血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法

血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法，其技术方案是：试剂II中仅有肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶有效组分；试剂I中含有尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α?酮戊二酸、NADH有效成分；测定方法为：血清先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中尿素与试剂Ⅰ反应生成NAD+，加入试剂Ⅱ于37℃温浴4～7分钟，肌酐经肌酐酰氨基水解酶水解后生成肌酸，肌酸经肌酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下与试剂I生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，测定中第一步反应NADH变化即为血清中尿素氮的含量，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
【专利说明】
血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种同时测定尿素氮肌酐含量的方法，属于一种包含酶的测定方法； 或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种 用生化分析仪快捷、准确检测血清中尿素氮肌酐的测定方法。
【背景技术】
[0002] 尿素是人体蛋白质代谢的主要终末产物，氨基酸脱氨基产生NH3和C02,两者在肝脏 中合成尿素，每克蛋白质代谢产生尿素氮〇.3g，尿素中氮含量为28/60,通常肾脏为排泄尿 素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，但肾小管内尿流速越快重吸 收越少，也即达到了最大清除率，和血肌酐一样，在肾功能损害早期，血尿素氮可在正常范 围，当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时，血尿素氮的浓度才迅速升高，正常情况下， 血尿素氮与肌酐之比(BUN/Scr)值约为10,高蛋白饮食、高分解代谢状态、缺水、肾缺血、血 容量不足及某些急性肾小球肾炎，均可使比值增高，甚至可达20~30;而低蛋白饮食，肝疾 病常使比值降低，此时可称为低氮质血症。正常成人空腹BUN为3.2~7.1mmol/L(9~20mg/ dl)。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破 坏性病变均可使血尿素氮增高，多肾外因素也可引起血尿素氮升高，如能排除肾外因素， BUN 21.4mmol/L(60mg/dl)即为尿毒症诊断指标之一。
[0003] 临床实验室血和尿中肌酐的测定常用酶法或碱性苦味酸法(Jaffe法），Jaffe法虽 然试剂较便宜、重复性、准确性也较好，但易受血清中其他假性肌酐物质的干扰，尤其是当 血清胆红素值多165.5ymol/L时开始出现负偏差，而且血清胆红素越高偏差越大。此外， Jaffe法受到酮体、乳糜血和溶血的严重干扰，头孢类和维生素C及多巴胺等药物也使其结 果出现较大干扰。
[0004] 酶法利用肌酐在肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶 等酶及显色剂和水、氧的共同作用下生成醌亚胺(红色），在505nm波长下测定其吸光度A，其 A值的大小和样品中肌酐的含量成正比的原理而设计的，由于酶本身具有的特异性及高效 性，肌酐酰氨基水解酐在反应中针对肌酐而不受其他物质的干扰，这使测定结果接近于真 值。
[0005] 血清（或血浆）中的尿素氮，在尿素氮试剂的酸性环境中与二乙酰-肟(DAM)共沸 后，可缩合成一红色化合物，称为fearon反应。其颜色的深浅与血清(或血浆）中尿素氮的含 量成正比，与同样处理的尿素氮标准液比色，即可测算出血清(或血浆）中尿素氮的含量。由 于此方法干扰性大，目前临床实验室多多采用尿素酶偶联法，用尿素酶分解尿素产生氨，氨 在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH氧化为NAD+时，通过340nm吸光度的降低值可计算出尿素 氮含量。
