA针对的数个甚至上百个潜在靶基因，在不同 的细胞或同一细胞的不同状态下是否能发挥功能性靶标的作用也有所不同。这些研究结果 不但说明miRNA及其靶标具有时空动态变化的特性，而且也提示miRNA在机体内发挥作用的 复杂性。
[0003] 软骨母细胞型骨肉瘤是骨肉瘤的一个亚型，内有较多的具明显异型性的软骨成 分。鉴别软骨母细胞型骨肉瘤的意义在于防止其被误诊为软骨肉瘤，因为两者的治疗和预 后有显著差别。软骨肉瘤的治疗方法主要为手术切除，预后与组织学分型和手术切除是否 完整有关，预后相对较好。而骨肉瘤除手术切除外需辅以化疗，且总体预后较软骨肉瘤差。 由于治疗方法和预后的不同，鉴别软骨母细胞型骨肉瘤和软骨肉瘤对临床治疗方案的确定 具有重要意义，特别是近年来骨肉瘤的治疗强调术前化疗以提高保肢率和生存率，术前正 确诊断显得尤为重要。
[0004] 本发明对软骨母细胞型骨肉瘤患者及健康对照miRNA和mRNA进行高通量测序，获 得其表达数据，生物信息学分析选取候选基因，进而采用RT-PCR实验验证及干扰实验验证 靶标，结果表明本发明提供的miR-4443及其靶基因与软骨母细胞型骨肉瘤密切相关，为临 床诊断及预防奠定了很好的研究基础，具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种防治骨肉瘤的制剂，制剂包含：
[0006] (a)抑制剂或抑制剂组合物，抑制剂或抑制剂组合物下调mir-4443或miR-4443的 转录，或者阻断mir-4443或miR-4443的活性；
[0007] (b)药剂学上能接受的载体。
[0008] mir-4443的序列为SEQ ID NO l，miR-4443序列为SEQ ID N0 2。
[0009] 优选的，采用反义寡核苷酸、miRNA海绵、antagomiRs、Target Masking miRNA Erasers、或多祀点反义寡核苷酸的方法下调mir-4443或miR-4443的转录，或者阻断mir-4443或 miR-4443 的活性。
[0010] 进一步，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
[0011] 本发明的目的在于提供上述防治骨肉瘤的制剂在制备骨肉瘤治疗药物或试剂中 的应用。
[0012] 本发明提供一种骨肉瘤诊断试剂，骨肉瘤诊断试剂能够检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443转录或免疫方法检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443调控的靶基因的 表达情况。
[0013] 进一步，骨肉瘤诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于 探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443的转录或基于免疫方法检测骨肉瘤 样本中mir-4443或miR-4443调控的革巴基因的表达情况，优选采用northern杂交方法、miRNA 表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测骨肉瘤样 本中mir-4443或miR-4443的转录;采用ELISA和/或胶体金试纸条检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-4443或miR-4443调控的靶基因为 NABP1、CD274、ARL17A，ELI SA和/或胶体金试纸条中含有与NABP1和/或CD274和/或ARL17A蛋 白特异性结合的抗体。
[0014] 优选的，基于定量PCR方法使用引物SEQ ID N0 3检测骨肉瘤样本中miR-4443的转 录。
[0015] 进一步，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
[0016] 优选的，骨肉瘤样本为外周血。
[0017] 本发明的目的在于提供上述骨肉瘤诊断试剂在制备骨肉瘤检测试剂中的应用。
[0018] 本发明提供mir-4443及miR-4443调控的靶基因在制备诊断或防治骨肉瘤试剂中 的应用。
[0019] 进一步，检测mir-4443及miR-4443调控的靶基因的试剂在制备诊断骨肉瘤试剂中 的应用。
[0020] 进一步，上调mir-4443及miR-4443的靶基因的试剂在制备防治骨肉瘤试剂中的应 用。
[0021] 进一步，靶基因为NABP1和/或⑶274和/或ARL17A基因。
[0022] 进一步，检测mir-4443或miR-4443调控的革E1基因的制剂在制备诊断骨肉瘤试剂中 的应用。
[0023] 优选的，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。
[0024] 进一步，诊断骨肉瘤制剂采用荧光定量PCR试剂盒、基因芯片、免疫方法检测骨肉 瘤患者外周血中NABP1、⑶274、ARL17A基因的表达。优选的，焚光定量PCR试剂盒中含有特异 性扩增NABP1、CD274、ARL17A基因的引物;所述的基因芯片中包括与NABP1、CD274、ARL17A基 因的核酸序列杂交的探针。更优选的，荧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测NABP1、CD274、 ARL17A基因的上游引物和下游引物，NABP1上游引物序列为SEQ ID N0 4,下游引物序列为 SEQ ID NO 5;CD274上游引物序列为SEQ ID N0 6,下游引物序列为SEQ ID NO 7;ARL17A上 游引物序列为SEQ ID NO 8,下游引物序列为SEQ ID NO 9。
[0025] 进一步，骨肉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测骨肉瘤外周血中NABP1、CD274、 ARL17A基因的表达产物。优选的，免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。进一步，检测 NABP1、CD274、ARL17A蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。试剂盒中的抗体可采用市售 的嫩8?1、0)274^此174单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，试剂盒包括:包被祖8?1、0)274、 ARL17A抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶 反应终止液等。
[0026] 进一步，检测NABP1、CD274、ARL17A蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，抗体可采 用市售的NABP1、⑶2 74、ARL17 A单克隆抗体或多克隆抗体。进一步，胶体金检测试剂盒采用 胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。进一步，胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测 区(T)喷点有抗NABP1、⑶274、ARL17A抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0027] 本发明的目的在于提供上述骨肉瘤诊断制剂在制备骨肉瘤诊断工具中的应用。 [0028] 进一步，上调NABP1、⑶274、ARL17A基因的制剂在制备防治骨肉瘤试剂中的应用。 [0029] 优选的，采用构建含上述基因的过表达载体等方式上调NABP1、CD274、ARL17A基因 的表达。
[0030] 定义：
