一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂，所述用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法包括以下步骤：将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至 45?50℃时，加入抗生素利奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有抗生素的甘露醇高盐琼脂溶液；将含有抗生素的甘露醇高盐琼脂溶液分别倒入无菌平皿中，调整pH值，得到检测各抗生素耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；取粪便标本或体液标本，涂于检测平皿平板上，培养2天后计数各平板各抗生素耐药金黄色葡萄球菌总菌落数。本发明的技术方案操作简单，灵敏性高，可以快速筛选出利奈唑胺、万古霉素或替加环素耐药金黄色葡萄球菌，为细菌耐药防控提供基础。
【专利说明】
一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法及其试剂
技术领域
[0001] 本发明属于医学检验技术领域，尤其涉及一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植 的方法及其试剂。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌是临床分离的重要致病菌和定植菌之一，其中根据耐药性将其分 为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。近年该类细 菌临床耐药发展迅速，尤其以MRSA耐药趋势更为严重，美国每年MRSA感染导致死患者数相 当于AIDS、结核病和病毒性肝炎总和，我国MRSA感染率和MRSA分离率及多重耐菌均有增加 趋势。2008-2015年Mohnarin资料显示，综合医院MRSA分离株占金黄色葡萄球菌67.6%、ICU 中高达84.8 %。金黄色葡萄球菌居肺部感染G+球菌第一位，其中MRSA分离率26.3 % ;我国 MRSA分离株对庆大霉素、克林霉素、大环内酯类和左氧氟沙星等抗菌药物耐药率基本上都 在80 %左右，对复方磺胺和利福平的耐药率低于50%。利奈唑胺(Linezoid，LZD)、糖肽类抗 生素(万古霉素和替考拉宁)和替加环素是金黄色葡萄球菌治疗的"最后防线"和"王牌抗生 素"，近年利奈唑胺耐药或中介分离金黄色葡萄球菌株报道逐渐增多，对替考拉宁和万古霉 素中介或耐药菌株亦有报道，替加环素不敏感金黄色葡萄球菌亦逐渐引起临床关注，因此 加强这些"王牌"抗生素耐药菌管理，筛查多重耐药金黄色葡萄球菌定植患者成为院内感染 控制的首要任务。
[0003] 随着近年LZD(Linezoid，利奈唑胺)广泛应用于难治性G+( gram-positive)菌感染 及结核杆菌感染，其临床耐药问题日益突出，国内外LZD耐药株散发报道日渐增多，甚至不 断有院内暴发流行报道，该类耐药株主要见于肠球菌和葡萄球菌。2011-2014年CHINET数据 提示LZD耐药葡萄球菌波动在0.1 %-0.4%。
【申请人】为一所三甲医院，2013年和2014年临床 分离葡萄球菌LZD耐药率为0.2%和0.7%。美国LEADER研究报告近10年葡萄球菌LZD耐药数 据波动在0.2-0.6%。另有散在报道提示上海、北京等多家医院均有逐渐增多的LZD耐药株 散发病例。随着LZD在临床更为广泛应用，未来我们将面临其严峻的耐药形势，其中快速增 加的LZD耐药葡萄球菌耐药株尤其引人关注。
[0004]随着万古霉素广泛应用，临床上万古霉素治疗失败的金黄色葡萄球菌感染病例并 不少见，随之提出万古霉素敏感性下降金黄色葡萄球菌和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌 (vancomycin-resistant Staphyloccus aureus，VRSA)，使临床治疗更加困难。1997年， Hiramatsu等报道了世界上首例VISA(Mu50)，其万古霉素MIC值为8μg/ml，随后不久又报道 了首例分离自一位肺癌术后发生肺炎患者的痰标本菌株hVISA(Mu3)，该株万古霉素MIC值 为3μg/ml，经不同浓度万古霉素平皿筛选后其MIC值可以达到Syg/mUOOS年在密西根州报 道了首例于导管尖端同时培养出VRSA和万古霉素耐药的的肠球菌(vancomycin-resistant E.fecalis，VRE)患者，其分离的VRSA的MIC彡32μg/ml，目前VISA和hVISA发生耐药的机制仍 处于研究阶段。随后，hVISA感染病例在世界上许多国家陆续报道。不同国家报道的hVISA感 染发生率有很大不同，南韩0.71%，法国11.1%，土耳其17.97%，美国0.2%，中国13.1%。 早期各项研究对hVISA和VISA检测并无统一标准，许多研究检测出hVISA和VISA并没有最后 经PAP-AUC法确认，而且2006年CLSI对VISA进行新的界定，将万古霉素对hVISA的MIC由原来 的8-16μg/ml修改为4-8μg/ml，所以根据新标准，hVISA和VISA发病率应该会更高。所以我们 应统一hVISA和VISA的检测方法继续监测hVISA和VISA的发病率。我国目前尚无明确的VRSA 报道，但对于hVISA报道较多且明确，因此万古霉素耐药金黄色葡萄球菌在我国尽管无临床 耐药株报道，但关于其MIC值漂移和hVISA出现使得我们需要对该类耐药细菌进行重点监 测 。