[0006] 血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)两者分别为含氮的有机物和蛋白质代谢的终末产物， 在肾功能正常的情况下，这些小分子物质从肾小球滤出，故可用作肾小球滤过功能的诊断 和过筛指标，当肾小球滤过功能减低时，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。
[0007]本发明研究一种在同一反应体系中同时测定尿素氮肌酐的测定方法，血清中尿素 与试剂I反应生成NAD+，加入试剂Π 于37°C温浴4~7分钟，肌酐经肌酐酰氨基水解酶水解后 生成肌酸，肌酸经肌酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下与试剂I生成NAD +，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标准品比较，测定中第一步反应NADH变化即为 血清中尿素氮的含量，第二步反应NADH变化即为血清中肌酐的含量。
[0008] 反应过程为：
解决的问题是:我们仅以肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶为第二试剂的两步酶测 定方法，由于第一步反应体系中有尿素酶，谷氨酸脱氢酶，α-酮戊二酸，NADH，血清中的尿素 在尿素酶和谷氨酸脱氢酶的作用下生成NAD+;当加入第二试剂后，血清中肌酐经肌酐酰氨 基水解酶水解生成肌酸，肌酸经肌酸脒基水解酶水解生成尿素，再经尿素酶，谷氨酸脱氢酶 催化下与α_酮戊二酸，NADH反应生成NAD+，仪器以第一步反应NADH变化计算出尿素氮的含 量，以第二步NADH变化计算出肌酐的含量，在同一反应体系中，尿素为待测物，由于在反应 的全过程检测的都为NADH变化，NADH的变化与尿素、肌酐呈等量关系，因此，可采用尿素氮 为标准液进行定标。

【发明内容】
：
[0017] 为了能简单及准确地测定血清中尿素氮肌酐，本发明提供一种经济方便易行，准 确性高、在同一反应体系中同时测定尿素氮肌酐的测定方法。
[0018] 本发明采用的技术方案是:试剂Π 内仅含有肌酐酰氨基水解酶、肌酸脒基水解酶 及适量防腐剂;试剂I中含有尿素酶、谷氨酸脱氢酶、酮戊二酸、NADH等有效成分;其测定 方法为:血清先与试剂I于37°C温浴3~5分钟，血清中尿素与试剂I反应生成NAD+，加入试剂 Π于37 °C温浴4~7分钟，肌酐经肌酐酰氨基水解酶后生成肌酸，肌酸经肌酸脒基水解酶作 用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下生成NAD+，在340nm波长处反应速度与同样处理过的标 准品比较，第一步反应NADH变化即为血清中尿素氮的含量，第二步反应NADH变化即为血清 中肌酐的含量。
[0019] 尿素氮浓度=FXA〇DBUN/At
[0020] 肌酐浓度=FX Δ 〇D&/ Δ t
[0021] 其中Δ 〇DBUN/At是单位时间内尿素氮产生的速率，Δ 〇DCr/At是单位时间内肌酐 产生的速率，F是校正因数。
【附图说明】 附图1是本发明测定健康人体血清尿素氮肌酐双项的反应曲线图。
【具体实施方式】：
[0022] 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。
[0023] 实施例1
[0024]试剂的组成：
[0025] &.试剂1:
[0026] 试剂I内含TRIS-盐酸磷酸盐缓冲液50mmol/L，尿素酶5000U/L，谷氨酸脱氢酶 9000U/L，a-酮戊二酸 160mmol/L，NADH 3.0mmol/L，Proclin-300 150~250μ1〇
[0027] b.试剂 Π:
[0028] 试剂Π内含TRIS-盐酸磷酸盐缓冲液50mmol/L，肌酐酰氨基水解酶20KU/L，肌酸脒 基水解酶 20KU/L，Proclin-300 150 ~250μ1〇
[0029] c.标准液:标准液为7.14mmol/尿素氮。
[0030] 实施例2
[0031]测定程序
[0032]测定方法:在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3μ1样品加 入到225μ1试剂I中混匀，37 °C孵育3分钟，加入75μ1试剂Π混匀，37 °C孵育5.1分钟，全自动 分析仪在340nm波长处检测。仪器自动计算出尿素氮肌酐结果，具体见表1:
[0033] 表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
[0034]
[0035] 尿素氮浓度=F X Δ 〇DBUN/ Δ t
[0036] 肌酐浓度=FX Δ 〇Dcr/ Δ t