[0031] 现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸 杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测法， 不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技 术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
[0032] (1 )Northern 杂交
[0033]又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基 本原理如下：首先在载体(如娃片、微球或膜等)上固定miRNA样本，再与经过标记的探针杂 交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补的 DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素 标记、荧光标记和纳米金标记等。
[0034] (2)miRNA表达谱芯片
[0035]原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA 基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优 点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又称多功能悬浮点阵（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的新 一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不 同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的 色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同 一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为 FMAP(Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极 快。
[0036] (3)核酶保护分析技术(RPA)
[0037] miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混 合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受 保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单 快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0038] (4)RAKE法
[0039] RAKE法（RNA primed array based Klenow emzyme)是在miRNA microarray的基 础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以敏感 特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿瘤中 检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中 分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。
[0040] (5)原位杂交（in situ hybridization)
[0041 ] 原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便的 方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方 式。
[0042] (6)基于微球的流式细胞术(bead-based flow cytometry)
[0043] 是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有 通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
[0044] (7)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)
[0045] 荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反 应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用 特定阈值循环数Ct来表达)越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合扩增如此 短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种 理想的miRNA检测qRT-PCR方法:首先设计特殊的茎环结构引物，以待测miRNA为模板逆转录 合成cDNA第一链，该cDNA-端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了 cDNA的长度，随后 以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快 速简单等多种优点。
[0046] (8)测序法
[0047] 大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建miRNA 的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发了一种改 进的扩增克隆法(miRNA amp 1 if i cat ion prof i ling，mRAP)，mRAP 法先在 miRNA的 3 ' 端连上 接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸 转移酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cDNA链的3 '末端。当5 ' 端接头与cDNA链的poly (C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cDNA的PCR扩 增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA的表达量。标签 序列克隆法是一种在在基因表达系列分析（SAGE)技术的基础上发展了检测效率更高的 miRAGE(miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个 miRNA，明显提高了检测效率。
[0048] 高通量测序（High-throughput sequencing)又称下一代测序技术（next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗 传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高通量 测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度 测序（deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司（Roche)的454测序仪(Roch GSFLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer)和 ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer)。