[0005] 以往由于对万古霉素、利奈唑胺和达托霉素的高效性和低耐药认识，替加环素在G +菌感染领域的治疗作用一直作为"储备王牌"抗生素地位，近年随着万古霉素和利奈唑胺 耐药G+菌逐渐增多，替加环素在G+菌(尤其是MRSA和肠球菌等)感染治疗中开始发挥越来越 重要作用，其在G+菌中的耐药问题日益引起关注，替加环素耐药G+细菌报道亦逐渐增多。最 近全球多中心和我国细菌药敏结果提示替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌耐药日益突出， MRSA、肺炎链球菌和肠球菌临床分离株替加环素耐药率保持在0.1-0.5%;但一项台湾研究 表明如果按照不敏感（intermediate)标准进行统计，台湾分离的44.5 %MRSA、45.9 %万古 霉素耐药屎肠球菌和2.8 %粪肠球菌对替加环素不敏感；另有一项大样本腹部手术继发粪 肠球菌腹膜炎患者研究提示尽管分离粪肠球菌未发现耐药，但18.9%对替加环素不敏感 (intermediate)。综合目前的研究报道，替加环素仍是万古霉素和利奈唑胺耐药粪肠球菌 和金黄色葡萄球菌治疗的重要补救选择，但其面临严峻的耐药挑战，尤其是随着其在G-菌 中更为广泛应用可能会导致筛选耐药出现，目前散发报道临床分离替加环素耐药粪肠球菌 和金黄色葡萄球菌病例日渐增多即是这一趋势的最好"写照"。因此随着替加环素在临床更 为广泛的应用，未来我们将面临其严峻的耐药形势，其中金黄色葡萄球菌和肠球菌中的耐 药增多尤其引人关注。
[0006] 随着耐药金黄色葡萄球菌报道日渐增多，临床院感工作中如何对该类多重耐药菌 (multi-drug resistant organism，MDR0)进行院感耐药管理成为临床需要明确的紧迫问 题，根据我国最新公布的《多重耐药菌医院感染预防与控制中国专家共识》要求和院内万古 霉素耐药肠球菌(Vancomycin-resistant enterococci，VRE)监测经验，理论上对该类细菌 均应采取接触隔离处理措施。然而对于这些MDR0定植患者进行接触隔离的临床意义仍在深 入研究中，该类细菌包括LZD耐药和替加环素耐药细菌在院内感染防控中是否也需要"享 受" VRE相同"待遇"仍有待理论支持。因此，建立方便快捷的检测和监测多重耐药金黄色葡 萄球菌定植用于该类临床研究和常规院感检测非常有必要，但是如何将这些MDR0快速简单 从患者标本中分离定植的耐药株并能定量，如何动态从体内监测多重耐药金黄色葡萄球菌 株定植变化，目前鲜见相关研究。常用的方法为通过血平板监测大便标本中的菌群生长情 况，根据细菌形态学特点挑取其中葡萄球菌株，然后进行鉴定最后确定该菌株是否为利奈 唑胺或万古霉素或替加环素耐药葡萄球菌，但是这一过程操作复杂、阳性率低，不能有效筛 选耐药株定植的阳性人群。
【发明内容】
[0007] 针对以上技术问题，本发明公开了一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法 及其试剂，操作简单，阳性率高，可以迅速准确筛选出多重耐药金黄色葡萄球菌定植人群有 利于临床中耐药传播的控制和抗生素选择，从而为细菌耐药防控提供基础。
[0008] 对此，本发明采用的技术方案为：
[0009] -种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤S1:将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至45-50°C时，加入 利奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼 脂溶液;然后将所述含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌 平皿中，调整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌 定植检测平皿；
[0011] 其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2~ 3ug/ml，将所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.3-7.6，得到利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；
[0012] 所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为2.5~ 3.5ug/ml，将所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.2-7.4，得到万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；
[0013] 所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为0.2-0.5ug/ ml，将所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平皿中，调整pH值为7.3-7.4，得 到替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿；
