r>[0030] 图6是本发明实施例5提供的由图4得到的标准曲线图，图6横坐标为Log Starting Quantity copy number，纵坐标为 Threshold Cycle。
[0031] 图中：Cycles 为循环数，RFU 为焚光值，Log Starting Quantity copy number 为 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因起始浓度的对数值，Ct (Threshold Cycle)值为循环 数；la-实施例2中样品l，4a-实施例2中样品4,5a-实施例2中样品5,6a-实施例2中 样品6, 7a-实施例2中样品7。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方 式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂和探针主要购自宝生物工程（大连）有限 公司。
[0033] 实施例1. 一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因核酸定量检测的引物和 荧光探针
[0034] 本发明实施例提供了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物 和探针，引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于 检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌耐药基因的探针，其中，
[0035] 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示；
[0036] 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0037] 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所 示；
[0038] 探针的5'端连接有荧光基团？411、册乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探针的3' 端连接有淬灭基团TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本发明实施例中，探针 的荧光报告基团为FAM，FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为Eclipse。 纯化方式可选自：HAP、PAGE和HPLC纯化方式，具体地引物和探针如下表：
[0039] 表1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因引物和探针
【主权项】
1. 一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物和探针，其特征在于，所 述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐药基因的探针，其中， 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所示； 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所示； 所述用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针如序列表中SEQ ID NO. 3所 示； 所述探针的5'端连接有荧光基团FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探针 的 3' 端连接有淬灭基团 TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括如权利要求1所述的引物和探针。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放剂、PCR反 应液、临界阳性质控品、阳性质控品、阴性质控品和工作标准品。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括：工作标准品1、工 作标准品2、工作标准品3和工作标准品4,其中， 所述工作标准品1为IX IO7拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因 片段； 所述工作标准品2为I X IO6拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因 片段； 所述工作标准品3为I X IO5拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因 片段； 所述工作标准品4为I X IO4拷贝/mL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因 片段。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为1.0 X 10 6拷贝/mL 的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药的基因片段。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的终浓 度均为0. 05-0. 9 y M，所述探针的终浓度为0. 05-0. 9 y M。
7. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应 体系中包括：终浓度为0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、终浓度为0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR缓冲液和终浓度为1. 5~5. OmM的含Mg离子的溶液。
8. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括：无菌水、终浓度 为0. 03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、终浓度为0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和 pH值为8. 3的终浓度为0? 01-0.1 M的三（羟甲基）氨基甲烷。
9. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述临界阳性质控品为1.0 X 10 4拷贝 AiL的所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的基因片段。
10. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为浓度0. 8%的生理 盐水。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。所述引物和探针包括：用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的正向引物、用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的反向引物和用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因的探针。所述试剂盒包括上述的引物和探针。所述引物、探针和试剂盒能够在MRSA的早期诊断出结果，为MRSA早期治疗起到至关重要的作用，同时，具有灵敏度高、检测速度快的特性。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104745688
【申请号】CN201510050931
【发明人】刘茹, 桑筱筱
【申请人】湖北永邦医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年1月30日