一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐 药基因的引物、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)金黄色葡萄球菌隶属于葡萄球菌 属（Staphylococcus)，硬壁菌门（Firmicutes)，革兰染色阳性。金黄色葡萄球菌无芽孢、 鞭毛，可有荚膜，能产生金黄色色素，能分解甘露醇，血浆凝固酶实验、乳糖发酵实验及脱 氧核糖核酸酶试验阳性。青霉素的发现开创了抗生素用于感染治疗的时代，金黄色葡萄 球菌引起的感染性疾病得到较好的控制，但随着青霉素的普遍使用，金黄色葡萄球菌表 现出耐药性。之后，科学家研宄出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林 (Methicillin)。1961英国科学家Jevons首次报道分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，至今 MRSA 感染几乎遍及全球， 已成为院内感染及社区感染的重要病原菌之一，被称为"超级细菌"。MRSA具有较高的感染 率和致死率，金黄色葡萄球菌可引起一系列的化脓性感染、食物中毒及中毒性休克综合征 等，其化脓性感染从小的皮肤感染病变如疖、痈到严重的感染如组织坏死、坏死性肺炎、骨 髓炎和心内膜炎等。
[0003] 由于抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染率逐渐上升，MRSA的 治疗非常棘手，因此，早期诊断和及时有效的治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌也就越发重 要了。但是现有技术中并没有针对MRSA的早期诊断的方法。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中没有针对MRSA的早期诊断的方法，本发明实施例提供了一 种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒。所述技术方案如 下：
[0005] 一方面，本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因 的引物和探针，所述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正 向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌耐药基因的探针，其中，
[0006] 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示；
[0007] 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示；
[0008] 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所示；
[0009] 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述 探针的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基 因的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
[0011] 具体地，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反应液、临界阳性质控品、阳性质控 品、阴性质控品和工作标准品。
[0012] 具体地，所述工作标准品包括：工作标准品1、工作标准品2、工作标准品3和工作 标准品4,其中，
[0013] 所述工作标准品1为1 x 107拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的 基因片段；
[0014] 所述工作标准品2为1 X 106拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的 基因片段；
[0015] 所述工作标准品3为1 X 105拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的 基因片段；
[0016] 所述工作标准品4为1 X 104拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的 基因片段。
[0017] 具体地，所述阳性质控品为1. OX 106拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐药的基因片段。
[0018] 具体地，所述正向引物和所述反向引物的终浓度均为0. 05-0. 9 yM，所述探针的终 浓度为 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中包括：终浓度为0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR缓冲液和终浓度为 1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
[0020] 具体地，所述核酸释放剂包括：无菌水、终浓度为0. 03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯 基醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值为8. 3的终浓度为0. 01-0. 1M 的三（羟甲基）氨基甲烷。
[0021] 具体地，所述临界阳性质控品为1. ox 104拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌耐药基因的基因片段。
[0022] 具体地，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理盐水。
[0023] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的用于检测 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，具有灵敏度高的特性，能够在MRSA的 早期诊断出结果，为MRSA早期治疗起到至关重要的作用，同时，本发明实施例提供的用于 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，可在MRSA的早期诊断出结果，且具有 灵敏度高的特性，采用仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，其检测结果可靠，提 高了检测的灵敏度。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他 的附图。
[0025]图1是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；
[0026]图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；
[0027] 图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；
[0028] 图4是本发明实施例5提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；
[0029] 图5是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；