[0014] 步骤S2:取粪便标本或体液标本，涂于步骤S1中所述利奈唑胺耐药金黄色葡萄球 菌定植检测平皿、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿或替加环素耐药金黄色葡萄 球菌定植检测平皿的平板上，并同时涂于无抗平皿中作为对照，培养2天后计数无抗平皿中 的总菌落数和各抗生素平皿中的耐药金黄色葡萄球菌的总菌落数。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液 中，所述利奈唑胺的浓度为2.5ug/ml;所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万 古霉素的浓度为3ug/ml;所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓 度为 0.3ug/ml。
[0016] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中，所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植 检测平皿的pH值为7.3;
[0017] 所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2;
[0018] 所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3。
[0019] 作为本发明的进一步改进，还包括步骤S3:从步骤S2的平板上随机挑取金黄色葡 萄球菌克隆，进行革兰染色+凝集酶检测，然后采用E-test方法测定菌株各抗生素MIC值;其 中，所述耐药菌株在确定其MIC值之前，应在无抗生素培养基中培养3代，同时采用金黄色葡 萄球菌质控菌株ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212和大肠杆菌14028进行质控。
[0020] 作为本发明的进一步改进，所述粪便标本为新鲜粪便标本，或将粪便溶于1ml的 BHI培养基并加入20 %甘油混匀的粪便标本；
[0021] 所述体液标本为鼻咽拭子，或将鼻咽拭子可也放于含BHI培养基并加入20%甘油 混匀低温保存用于选择性培养。
[0022] 作为本发明的进一步改进，所述甘露醇高盐琼脂包含的组分及其浓度为：蛋白胨 l〇g/L、牛肉粉 lg/L、D-甘露醇 10g/L、氯化钠 75g/L、酚红0.025g/L、琼脂 13g/L，pH 值为 7.4土 0·2〇
[0023] 作为本发明的进一步改进，步骤S1还包括将所述利奈唑胺、万古霉素或替加环素 的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿冷却凝固后放入四度冰箱保存备用。
[0024] 本发明还公开了一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂，所述试剂为用于 检测利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂、用于检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定 植的试剂或用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂;其中，所述用于检测利奈 唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂包含无菌甘露醇高盐琼脂和利奈唑胺，其中所述利奈 挫胺的浓度为2~3ug/ml，pH值为7.3-7.6;所述用于检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定 植的试剂包含无菌甘露醇高盐琼脂和万古霉素，其中所述万古霉素的浓度为2.5~3.5ug/ ml，pH值为7.2-7.4;所述用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂包含无菌甘露 醇高盐琼脂和替加环素，其中所述替加环素的浓度为〇. 2-0.5ug/ml，pH值为7.3-7.4。
[0025] 作为本发明的进一步改进，所述用于检测利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试 剂中，利奈唑胺的浓度为2.5ug/ml，试剂的pH值为7.3;
[0026] 所述用于检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂中，万古霉素的浓度为 3呢/1111，试剂的?!1值为7.2;
[0027] 所述用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂中，替加环素的浓度为 0 · 3ug/ml，试剂的pH值为7 · 3。
[0028] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0029] 采用本发明的技术方案，操作简单，检验快速，且具有极高的灵敏性，可以快速筛 选出利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌、替加环素耐药金黄色 葡萄球菌，从而为院感防治提供有力武器;能迅速准确筛选出耐药金黄色葡萄球菌定植人 群，有利于临床中耐药传播的控制和指导抗生素选择，从而为细菌耐药防控提供基础。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明实施例1中宿主于某的粪便样品采用平板筛选万古霉素不敏感金黄 色葡萄球菌生长图片，右边为无抗对比样品，左边为含LZD浓度为2.5ug/ml的样品。
