耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原I₁₂C及制备方法和应用的制作方法

专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原I₁₂C及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域，特别涉及一种用于人的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白抗原I12C及制备方法和应用。
背景技术：
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌指的是对恶唑类青霉素如甲氧西林、苯唑西林和氟氯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌，是一种存在人和动物的体表、鼻咽、会阴部及肠道的革兰阳性菌，通 常引发皮肤软组织感染、菌血症以及转移并发症，如肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。自1961年被英国学者Jevons首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一，其引起的局部感染经久不愈，全身感染死亡率高达20%。因其传播途径广泛，易暴发流行，又由于其致病性强，变异性大，且呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”，这一特点使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂。当前，MRSA已与乙型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。在国外，2005年美国的MRSA感染监控资料显示，美国全年的严重感染人数为9. 4万多人，致死病例约为1. 9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。在国内，2010年中国CHINET细菌耐药性检测网结果显示，国内主要地区14所教学医院，MRSA平均检出率为51. 7%，最高为77. 6% ；2008年中国CHINET细菌耐药性监结果显示，国内主要地区12所教学医院MRSA平均检出率为55. 9%，最高为77. 5%，属于MRSA感染的严重国家之一。以上海为例，2004年该地区14所医院金黄色葡萄球菌中MRSA的平均检出率为63. 9%，最高为86. 5%，而2006年MRSA的平均检出率为64. 6%，最高达92. 5%。由此可见，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌正在全球蔓延，其感染率和死亡率不断攀升，严重威胁人类健康。目前，万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最后一道防线，但1997年以来耐万古霉素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相继被分离出来，可见抗生素的发展远远跟不上细菌耐药性的发展，使得耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。目前，美国研发的MRSA疫苗已进入III期临床试验阶段，因此，研发具有自主知识产权的、高效、安全、经济的MRSA疫苗对控制MRSA感染、耐药性发展、生物恐怖防御和提高国际竞争力具有重要意义。由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA, IsdB、肠毒素、TSST-U α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌铁离子表面决定蛋白IsdB是一种外膜蛋白抗原，IsdB不仅是MRSA —个重要外膜锚钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。ClfA是一种调节金葡菌与纤维蛋白素的结合，促进金葡菌同生物材料表面、血块、血小板、内皮表面结合的黏附素。在金葡菌与血小板的结合中ClfA也起着重要的作用，在导管诱导所致金葡菌心内膜炎的动物模型中，其相互作用也很关键。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。本研究利用生物信息技术筛选出ClfA和IsdB的活性功能片段，并将活性功能片段组合起来，目前尚未见使用ClfA、IsdB选择两个亚单位的活性功能片段的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA双价疫苗的报道。

发明内容
针对耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性的问题，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白I12C,该融合蛋白表达量高，便于分离纯化，高效安全。本发明所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组融合蛋白I12C,由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融合。所述重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。所述连接肽为Linker,该连接肽的氨基酸序列结构-(GGGGS)η,其中较好的技术方案是η为1。活性片段IsdBl的氨基酸如SEQ ID NO: 3所示，核苷酸序列如SEQ ID Ν0:4所示；活性片段IsdB2的氨基酸如SEQ ID NO: 5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。所述的Clfa,的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，核苷酸序列如SEQ ID N0:8所
/Jn ο上述重组融合蛋白的制备方法包括以下步骤I)构建融合基因(并加入Linker)使用的引物如下
权利要求
1.一种重组融合蛋白I12C,其特征在于该融合蛋白由MRSA铁尚子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段IsdBl、IsdB2与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融口 O
2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I12C,其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸如SEQ ID NO:1 所示。
3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I12C,其特征在于，所述连接肽为Linker，该连接肽的氨基酸序列结构-(GGGGS)η，η为I。
4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I12C,其特征在于活性片段IsdBl的氨基酸如SEQ ID NO:3所示；活性片段IsdB2的氨基酸如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求1所述的重组融合蛋白I12C,其特征在于所述的Clfa的氨基酸序列如 SEQ ID NO:7 所示。
6.权利要求1-5任一所述的重组融合蛋白I12C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 O构建融合基因使用的引物如下Pl :5，-GCGGATCCATGGGCAGCGCACCAAACTCTCG-3’I12-Linker-P2 :5’ -GCTTCTTTACTGCTGCTGCCACCGCCACCGGCATTGGCTTTAGTAAA-3’P3 :5’ -GCCAATGCCGGTGGCGGTGGCAGCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCA-3， -Linker-Cl fA97_639P4 :5’ -ATGCGGCCGCTTATCACTCGAGCATACGAGGCGCAC-3’ 2)使用步骤I)设计的引物Pl及P2，通过PCR扩增出编码I12-Linker-的基因片段；使用P3及P4，扩增出编码-Linker-ClfA97_639的基因片段；再以扩增出的基因片段为模板，用引物Pl及P4扩增出编码I12C的基因片段； 3)将步骤2)所获得的基因片段克隆至表达重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌； 4)诱导转化后的宿主菌表达I12C重组蛋白； 5)纯化重组蛋白。
7.—种表达载体，其特征在于包含编码权利要求1所述重组蛋白的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的表达载体,其特征在于,所述表达载体为pGex系列载体、pET系列载体及PQE系列载体，优选为pGeX-6P-2。
9.一种表达如权利要求7或8所述表达载体的宿主菌。
10.如权利要求9所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌XLl-blue、BL21系列或HMS174系列，优选为大肠杆菌XLl-blue。
11.权利要求1所述的重组蛋白在制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗中的应用。
12.权利要求1所述的重组蛋白在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)疫苗重组蛋白I12C的制备方法和应用，该融合蛋白由MRSA铁离子表面决定蛋白IsdB的两个活性片段与ClfA抗原分子的一个活性片段组成，各片段通过连接肽融合。该融合蛋白纯度高，表达量高，便于分离纯化，高效安全，其制备方法简捷、容易放大、重复性好，所述融合蛋白辅以铝佐剂后，可制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的亚单位疫苗以及制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，通过动物试验验证，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好抗MRSA感染的免疫保护作用。
文档编号C12R1/19GK103059139SQ20121037501
公开日2013年4月24日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者曾浩, 邹全明, 冯强, 樊绍文, 卢陆, 蔡昌芝, 吴翼, 顾江, 章金勇 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学