专利名称：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，涉及用于人耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染免疫和治 疗的基因工程疫苗及其多价亚单位疫苗制备方法。
背景技术：
而押氧西林金黄色葡萄球菌(methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈，全身感染死亡率 高达20%，自1961年被首次发现，目前已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的 病原菌之一。2005年美国的MRSA感染监控資料显示，美国全年的严重感染人数为9. 4万多 人，致死病例约为1.9万人，这一数字甚至超过艾滋病致死人数。中国CHINET 2005年度的 调查结果，各大医院MRSA的检出率平均为69%。因其传播途径广泛，易暴发流行；又由于 其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点，被称为“超级细菌”。当前，MRSA已与乙 型肝炎、AIDS被列为世界三大最难解決的感染性疾病，并位居首位。目前，万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线，但1997以来年耐万古霉素的MRSA 相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防 治研究，已迫在眉睫。因此，研发一种有效的疫苗可能是预防和控制MRSA感染及其耐药性 发展有效途径。但是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离 纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将 菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使MRSA疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程 单独IsdB亚单位疫苗已进入II期临床试验阶段。与此同时，多亚单位融合蛋白疫苗也越 来越受到人们的关注。Ruggiero等认为在细菌感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复 杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用，在MRSA单个保护 性抗原疫苗研究基础上，构建的多亚单位疫苗具有MRSA多个抗原组分，能够激发机体产生 比单一亚单位成分更强的免疫反应，抗原成分相对于全菌疫苗更为简单，能够减少机体变 态反应的发生。细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主 要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性 的关键因素。新近研究证明，在MRSA所有致病作用因子中，ClfA是MRSA非常重要的外膜 蛋白，在MRSA感染的第一步粘附定植中起重要作用。针对ClfA单克隆抗体用于被动免疫 接种的疫苗已完成II期临床试验。IsdB不仅是MRSA—个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植 粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。以IsdB为组分的基 因工程疫苗正在进行II期临床试验。肠毒素(Staphylococcal enterotoxin, SE)是超抗原外毒素，通常由致病性金葡 菌特别是MRSA产生。SE可通过促使多数T细胞释放大量细胞因子而产生生物学效应，引起毒素休克综合征等临床症状。目前SE有SEA、SEB、SEC、SED和SEE等5个血清型，其中SEC 又可分为SEC1，SEC2和SEC3三个亚型。MRSA常为C、D型肠毒素。有学者构建无毒的缺乏 超抗原活性的突变体(mSEC)注射免疫小鼠，疫苗诱导了保护性Th2反应，并能抵抗MRSA的 攻击。说明无毒无超抗原特性的mSEC可以作为MRSA的疫苗候选抗原分子。ClfA和IsdB都是MRSA的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫 苗重要的候选抗原。SEC主要是由致病MRSA分泌表达，具有一定特异性，目前尚未见使用 ClfA, IsdB和mSEC三个亚单位以任何一种方式组合或者选择三个亚单位的活性功能片段 的融合蛋白作为免疫原性材料，制备MRSA多价疫苗的报道。
发明内容