[0031] 图2是本发明实施例6中宿主谢某的粪便样品采用平板筛选万古霉素不敏感金黄 色葡萄球菌生长图片，右边为无抗对比样品，左边为含万古霉素浓度为3.Oug/ml的样品。
[0032] 图3是本发明实施例10中宿主林某的粪便样品采用平板筛选替加环素不敏感金黄 色葡萄球菌生长图片，右边为无抗对比样品，左边为含替加环素浓度为〇.3ug/ml的样品。
【具体实施方式】
[0033]下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0034] 实施例1
[0035] -种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，本例针对于检测利奈唑胺耐药金 黄色葡萄球菌定植的方法，包括以下步骤：
[0036]称取甘露醇高盐琼脂109.Og，加入1000ml蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌煮沸1分 钟，并于121°C高压灭菌15分钟，冷至45-50°C左右时，加入利奈唑胺，所述利奈唑胺的浓度 为2.5ug/ml，得到含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液;其中，所述甘露醇高盐琼脂的配方 为蛋白胨l〇g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化钠75g/L、酚红0.025g/L、琼脂13g/L， 7.4pH值为7.4 ± 0.2。将所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液倒入直径9cm的无菌平皿 (20ml/皿），分别采用盐酸或NaOH调整培养基的pH值为7.3、7.4、7.5和7.6,并以pH值为7.0、 7.1、7.2、7.7、7.8、7.9和8.0作为对比例，对这些检测平皿样本进行分析，将其冷却凝固有 放入四度冰箱保存备用，分别每7天取出平板观察平板中LZD耐药金黄色葡萄球菌生长能力 的差别，观察药物稳定性。
[0037]步骤S2:取患者0.5g新鲜粪便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可将新鲜标本用于 耐药菌的筛选培养或取〇.5g粪便标本溶于lml的BHI培养基并加入20%甘油混匀保存用于 选择性培养，鼻咽拭子可也放于含BHI培养基并加入20%甘油混匀低温保存用于选择性培 养。取5mg粪便或咽拭子分泌物标本均匀涂于各利奈唑胺浓度样品的甘露醇高盐琼脂的平 板上，葡萄球菌选择性培养基培养培养2天后计数总菌落数，并同时涂于无抗平板作为对 照，计数其中的生长数，继之计算〇.5g粪便的平板含的总金黄色葡萄球菌数，如果细菌量 多，可采用稀释为1〇-1〇_ 9倍数倍比稀释方法进行计数，通过无抗平板计算〇.5g粪便总金黄 色葡萄球菌数量，在含抗生素平皿筛选抗生素不敏感金黄色葡萄球菌数量与总金黄色葡萄 球菌比值作为相对定量，其中，无抗平皿和含抗平皿接种相同量的粪便标本。
[0038]步骤S3:分别在无抗和含有抗生素利奈唑胺的平皿随机挑取金黄色葡萄球菌克隆 15株，做个革兰染色+凝集酶检测，继之采用E-test方法测定菌株各抗生素MIC值，采用细菌 鉴定仪(梅尼埃)和16SrRNA测序方法鉴定细菌亚群，初步比较抗生素利奈唑胺不敏感葡萄 球菌筛选的稳定性和最佳条件情况。为了保证耐药菌株稳定性，耐药菌株在确定其MIC值之 前，应在无抗生素培养基中培养3代，同时采用金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213、粪肠球 菌ATCC29212和大肠杆菌14028进行质控。
[0039] 实施例2
[0040]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈唑胺的浓度为2ug/ml，其他同实施例1。
[0041 ] 实施例3
[0042]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈唑胺的浓度为3ug/ml，其他同实施例1。
[0043] 对比例1
[0044] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈唑胺的浓度为Oug/ml，即不添加利奈唑胺， 其他同实施例1。
[0045] 对比例2
[0046] 在实施例1的基础上，本例中，所述利奈唑胺的浓度为1.5ug/ml，其他同实施例1。
[0047] 对比例3
[0048]在实施例1的基础上，本例中，所述利奈唑胺的浓度为3.5ug/ml，其他同实施例1。
[0049] 实施例4
[0050] 针对上述实施例1~3和对比例1~3,取2份粪便标本用于平皿筛选效果评估后，培 养2天后挑取50个克隆，进行MIC值测定，结果如表1和图1所示，可见，含LZD为2.0、2.5和 3.0ug/ml浓度的甘露醇高盐琼脂平皿能较好的将LZD不敏感金黄色葡萄球菌(MIC值>4ug/ ml)筛选出来，其中LZD含量为2.5ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿筛选细菌MIC值符合要求，可 以较好的将LZD不敏感(intermediate和resistant)细菌均筛选出来，筛选效果最好。由图1 可见，其中宿主于某的粪便标本在LZD和无抗平板均有较好生长，可以直接从平皿中获得耐 药菌生长情况并进行耐药金黄色葡萄球菌的相对定量分析。