[0037] 其中Δ 〇DBUN/At是单位时间内尿素氮产生的速率，Δ 〇DCr/At是单位时间内肌酐 产生的速率，F是校正因数，测定方法为带标准的速率法，其实时反应曲线如附图1所示。 [0038]下面通过采用本发明方法与《全国临床检验操作规程》推荐方法比较来验证本法 的准确性。
[0039] 1.检测对象：肾功能正常及异常患者426例，其中男240人，平均年龄42.5岁；女性 186人，平均年龄41.5岁，空腹静脉采血2. OmL。
[0040] 2.采用方法及试剂
[0041 ] 2.1试剂：
[0042] (1)本发明方法采用实施例1中的试剂I、试剂Π。
[0043] (2)对照方法采用北京利德曼生化股份有限公司生产的尿素紫外分光度法试剂 盒;肌酐采用肌酐氧化酶测定法试剂盒。
[0044] 2.2.仪器：（1)日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪。
[0045] 2.3.方法
[0046] 2.3.1对照方法尿素氮测定方法样品2以1，试剂120(^1，试剂114(^137°(：，反应 时间90秒，340nm波长处速率法测定。肌酐测定样品3μ1，试剂I 180μ1，试剂II 60μ1 37°C， 反应时间300秒，340nm波长处速率法测定。
[0047] 2.3.2.本发明方法样品3以1，试剂1 225以1，试剂1175以137°(：，反应时间180秒后， 在340nm波长处测定点为P3~P9，计算出尿素氮含量;加入试剂II后，仪器自动温浴5.1分钟 内，在340nm波长处测定点为P 15~P21，计算出肌酐含量，其实时反应曲线如图1。
[0048] 本发明方法与对照方法尿素氮、肌酐测定结果比较如表2,3。
[0049] 表2.两种方法测定待检者血清尿素氮测定结果比较(mmol/L)
[0050]
[0051] 表3.两种方法测定待检者血清肌酐测定结果比较(ymol/L)
[0052]
[0053] 从表2,3测定结果得知，本发明与《全国临床检验操作规程》推荐方法测定结果相 关性良好，测定批内、批间精密度符合要求，测定范围符合临床需要，尿素氮、肌酐结果在同 一反应体系中能够同时测出，反映出肾功能状况对病人的诊断与治疗具有重要意义。
【主权项】
1. 一种血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，其特征在于试剂π内仅含有肌酐酰氨基 水解酶、肌酸脒基水解酶有效成分;试剂I中含有尿素酶、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、NADH 等有效成分;测定方法为:血清先与试剂I于37°C温浴3~5分钟，血清中尿素与试剂I反应生 成NAD+，加入试剂Π 于37°C温浴4~7分钟，肌酐经肌酐酰氨基水解酶后生成肌酸，肌酸经肌 酸脒基水解酶作用下生成尿素，尿素在尿素酶作用下生成NAD+，在340nm波长处反应速度与 同样处理过的标准品比较，第一步反应NADH变化即为血清中尿素氮的含量，第二步反应 NADH变化即为血清中肌酐的含量。 尿素 Ml 浓度=F X AODbun/At 肌酐浓度=F X A〇DCr/At 其中Δ ODbun/ Δ t是单位时间内尿素氮产生的速率，Δ ODcr/ Δ t是单位时间内肌酐产生 的速率，F是校正因数。2. 根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，其特征在于试剂I内含 TRIS-盐酸缓冲液30~70mmol/L，尿素酶4000~6000U/L，谷氨酸脱氢酶8000~10000U/L，a-酮戊二酸140~180111111〇1/1，嫩0!12.0~4.0111111〇1/1，？『〇。1111-300 150~25(^1;试剂11内含 TRIS-盐酸缓冲液30~70mmol/L，肌酐酰氨基水解酶18~22KU/L，肌酸脒基水解酶18~ 22KU/L，Proclin-300 150~250μ1〇3. 根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，其特征在于试剂I及试 剂Π 中防腐剂选自Proclin-300。4. 根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，其特征在于试剂I和试 剂Π 中磷酸盐缓冲液的pH值为7.7 ±0.2。5. 根据权利要求1所述的血清中尿素氮肌酐双项同时测定方法，其特征在于测定所用 各物品的体积比为:样品：试剂I:试剂Π = 1:70~80:20~30。
【文档编号】C12Q1/32GK105950704SQ201610266683
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】李立和, 丁弘, 魏志斌
【申请人】天津市宝坻区人民医院