本发明的目的针对现有疫苗存在的不足，旨在提供一种高效安全的MRSA基因工 程多价亚单位疫苗及其制备方法。本发明的技术方案是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗的活性成分是MRSA抗原 组分ClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体。 所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活性功能片段通过接头序列与肠毒素C突 变体连接在一起后，再通过接头序列与IsdB活性功能片段连接在一起而得到的融合蛋白 质。所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活性功能片段首先与肠毒素C突变体的融 合基因，再与IsdB活性功能片段在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的多亚单位 基因工程重组融合蛋白质。采用MRSAClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体基因制备的疫苗制剂， 由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗活性成分与Al (OH)3佐剂组成。为了得到本发明的MRSA基因工程疫苗，首先针对MRSA保护性抗原成分ClfA、 IsdB、mSEC进行单基因克隆，获得单个重组蛋白。然后，将ClfA亚单位活性功能片段 (ClfA484^559)与mSEC进行基因水平连接后，再与IsdB亚单位活性功能片段(IsdB337_462)进 行基因水平连接；或者先将IsdB337_462与mSEC进行基因水平连接后，再与IsdB337_462进行基 因水平连接，构建表达基因工程重组多价融合蛋白疫苗。该疫苗适用于注射免疫接种，可激 发产生较强的系统免疫应答，达到免疫预防MRSA感染的目的。因此，作为本发明MRSA因工 程疫苗的活性成分，是ClfA484_559、mSEC、IsdB337-462在基因水平上通过接头序列融合在一起 形成的基因工程重组融合蛋白质。可以使用本领域技术人员熟知的方法(参见Sambrook，ed. Molecular Cloning ALaboratoryManul(2nd. ed.),Vols. 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(1998) ；Current Protocols In MolrcularBiology, Ausubel, ed. John wiley&Sons, Inc. NewYork(1997)), 该方法包括以下步骤(1)提供MRSA ClfA、IsdB, mSEC亚单位保护性抗原的PCR扩增、基因克隆与序列 分析；(2)将步骤⑴的MRSA的ClfA、ISdB、mSEC单独的片段及活性功能片段ClfA484_559、 IsdB337_462与mSEC进行基因水平连接的三个亚单位融合的片段连接到原核表达质粒中；
(3)用步骤(2)的得到的重组表达质粒转化转化适当的宿主细菌细胞，得到基因 工程重组菌株，(4)在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤(3)的基因工程重组菌。(5)分离并纯化步骤⑷产生的重组蛋白质，即得到抗MRSA的基因工程疫苗。本发明的一个优选实施方案，所说的步骤1中克隆ClfA、IsdB、mSEC基因所使用的 引物分别是ClfA Pl 5' TCGGGATCC gATGGTAGCTGCAGATGCACCGGCTG 3'BamH IP2 5' GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCAC 3'XhoIIsdB P3 5' TCGGGATCC gATGAACAAACAGCAAAAAGAATT 3'BamH IP3， 5' GCGCTCGAGGTTTTTACGTTTTCTAGGTAATAC 3'XhoImSEC P7 Pl sense primer 5'-GTGTTAAGTCTTGCAGCTTACTATTTATGTTAAATGGCGCTCCTAAAC-3‘P7，P2 =Antisense primer 5' TTATTTTTTGGTTAAATGAACTTCTAC 3'P7”5' ATGAAGTTATTTGCTTTTATCTTCATATGTGTTAAGTCTTGCAGC 3'本发明的一个另优选实施方案，所说的步骤2中构建融合基因所使用的合成引物 分别是Pl 5'-TCGGGATCCgATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘ClfA484~559BamH IP2 5' -TGAACCGCCTCCACCCTCTGGAATTGGTTC-3'mSEC P3 5' -GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3‘P4 5' -TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3'Pl 5'-TCGGGATCCgATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘CS 力口 LinkerBamH IP5 5' -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3'P6 5 ‘ -GGTGGAGGCGGTTCACCAACAAATGAAAAAATG-3‘IsdB337~462 P7 5' -GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3‘XhoIPl 5'
-TCGGGATCCgATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘CSIBamH IP7 5' -GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3'XhoI P8 5' -TCGGGATCCgATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3’IsdB337~462BamH IP9 5' -TGAACCGCCTCCACC AGATTTATCGGTATTG-3'P8 5' -TCGGGATCCg ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3'IS 力口 LinkerBamH IP5 5' -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3'PlO 5' -GGTGGAGGCGGTTCAACAACACCATATATTG-3'ClfA484~559 Pll 5' -GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3'XhoIP8 5' -TCGGGATCCQATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3'ISCBamH IP 115' -GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3'XhoI本发明的再一个优选实施方案，所说的步骤4中纯化融合蛋白所用的阴离子填料 选自QS印harose HP、Q Sepharose FF或Q Sepharose XL ；镍离子亲和纯化填料选自Chel atingSepharose HP 或 Chelating Sepharose FF ；凝胶过滤层析柱填料选自 Superdex 75、 Superdex 200 或 Superdex HR 10/30。本发明采用基因工程技术克隆表达保护性抗原成分，表达量高，便于分离纯化，而 且高效安全。该重组蛋白可以直接与佐剂(如Al (OH)3佐剂、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐 齐U、分枝杆菌卡介苗佐剂等)按常规配比组成疫苗制剂配合使用，适用于注射免疫接种。本发明的基因工程重组蛋白的表达与基本特性①本发明中所构建的重组表达质 粒均在原核表达系统_大肠杆菌中诱导表达。②重组蛋白ClfA、IsdB、mSEC的表达率约分 别为 32%、25%和 5% ；重组融合蛋白 CSI (ClfA484_559-mSEC-IsdB337_462)表达率约 20% ；重组 融合蛋白ISC(IsdB337_462-mSEC-ClfA484_559CSI)表达率约10% ；③各重组蛋白均以包涵体形 式表达，纯化后的纯度大于80%。④各重组蛋白均能够诱导动物产生特异性的抗体。本发明的疫苗可通过皮下(肌肉)注射途径进行免疫接种，激发机体产生高滴度 IgG抗体和细胞免疫应答。并经动物实验证实，本发明的基因工程重组多价疫苗具有良好的 抗MRSA感染的免疫保护效果。为进一步的联合疫苗研究打下基础。本申请人在前期研究中以ClfA484_559亚单位活性片段代替全长蛋白，以IsdB337_462 亚单位活性片段代替全长蛋白，并达到预期的实验目的。在本发明中，ClfA484_559以及 IsdB337_462亚单位活性片段作为多亚单位融合蛋白的组分之一。
图1 % ClfA (图 A)、mSEC (图 B、IsdB(图 C)基因 PCR 扩增结果
图中，A 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2_4为目的基 因ClfA (1023bp) ；B 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2_4为目的基 因mSEC (786bp) ；C 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2_4为目的基因 IsdB(1938bp)的 PCR 扩增产物。图 2 为表达载体 PQE30-ClfA (图 A)、PQE30_mSEC (图 B，786bp)、PQE30_IsdB (图 C， 1938bp)的酶切鉴定结果。图A 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2_4为重 组表达质粒PQE30-ClfA经酶切后片段(3400bp和1 023bp)；图B 泳道1为核酸(DNA)分子 量标准(Marker)，泳道2_4为重组表达质粒PQE30_mSEC经酶切后片段(3400bp和786bp)； 图C 泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)，泳道2_4为重组表达质粒PQE30-IsdB经 酶切后片段(3400bp和1938bp)。图3 为 SDS-PAGE 检测 ClfA (图 A)、mSEC(图 B)、IsdB (图)蛋白表达。图中，A泳道 1-2 为 pET_28a(+)/BL21 诱导前后，泳道 3-9 分别为 pET-28a_ClfA/ BL21经IPTG诱导0-6h(36. 8Dr)，泳道10为蛋白分子量标准，UVP扫描分析目的蛋白表达 量为32%;B 泳道1为蛋白分子量标准，泳道2-3为E. coli BL21诱导前后，泳道4_5分别 为pET-28a(+)/BL21诱导前后，泳道6，7，9为pET-28a_mSEC/BL21诱导前；泳道8，10分别 为pET-28a-mSEC/BL21经IPTG诱导6h(30. 