[0051 ]表1粪便标本中利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌在不同利奈唑胺浓度筛选 [0052]和鉴定情况(每个平板挑取50克隆，含抗平皿如生长不足50则全部克隆挑取鉴定）
[0054] 针对LZD含量为2.5ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿的不同pH值的平板耐药菌进行对 比，结果如表2所示，从表2中可见，pH值为7.3-7.6时，平板耐药菌生长稳定，提示该PH范围 内值LZD活性稳定。在pH值为7.3的含LZD为2.5ug/ml平皿可以在常温下保持活性3天，4度冰 箱中可保持35天，结果如表3所示。同时该方法用于鼻咽部拭子筛选耐药金黄色葡萄球菌取 得同样效果。
[0055] 表2利奈唑胺不敏感金黄色葡萄球菌筛选不同pH值的结果表
[0056]
[0057]表3含2.5ug/ml利奈唑胺平板存放不同时间点其活性观察结果(常温和4度）
[0058]
[0059] 实施例5
[0060] 针对健康宿主78例健康人宿主粪便LZD耐药金黄色葡萄球菌定植情况研究，采用 无抗和含LZD浓度2.5ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿培养2天后计数总菌落数，计算0.5g粪便 标本金黄色葡萄球菌总数，结果显示，所有78例患者中27例粪便培养出金黄色葡萄球菌。对 照方法采用常规的血培养平板培养粪便标本，根据形态确定葡萄球菌，继之进行药敏检测， 提示着78例患者仅5例检测到金黄色葡萄球菌定植。说明该方法与其他普通常规方法相比 具有较好的优越性。
[0061] 我们采用的LZD耐药检测"一步法"平皿使用后在78例患者中检测出27例粪便有金 黄色葡萄球菌生长，其中含有LZD不敏感菌株7例;常规方法0例检出LZD耐药株定植。因此本 方法具有极高的灵敏性直接筛选出利奈唑胺耐药金黄色葡萄球从而为院感防治提供有力 武器。
[0062] 由于葡萄球菌球菌含有多个亚群，因此该方法是否能筛选出人体不同的葡萄球菌 亚群需要进一步验证。我们同时对无抗和LZD筛选平板生长的细菌亚群进行了初步分析，在 该平皿中生长2天，筛选的细菌100%为金黄色葡萄球菌，但3天时准确率为65 %，有较多表 皮葡萄球菌生长。因此根据这一结果分析我们建立的筛选方法通过控制时间可以较好的将 LZD不敏感金黄色葡萄球菌较好的筛选出来。
[0063] 实施例6
[0064] -种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，本例针对于检测万古霉素耐药金 黄色葡萄球菌定植的方法，包括以下步骤：
[0065]称取甘露醇高盐琼脂109.0g，加入1000ml蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌煮沸1分 钟，并于121°C高压灭菌15分钟，冷至45-50°C左右时，加入万古霉素，所述万古霉素的浓度 为3ug/ml，得到含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液;其中，所述甘露醇高盐琼脂的配方为 蛋白胨10g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化钠75g/L、酚红0.025g/L、琼脂13g/L，7.4pH 值为7.4 ±0.2。将所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入直径9cm的无菌平皿 (20ml/皿），分别采用盐酸或NaOH调整培养基的pH值为7.2、7.3和7.4，并以？!1值为7.0、7.1、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0作为对比例，对这些检测平皿样本进行分析，将其冷却凝固有 放入四度冰箱保存备用，分别每7天取出平板观察平板中万古霉素耐药金黄色葡萄球菌生 长能力的差别，观察药物稳定性。
[0066]步骤S2:取患者0.5g新鲜粪便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可将新鲜标本用于 耐药菌的筛选培养或取〇.5g粪便标本溶于lml的BHI培养基并加入20%甘油混匀保存用于 选择性培养，鼻咽拭子可也放于含BHI培养基并加入20%甘油混匀低温保存用于选择性培 养。取5mg粪便或咽拭子分泌物标本均匀涂于各万古霉素样品的甘露醇高盐琼脂的平板上， 葡萄球菌选择性培养基培养2天后计数总菌落数，并同时涂于无抗平板作为对照，计数其中 的生长数，继之计算〇.5g粪便含的总金黄色葡萄球菌数，如果细菌量多，可采用稀释为10-ΠΓ 9倍数倍比稀释方法进行计数，通过无抗平板计算〇. 5g粪便总金黄色葡萄球菌数量，在含 抗生素平皿筛选抗生素不敏感金黄色葡萄球菌数量与总金黄色葡萄球菌比值作为相对定 量，其中，无抗平皿和含抗平皿接种相同量的粪便标本。