[0049] 免疫检测方法是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性 分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏 感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应， 从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电 子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术 (immunolabelling technique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有:酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，胶体金免疫层析法等。
[0050] 酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶 的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物 作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定0D值判定结果。
[0051] 胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝 化纤维膜(NC)、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中NC膜 最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即 可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定量 的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次固定 于PVC板，即成试纸条。
[0052] 基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质来 升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA(short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修饰 后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。
[0053]基因特异性miR Mimics技术该技术避免了miRNA与基因的非特异性作用。这种人 工合成的与靶基因3'UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录后调 节作用。
[0054] 包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载 体，该载体包含乳糖（lactose)、右旋糖(dextrose)、鹿糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘 露醇(mannitol )、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸|丐、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、娃酸|丐、 微晶纤维素、聚乙稀吡略烧酮化〇17￥；[117]^71'1'〇1丨(1〇116)、纤维素(0611111〇86)、水、糖衆、甲 基纤维素 (methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯 甲酸丙酯（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearic acid magnesium)及矿物 油(mineral oil)等，但并非局限于此。
[0055] 本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香 味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏 药学全书。
[0056] 本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通 过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮 给药等方式进行给药。
[0057]本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以 进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给 药剂量。
[0058]本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施 的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态 制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或 乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散 剂或者稳定剂。
【附图说明】
[0059] 图1是RT-PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤中miR-4443相对表达水平图 [0060]图2是RT-PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤中基因相对表达水平图
【具体实施方式】
[0061] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0062] 实施例1样品的收集及总RNA提取
[0063] 3例软骨母细胞型骨肉瘤患者，临床信息见表1，10名健康对照。软骨母细胞型骨肉 瘤患者组3例及对照组10人要求空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室温下，抽取10ml静 脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞TOMCs，加入lml Trizol试剂 (Invitrogen公司），充分混匀，-80°C保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应 真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。
[0064] 表1软骨母细胞型骨肉瘤患者临床信息
[0065]
[0066] RNA提取标准：RNA纯度：0D260/280 兰 1 · 8，28S/18S 兰 1; RNA完整性：RIN值兰 7 · 0。 RNA完整性检测方法:Agilent 2100(RNA 6000Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓 度：1 %琼脂糖胶；电压:5V/cm;时间：20min)。
[0067]实施例2文库构建、测序及数据分析
[0068] mRNA文库构建:真核生物mRNA 3'末端具有ployA尾的结构，利用带有Oligo(dT)的 磁珠富集mRNA，高温片段化后，以其为模板，合成cDNA。经过磁珠纯化、末端修复、3 '末端加 碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，构建mRNA文库。根据RNA样本检测结果，对软骨母细胞 型骨肉瘤患者与正常对照组进行mRNA文库构建。