5Dr), UVP扫描分析目的蛋白表达量为25% ;C 泳道 1 为 pET-28a(+)/BL21 经 IPTG 诱导 4 小时，泳道 2_4 为 pET-28a_IsdB/BL21 经 IPTG 诱导4h(72. 2Dr)，泳道5为蛋白分子量标准，UVP扫描分析目的蛋白表达量为5%。图4为SDS-PAGE检测ClfA(图A)、mSEC(图B)、IsdB(图C)抗原纯化质量鉴定。图中，A 泳道1-6为纯化蛋白ClfA(36. 8Dr)，泳道7为蛋白分子量标准；B 泳道1 为蛋白分子量标准，泳道2-3为纯化蛋白mSEC(30. 5Dr) ；C 泳道1为蛋白分子量标准，泳道 2-3 为纯化蛋白 IsdB (72. 2Dr)。图5 为 ClfA484_559、mSEC、IsdB337_462 三个亚单位融合基因 CSI (图 A)和 ISC (图 B) 重叠延伸PCR扩增结果。图中，A 泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2_3为目的基 因CSI的PCR扩增产物(1425bp) ；B 泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2为目的基 因ISC的PCR扩增产物(1425bp)。图6为三亚单位融合基因表达载体pET28a_CSI (图Α)和pET28a_ISC (图B)酶切
鉴定结果。图中A 泳道1为核酸分子量标准(Marker)，泳道2为pET28a_CSI重组质粒经双 酶切产物，泳道3为pET28a质粒；B 泳道1为pET28a质粒，泳道2为pET28a_ISC重组质粒 经双酶切产物，泳道3为核酸分子量标准(Marker)。图7为以SDS-PAGE方法检测CSI (图A)和ISC(图B)融合蛋白表达。图中，A 泳道 1 为 pET-28a(+)/BL21 诱导前；泳道 2 为 pET_28a(+)/BL21 经 IPTG 诱导后；泳道3，5为重组pET28a-ISC/BL21诱导前；泳道4，6分别为pET28a_ISC/BL21诱导 4小时和6小时；泳道7为蛋白分子量标准。B 泳道 1 为 pET-28a(+)/BL21 诱导前；泳道 2 为 pET_28a(+)/BL21 经 IPTG 诱导 后；泳道3为重组pET28a-ISC/BL21诱导前；泳道4为pET28a_ISC/BL21诱导6小时；泳道 5为蛋白分子量标准。图8为SDS-PAGE检测CSI和ISC融合蛋白纯化质量鉴定结果。
图中，泳道1-2为融合蛋白CSI，重组工程菌；泳道3-4融合蛋白ISC ；泳道5为蛋 白分子量标准。
具体实施例方式耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗采用ClfA的活性功能片 段与肠毒素C突变体融合，获得融合重组蛋白，再与IsdB的活性功能片段在基因水平融合， 制备MRSA的基因工程疫苗。下面结合附图及实施例对本发明作详细描述本发明。实施例1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA、IsdB、mSEC基因的克隆1.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WH0_2(第三军医大学药理学教研室保存)2.液氮罐中取出保存的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌WH0-2菌株涂布于WH0-2专用 固体培养基上，于37°C，培养过夜。基因组抽提试剂盒抽提MRSA基因组。3.采用PCR方法自MRSA基因组分别扩增ClfA、IsdB, mSEC的编码基因。1)引物设计合成如下(下划线示酶切位点碱基序列，灰色为接头碱基序列)根据GenBank公布的基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。ClfA Pl 5' TCGGGATCC @ ATGGTAGCTGCAGATGCACCGGCTG 3'BamH IP2 5' GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCAC 3'XhoIIsdB P3 5' TCGGGATCC g ATGAACAAACAGCAAAAAGAATT 3'BamH IP4 5' GCGCTCGAGGTTTTTACGTTTTCTAGGTAATAC 3'XhoImSEC P7 Pl sense primer 5 ‘ GTGTTAAGTCTTGCAGCTTACTATTTATGTTAAATGGCGCTCCTAAAC3‘P8 P2 =Antisense primer 5' TTATTTTTTGGTTAAATGAACTTCTAC 3‘P9 5' ATGAAGTTATTTGCTTTTATCTTCATATGTGTTAA GTCTTGCA GC 3'2)目的基因的PCR扩增以MRSA基因组DNA为模板，Pl和P2, P3和P4, P7、P8和P9引物分别扩增ClfA、 IsdB、mSEC基因，采用如下PCR体系和程序模板DNA 1μ 1 ;10XPCR缓冲液(含氯化镁)5μ 1 ;dNTPs(l(kimol/L)4y 1 ；上、 下游引物(0. 025mmol/L)各Iyl ； Taq DNA聚合酶(5u/μ 1) 0. 51，加去离子水至终体积 50 μ 1。将反应体系混勻，离心处理后，加入30μ 1石蜡油。94°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60°C退火Imin秒，72°C延伸Imin秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。反应完毕后 取1 μ 1反应产物，1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。3)PCR产物的回收(回收试剂盒购自北京天为时代公司，按试剂盒使用说明书操 作)(1)灌制1. 0%的琼脂糖凝胶；