[0067] 步骤S3:分别在无抗和含有抗生素万古霉素的平皿随机挑取金黄色葡萄球菌克隆 15株，做个革兰染色+凝集酶检测，继之采用E-test方法测定菌株各抗生素MIC值，采用细菌 鉴定仪(梅尼埃)和16SrRNA测序方法鉴定细菌亚群，初步比较抗生素万古霉素不敏感葡萄 球菌筛选的稳定性和最佳条件情况。为了保证耐药菌株稳定性，耐药菌株在确定其MIC值之 前，应在无抗生素培养基中培养3代，同时采用金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213、粪肠球 菌ATCC29212和大肠杆菌14028进行质控。
[0068] 实施例7
[0069] 在实施例6的基础上，本例中所述万古霉素的浓度为2.5ug/ml，其他同实施例6。
[0070] 实施例8
[0071] 在实施例6的基础上，本例中所述万古霉素的浓度为3.5ug/ml，其他同实施例6。
[0072] 对比例4
[0073] 在实施例6的基础上，本例中所述万古霉素的浓度为Oug/ml，即不添加万古霉素， 其他同实施例6。
[0074] 对比例5
[0075]在实施例6的基础上，本例中，所述万古霉素的浓度分别为0.5、1.0、1.5、2ug/ml， 其他同实施例6。
[0076] 实施例9
[0077] 针对上述实施例6~8和对比例4~5，取3份粪便标本用于平皿筛选效果评估后，培 养2天后挑取50个克隆，进行MIC值测定，结果如表4和图2所示，可见，含万古霉素为2.5、3.0 和3.5ug/ml浓度的甘露醇高盐琼脂平皿能较好的将万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌(MIC 值>4ug/ml)筛选出来，其中万古霉素含量为3.0ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿筛选细菌MIC 值更优，可以较好的将万古霉素不敏感(intermediate和resistant)细菌均筛选出来，筛选 效果最好。由图2可见，其中宿主谢某的粪便标本在万古霉素和无抗平板均有较好生长，从 含万古霉素平皿可直接读出是否含有该类抗生素耐药金黄色葡萄球菌并进行半定量，方法 简单方便。
[0078] 表4粪便标本中万古霉素耐药金黄色葡萄球菌在不同万古霉素浓度筛选和鉴定情 况(每个平板挑取50克隆，含抗平皿中生长不足50可全部克隆挑取鉴定）
[0080]针对万古霉素含量为3.Oug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿的不同pH值的平板耐药菌 进行对比，结果如表5所示，从表5中可见，pH值为7.2-7.4时，平板耐药菌生长稳定，提示该 pH范围内值万古霉素活性稳定。在pH值为7.2的含万古霉素为3ug/ml平皿可以在常温下保 持活性5天，4度冰箱中可保持62天，结果如表6所示。同时该方法用于鼻咽部拭子筛选耐药 金黄色葡萄球菌取得同样效果。
[0081 ]表5万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌筛选不同pH条件下的结果表(含3ug/ml万古 霉素平皿，粪便标本）
[0082]
[0083]表6含3ug/ml万古霉素平板存放不同时间点其活性观察(常温和4度）
[0085] 实施例10
[0086] -种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，本例针对于检测替加环素耐药金 黄色葡萄球菌定植的方法，包括以下步骤：
[0087]称取甘露醇高盐琼脂109.0g，加入1000ml蒸馏水中，加热溶解并不停搅拌煮沸1分 钟，并于121°C高压灭菌15分钟，冷至45-50°C左右时，加入替加环素，所述替加环素的浓度 为0.3ug/ml，得到含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液;其中，所述甘露醇高盐琼脂的配方 为蛋白胨l〇g/L、牛肉粉lg/L、D-甘露醇10g/L、氯化钠75g/L、酚红0.025g/L、琼脂13g/L， 7.4pH值为7.4± 0.2。将所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入直径9cm的无菌平皿 (20ml/皿），分别采用盐酸或NaOH调整培养基的pH值为7.3和7.4,并以pH值为7.0、7.1、7.2、 7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0作为对比例，对这些检测平皿样本进行分析，将其冷却凝固有 放入四度冰箱保存备用，分别每7天取出平板观察平板中替加环素耐药金黄色葡萄球菌生 长能力的差别，观察药物稳定性。
[0088]步骤S2:取患者0.5g新鲜粪便，或鼻咽拭子采取鼻咽部分泌物;可将新鲜标本用于 耐药菌的筛选培养或取〇.5g粪便标本溶于lml的BHI培养基并加入20%甘油混匀保存用于 选择性培养，鼻咽拭子可也放于含BHI培养基并加入20%甘油混匀低温保存用于选择性培 养。取5mg粪便或咽拭子分泌物标本均匀涂于各替加环素样品的甘露醇高盐琼脂的平板上， 金黄色葡萄球菌选择性培养基培养2天后计数总菌落数，以同时涂于无抗平板作为对照，计 数其中的生长数，继之计算〇.5g粪便含的总金黄色葡萄球菌数，如果细菌量多，可采用稀释 为10-ΠΓ 9倍数倍比稀释方法进行计数，通过无抗平板计算0.5g粪便总金黄色葡萄球菌数 量，在含抗生素平皿筛选抗生素不敏感金黄色葡萄球菌数量与总金黄色葡萄球菌比值作为 相对定量，其中，无抗和含抗平皿接种相同量的粪便标本。