[0069] sRNA文库构建:实验采用Illumina TruSeq Small RNA试剂盒构建文库，在总RNA 中回收长度18_30nt RNA，通过RT-PCR逆转录成单键cDNA，cDNA扩增后，回收cDNA产物，建成 小RNAs文库。根据RNA样本检测结果，对软骨母细胞型骨肉瘤患者与正常对照组进行sRNA文 库构建。
[0070] 测序:运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA和miRNA进行 测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
[0071] 通过转录组数据分析软件对miRNA及mRNA原始数据进行背景校正后进行t-test得 至丨JP值，然后利用Fisher检验合并P值，筛选差异表达miRNA及mRNA。设定p值<0.01且log 2 $〇1(1_(3113]^6)1101'1]^1丨26(1的绝对值^:3作为显著性阈值，共筛选出11个差异表达的1]1丨1^^， 其中表达水平上调的miRNA 5个，表达水平下调的miRNA 6个。分析过程中设定P值<0.05， 共筛选出929个差异表达的mRNA，其中表达水平上调的基因455个，表达水平下调的基因474 个。其中，表达上调明显的miR-4443-5p纳入我们的研究范围。
[0072] 实施例3Real-time PCR检测软骨母细胞型骨肉瘤组织中miR-4443-5p和NABP1、 CD274、ARL17A基因的表达 [0073] 1样品米集：
[0074] 19例软骨母细胞型骨肉瘤肿瘤患者和36例健康对照的外周血均来自医院(采集时 间2014年3月-2015年12月）。
[0075] 2 总 RNA 提取：
[0076]相关实验物品的去Rnase的处理：
[0077] ①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120°C高压20min，180°C高温烤干2 小时以上。
[0078]②将塑料器皿（如：EP管/枪头）使用前需用0.1 % DEPC水侵泡过夜，后控干液体， 120°C高压20min，烤箱烤干备用。
[0079] 白细胞分离
[0080] (1)取2ml抗凝外周血(采血时间不超过3h);
[0081] (2)加入等体积无菌PB S于外周血中充分混合，形成细胞悬液；
[0082] (3)加入4ml淋巴细胞分离液于另一离心管；
[0083] ( 4 )吸取4m 1细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面。离心 1500rpm20min；
[0084] (5)用吸管轻轻吸出界面层入另一离心管中。无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以 将细胞悬液移入EP管中，离心去上清，用于提取RNA。
[0085] RNA 提取
[0086] (1)先加 lml Trizol于EP管中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解 后室温静置5-10min;
[0087] (2)加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置2-3min，在4°C下1 2000转离心15min;
[0088] (3)小心吸出上清水相约600ul移入另一离心管，加入500:1异丙醇，颠倒混匀，室 温静置l〇min;
[0089] (4)4Γ1 2000g离心1 Omin，弃上清液，底部可见白色物质；
[0090] (5)加入lml 75%冷乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇；
[0091] (6)4°C7500g离心5min，去除乙醇后晾5-10min，半透明即可，以20ulDEPC水溶解 RNA。取3u 1RNA样本，于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳；lulRNA样品于紫外分光光度计检测浓度， 以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。
[0092] 3逆转录
[0093] mRNA 逆转录：
[0094] 取lyg总RNA作为模板RNA，米用SuperScripl/K. Ill Reverse Transcriptase (invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA 保存放-20 °C冰箱备用。
[0095] miRNA 逆转录：
[0096] RT体系的配制：lyg总RNA作为模板RNA;5XmiScript HiSpec Buffer 4μ1;10Χ Nucleics Mix 2μ1 ；miScript Reverse Transcriptase Mix 2μ1;灭菌水补平至20μ1 〇ABI 9700型PCR仪上37°C保温60min使逆转录反应完全后，95°C5min终止反应。加入80μ1 Nuc 1 ease-free Η20稀释至100μ1储存在-20 °C冰箱备用。
[0097] 4荧光定量PCR
[0098] 引物设计：
[0099] NABP1 引物（NM_001031716):
[0100] 正向引物：5'-AGGTCATCAGTCATTAGTTAG-3'SEQ ID NO 4
[0101] 反向引物：5'-AGTGGTGGCATTAGATTC-3'SEQ ID NO 5
[0102] 扩增产物长度109bp。
[0103] CD274 引物（NM_001267706):
[0104] 正向引物：5'-GTCTATTCCTAAGTCCTAAC-3'SEQ ID NO 6
[0105] 反向引物：5'-GGTATCATCTCTGCCTAT-3'SEQ ID NO 7
[0106] 扩增产物长度105bp。
[0107] ARL17A 引物（NM_001113738):
[0108] 正向引物：5'-TCGGTGACAACATATCTG-3'SEQ ID NO 8
[0109] 反向引物：5'-ATAGCAAGGATGACTGAAC-3'SEQ ID NO 9
[0110] 扩增产物长度197bp。
[0111] mRNA的RT-PCR体系的配制：
[0113] mRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以actin作为内参。
[0114] 扩增程序为:95°10min，45 个循环(95°C15s，55°C60s)。
[0115] miRNA的RT-PCR体系的配制：
[0116]
[0117] miRNAs的表达检测每次设置3个平行管反应，以snRNA U6作为内参。
[0118] 扩增程序：95°C lOmin; 40个循环（95°C 10s，55°C 30s)。
[0119] 5统计学分析
[0120] 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效 率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高;样本扩增产物溶 解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增;根据qRT-PCR的相对定量公式:2_ 厶(^\100%，比较11^1?-4443、祖8?1、〇)274^虬174基因在软骨母细胞型骨肉瘤组和正常组 中的表达水平。结果显示:qRT-PCR扩增结果稳定，其中miR-4443在软骨母细胞型骨肉瘤组 表达水平明显高于正常对照组，约是对照的九倍(具体见图1)，而NABP1、⑶274、ARL17A在软 骨母细胞型骨肉瘤组中的表达水平低于正常对照，分别约为对照组的十分之四、十分之二 和十分之三(具体见图2)，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析的结果。
[0121] 实施例4miR-4443与NABP1、CD274、ARL17A靶基因关系验证