(2)将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳；(3)在紫外线灯下分离含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP管；(4)加入DNA结合缓冲液，65°C水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5. 0 6. 0 之间；(5)将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；(6)加入500 μ 1洗涤缓冲液，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；(7)重复步骤(6)；(8) 12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5ml EP管，加入20 μ 1的TE缓冲 液，65°C孵育10分钟，12000g离心1分钟，取2μ1电泳，UVP紫外扫描检查回收效果。PCR 扩增ClfA、IsdB、mSEC基因结果分别如附图1A、图1B、图IC所示。图1的图示结果表明，目 的基因 ClfA(1023bp)、mSEC(786bp)、IsdB(1938bp)的 PCR 扩增是成功的。4. PCR产物的克隆1)连接反应根据PCR回收产物浓度分别与pMDIS-T载体按外源片段与载体摩尔数比为 1 2 10的原则，设计连接反应体系如下目的片段连接回收片段(200ng/y1) Ιμ pMD18-T(50ng/y 1)1 μ 1ddH203 μ 1连接溶液5μ1_
连接溶液__5μ1总体积10 μ 1 -
总体积ΙΟμΙ16°C连接3小时。2)连接产物转化及重组子的筛选、鉴定(1)大肠杆菌DH5 α感受态菌的制备(CaCl2法)无菌接种环蘸取-70°C冻存的DH5 α保种液，三线法划线接种于LB平板，37°C培养 12 16小时。挑取单个菌落接种于2ml LB培养液中，37°C摇床培养12 16小时。将过夜培养的DH5ci按比例转种至LB培养液中，37 °C摇床培养至OD6tltl为 0. 2 0. 4时，800g离心5分钟收集细菌。加入Iml预冷的0. IM CaCl2重悬沉淀，冰水浴3小时。4°C 800g离心5分钟，弃上清。加入100 μ 1预冷的0. IM CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。(2)含有 X-Gal、IPTG 的 Amp+LB 平板的制备LB固体培养基用前熔化，待温度降至50°C左右加入Amp至终浓度为100mg/L，混 勻后倾到平板，自然凝固。使用前2 3小时取Amp+LB平板，加入40 μ 1 X-Gal (20mg/ml)、 5μ lIPTG(200mg/ml)，用L棒涂布均勻，置于37°C孵箱备用。(3)连接产物转化
同时分别取三管感受态菌液各100 μ 1，第一管加入连接反应产物，第二管加入对 照插入段(control insert)DNA连接产物，作为阳性对照，第三管不加外源DNA，作为阴性 对照，冰水浴60分钟。42°C水浴热休克90秒，迅速放置冰水浴1 2分钟。每管各加700 μ 1 LB培养液，37°C摇床培养1小时。各管以800g离心1分钟，吸弃400 μ 1上清后混勻沉淀， 各取50 μ 1涂布Amp+LB平板，37 °C孵箱培养过夜。(4)目的重组子的筛选与鉴定①挑取连接产物转化平板上分隔良好的蓝、白斑菌落分别接种Amp+LB平板，37°C 培养12 16小时。转种于Amp+LB培养液中，37°C摇床培养过夜。
②质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)分别抽提蓝白斑质粒取菌液分装于1. 5ml离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀。每管加100 μ 1溶液I悬浮，充分振荡混勻。加入100 μ 1溶液II，轻柔混勻，冰水浴5分钟。加入250 μ 1溶液III，轻振混勻，室温放置10分钟。4°C、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中。12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液。加入500 μ 1洗涤缓冲液于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。重复步骤7。12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发。将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液，65°C水浴5分钟， 12000g离心1分钟。取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20°C保存备用。③酶切鉴定分别对蓝斑质粒DNA和白斑质粒DNA进行双酶切。