[0089]步骤S3:分别在无抗和含有抗生素替加环素的平皿随机挑取金黄色葡萄球菌克隆 15株，做个革兰染色+凝集酶检测，继之采用E-test方法测定菌株各抗生素MIC值，采用细菌 鉴定仪(梅尼埃)和16SrRNA测序方法鉴定细菌亚群，初步比较抗生素替加环素不敏感葡萄 球菌筛选的稳定性和最佳条件情况。为了保证耐药菌株稳定性，耐药菌株在确定其MIC值之 前，应在无抗生素培养基中培养3代，同时采用金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213、粪肠球 菌ATCC29212和大肠杆菌14028进行质控。
[0090] 实施例11
[0091] 在实施例10的基础上，本例中所述替加环素的浓度为0.2ug/ml，其他同实施例10。 [0092] 实施例12
[0093]在实施例10的基础上，本例中所述替加环素的浓度为0.4ug/ml，其他同实施例10。 [0094] 实施例13
[0095]在实施例10的基础上，本例中所述替加环素的浓度为0.5ug/ml，其他同实施例10。
[0096] 对比例6
[0097]在实施例10的基础上，本例中所述替加环素的浓度为Oug/ml，即不添加替加环素， 其他同实施例10。
[0098] 对比例7
[0099]在实施例10的基础上，本例中，所述替加环素的浓度分别为0.6、0.7、0.8ug/ml，其 他同实施例10。
[0100] 实施例14
[0101] 针对上述实施例10~13和对比例6~7,取3份粪便标本挑取50个克隆用于平皿筛 选效果评估后，培养2天后，进行MIC值测定，结果如表7和图3所示，可见，含替加环素为0.2、 0.3、0.4和0.5ug/ml浓度的甘露醇高盐琼脂平皿能较好的将替加环素不敏感金黄色葡萄球 菌(MI C值>4ug/ml)筛选出来，同时进行了大于0.5ug/ml浓度的实验，大于0.5ug/ml的MI C为 耐药。本实验中，替加环素含量为〇.3ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿筛选细菌MIC值更优，可 以较好的将替加环素不敏感(intermediate和resistant)细菌均筛选出来，筛选效果最好。 由图3可见，其中宿主林某的粪便标本在替加环素和无抗平板均有较好生长，可以从平皿中 直接获得是否含有该类抗生素耐药金黄色葡萄球菌并进行相对定量分析。
[0102] 表7粪便标本中替加环素耐药金黄色葡萄球菌在不同替加环素浓度筛选和鉴定情 况(每个平板挑取50克隆，含抗生长不足50全部挑取鉴定）
[0104] 针对替加环素含量为〇.3ug/ml的甘露醇高盐琼脂平皿的不同pH值的平板耐药菌 进行对比，结果如表8所示，从表8中可见，pH值为7.3-7.4时，平板耐药菌生长稳定，提示该 pH范围内值替加环素活性稳定。在pH值为7.3的含替加环素为0.3ug/ml平皿可以在常温下 保持活性5天，4度冰箱中可保持69天，结果如表9所示。同时该方法用于鼻咽部拭子筛选耐 药金黄色葡萄球菌取得同样效果。
[0105] 表8替加环素不敏感金黄色葡萄球菌筛选不同pH值条件下的结果表(含0.3ug/ml 替加环素平皿，粪便标本）
[0106]
[0107]表9含0.3ug/ml替加环素平板存放不同时间点其活性观察(常温和4度）
[0109]金黄色葡萄球菌选择性培养基较多，但目前临床使用的仍然主要以非选择性培养 皿血培养皿为主，在临床标本筛选过程中血培养皿具有显著的优势，细菌生长谱广，而且可 以获得较为稳定的结果，然而对于院感检测该类培养基使用较为不利，院感检测主要用于 靶向性检测各种耐药细菌，对于敏感细菌并不关注，尤其是危重病人，迅速准确筛选出多重 耐药金黄色葡萄球菌定植人群有利于临床中耐药传播的控制和指导抗生素选择，从而为细 菌耐药防控提供基础。
[0110]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤SI:将甘露醇高盐琼脂溶解于蒸馏水中，并进行灭菌，冷却至45-50Γ时，加入利 奈唑胺、万古霉素或替加环素，得到含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂 溶液，然后将所述含有利奈唑胺、万古霉素或替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液倒入无菌平 皿中，调整pH值，得到利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定 植检测平皿； 其中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2~3ug/ml， 所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3-7.6; 所述含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为2.5~3.5ug/ml， 所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2-7.4; 所述含有替加环素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为〇. 2-0.5ug/ml， 所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3-7.4; 步骤S2:取粪便标本或体液标本，涂于步骤Sl中所述利奈唑胺、利奈唑胺、万古霉素或 替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的平板上，并同时涂于无抗平皿中作为对 照，培养2天后计数无抗平皿中的总菌落数和各抗生素平皿中的耐药金黄色葡萄球菌的总 菌落数。