[0122] 一、材料准备：
[0123] ( - )标本来源
[0124] 人骨肉瘤细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。
[0125] (二)主要试剂
[0126] Lipofectamine?2000Transfection Reagent(Invitrogen)〇
[0127] NABP1、CD274、ARL17A 引物设计(见实施例 3):
[0128] miR-4443序列发给合成公司，请其化学合成miR-4443mimics及非特异性对照。 [0129](三)主要溶液 [0130] 1、细胞培养液
[0131] DMEM培养基+10%标准胎牛血清。
[0132] 2、PBS (平衡盐溶液）
[0133] 在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl，0.25g KCl，1.44g Na2HP04和0.24g KH2P04用HC1 调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，高压灭菌，室温保存。
[0134] 3、0· 25 %胰蛋白酶消化液
[0135] 0.25g胰蛋白酶加入100ml去离子水中，滤器过滤灭菌，分装备用。
[0136] 二、实验方法
[0137] 1、细胞传代
[0138] (1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去，加入0.25 %胰蛋白酶液lml，覆盖 细胞层，瓶口消毒，加盖；
[0139] (2)倒置显微镜下观察细胞变化，随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形， 细胞间质回缩，细胞间隙加大，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml含10%胎牛血清的培养 液终止消化；
[0140] (3)细胞计数:取上述细胞悬液0.5ml，适当稀释后滴入血细胞计数板内，按白细胞 计数法数四角四大格内细胞总数，计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞，成堆的细胞 按一个细胞计算，将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数： 细胞总数/ml = 4大格细胞总数/4 X 104 X稀释倍数；
[0141] (4)根据细胞计数结果，用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3 X105个细胞 浓度，分装于培养瓶中（8ml/每瓶），放置于37°C，5%C02培养箱中培养。2.miRNA瞬时转染 [0142] 采用阳离子脂质体法进行瞬时转染，操作按照Lipofectamin?2000试剂说明书进 行。转染前24h将生长状态良好的细胞接种到12孔板中，细胞计数约2 X104,常规培养至转 染当天，细胞融合度为5〇-60%时进行试验。将2〇11]\1/4〇11]\1/8〇11]\1111丨1?财111丨111丨(3加入到 lOOulDMEM培养基中，轻柔混匀；另用lOOulDMEM培养基稀释2ulLipofectamin?2000脂质体， 轻柔混匀，室温孵育5min;混合DMEM-脂质体与DMEM-miRNAs，室温孵育20min，以形成转染复 合物;然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，培养6h后更换完全培养基。其中，非 特异性序列作为阴性对照。培养48h后提取细胞总RNA进行下一步实验。
[0143] 3.实验结果：
[0144] 将miR-4443mimi cs转染至人骨肉瘤细胞株MG-63中，48h后提取细胞总RNA，空白对 照为未转入miRNA的人骨肉瘤细胞株细胞，非特异性序列作为阴性对照。定量PCR检测靶基 因嫩8?1、0)274、4此174的11^祖的水平变化。结果显示嫩8?1、0)274^此174表达水平均有不 同程度的下调，表明嫩8?1、0)274^此174都是11^-4443的目标靶基因，其中0)274下调表达 最为显著，可能是miR-4443优先调控的革E标基因。
[0145] 虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各 种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来 使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
【主权项】
1. 一种防治骨肉瘤的制剂，制剂包含： (a) 抑制剂或抑制剂组合物，抑制剂或抑制剂组合物下调mir-4443或miR-4443的转录， 或者阻断mir-4443或miR-4443的活性； (b) 药剂学上能接受的载体。2. 根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，骨肉瘤为软骨母细胞型骨肉瘤。3. 根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，采用反义寡核苷酸、miRNA海绵、 antagomiRs、Target Masking miRNA Erasers、或多革El点反义寡核苷酸的方法下调mir-4443 或 miR-4443 的转录 ，或者阻断 mir-4443 或 miR-4443 的活性。4. 权利要求1-3所述的制剂在制备骨肉瘤治疗药物或试剂中的应用。5. -种骨肉瘤诊断试剂，其特征在于，所述试剂检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443转录或免疫方法检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443调控的靶基因的表达情况。6. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，骨肉瘤样本为外周血。7. 根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，骨肉瘤诊断试剂基于高通量测序方法或基 于定量PCR方法或基于探针杂交方法检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443的转录或基于 免疫方法检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443调控的靶基因的表达情况，优选采用 northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的 流式细胞术检测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443的转录;采用ELISA或胶体金试纸条检 测骨肉瘤样本中mir-4443或miR-4443调控的革El基因的表达情况。优选所述mir-4443SmiR-4443调控的靶基因为NABPl、0)274、4此17441^13六或胶体金试纸条中含有与财8?1和/或 CD274和/或ARL17A蛋白特异性结合的抗体。8. 权利要求5-7所述的试剂在制备骨肉瘤检测试剂中的应用。 9. mir-4443及miR-4443调控的靶基因在制备诊断或防治骨肉瘤试剂中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，靶基因为NABPl和/或CD274和/或ARL17A 基因。
【文档编号】C12Q1/68GK105950716SQ201610271797
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】马翠, 刘阳, 向常娟, 杨承刚
【申请人】固安博健生物技术有限公司