2. 根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步骤 Sl中，所述含有利奈唑胺的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述利奈唑胺的浓度为2.5ug/ml;所述 含有万古霉素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述万古霉素的浓度为3ug/ml;所述含有替加环 素的甘露醇高盐琼脂溶液中，所述替加环素的浓度为〇. 3ug/ml。3. 根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步骤 Sl中，所述利奈唑胺的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3; 所述万古霉素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.2; 所述替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿的pH值为7.3。4. 根据权利要求1所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:还包 括步骤S3:从步骤S2的平板上随机挑取金黄色葡萄球菌克隆，进行革兰染色+凝集酶检测， 然后采用E-test方法测定菌株各抗生素 MIC值;其中，所述耐药菌株在确定其MIC值之前，应 在无抗生素培养基中培养3代，同时采用金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC29213、粪肠球菌 ATCC29212和大肠杆菌14028进行质控。5. 根据权利要求1~4任意一项所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特 征在于:所述粪便标本为新鲜粪便标本，或将粪便溶于Iml的BHI培养基并加入20%甘油混匀 的粪便标本； 所述体液标本为鼻咽拭子，或将鼻咽拭子可也放于含BHI培养基并加入20%甘油混匀低 温保存用于选择性培养。6. 根据权利要求5所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于，所述 甘露醇高盐琼脂包含的组分及其浓度为:蛋白胨10 g/L、牛肉粉I g/L、D-甘露醇10 g/ L、氯化钠 75 g/L、酚红 0.025 g/L、琼脂 13 g/L，pH值为7.4±0.2。7. 根据权利要求6所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的方法，其特征在于:步骤 Sl还包括将所述利奈唑胺、万古霉素或替加环素的耐药金黄色葡萄球菌定植检测平皿冷却 凝固后放入四度冰箱保存备用。8. -种用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂，其特征在于:所述用于检测耐药金 黄色葡萄球菌定植的试剂为用于检测利奈挫胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂、用于检测 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂或用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植 的试剂； 其中，所述用于检测利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂包含无菌甘露醇高盐琼 脂和利奈唑胺，其中所述利奈唑胺的浓度为2~3ug/ml，pH值为7.3-7.6; 所述用于检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂包含无菌甘露醇高盐琼脂和 万古霉素，其中所述万古霉素的浓度为2.5~3.5ug/ml，pH值为7.2-7.4; 所述用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂包含无菌甘露醇高盐琼脂和 替加环素，其中所述替加环素的浓度为〇. 2-0.5ug/ml，pH值为7.3-7.4。9. 根据权利要求8所述的用于检测耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂，其特征在于:所述 用于检测利奈唑胺耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂中，利奈唑胺的浓度为2.5ug/ml，试剂 的pH值为7.3; 所述用于检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂中，万古霉素的浓度为3ug/ ml，试剂的pH值为7.2; 所述用于检测替加环素耐药金黄色葡萄球菌定植的试剂中，替加环素的浓度为〇.3ug/ ml，试剂的pH值为7.3。
【文档编号】C12Q1/14GK105950701SQ201610340904
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】余治健, 邓启文, 程航, 郑金鑫, 陈重
【申请人】深圳市南山区人民医院