(限制性内切酶 购自大连TaKaRa公司)蓝斑质粒DNA 1μ 1BamHI1 μ 1IOX 缓冲液(K) 1μ 1ddH207 μ 1_总体积10 μ 1重组质粒DNA 5μ 1NdeI 或 NcoI 0. 5 μ 1XhoI0. 5μ 1IOX 缓冲液(K) 1μ 1ddH203 μ 1_总体积10 μ 1混勻后，37°C水浴4小时。5. PCR产物的序列分析将TA克隆阳性转化菌株送至公司，按常规方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。实施例2 ClfA484^559与mSEC融合基因ClfA484_559—mSEC (CS)的获得引物设计与合 成ClfA484^559 Pl 5'-TCGGGATCC@ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘BamH IP2 5' -TGAACCGCCTCCACCCTCTGGAATTGGTTC-3'mSECP3 5' -GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3‘P4 5' -TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3' 分别以实施例1回收的ClfA和mSEC为模板，用Pl和P2、P3和P4引物分别 扩增ClfA484_559和mSEC基因，PCR扩增体系为模板DNA 1μ 1 ；IOXPCR缓冲液5 μ 1 ； dNTPs(10mmol/L)4y 1 ；引物(0. 025mmol/L)各 1 μ 1 ； Taq DNA 聚合酶(5u/μ 1)0. 5μ 1 ；力口 去离子水至终体积50 μ 1。将反应体系混勻，离心处理后，加入30μ 1石蜡油。94°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60°C退火40秒，72°C延伸40秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。反应完毕后取 1 μ 1反应产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。以回收的带有的Linker的目的条带中ClfA484_559和mSEC基因为模板，Pl和P4为 引物进行重叠延伸PCR反应，获得CS片段。PCR扩增体系为同前。重叠延伸PCR扩增反应94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C 延伸70秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。实施例3 CS 与 IsdB337_462 融合基因 CS_IsdB337_462 (CSI)的获得引物设计与合成给CS 加Pl 5' -TCGGGATCCg ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘LinkerBamH IP5 5' -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3'IsdB337_462 P6 5' -GGTGGAGGCGGTTCACCAACAAATGAAAAAATG-3 ‘P7 5' -GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3'XhoI分别以实施例1回收的IsdB和实施例2回收的CS为模板，用P6和P7、Pl和P5 为引物，分别扩增带有Linker的IsdB337_462和CS基因。PCR扩增体系为模板DNA 1 μ 1 ； 10XPCR缓冲液(含氯化镁)5μ 1 ；dNTPs(10mmol/L)4y 1 ；引物(0. 025mmol/L)各 1 μ 1 ；Taq DNA聚合酶(5u/ μ 1)0.5μ 1,加去离子水至终体积50 μ 1。将反应体系混勻，离心处理后，加入30μ 1石蜡油。94°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60°C退火40秒，72°C延伸40秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。反应完毕后取 1 μ 1反应产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。以回收的带有Linker的IsdB337_462和CS基因为模板，Pl和P7为引物进行重叠延 伸PCR反应获得三个亚单位的融合基因CSI。PCR扩增体系为同前。重叠延伸PCR扩增反应94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C 延伸70秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。融合基因CSI PCR产物的克隆及序列分析同前，重叠延伸结果见附图5A所示。实施例4 IsdB337-462 与 mSEC 融合基因 IsdB337_462_mSEC (IS)的获得引物设计与合成IsdB337_462 P8 5' -TCGGGATCC @ ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3‘BamH IP9 5' -TGAACCGCCTCCACC AGATTTATCGGTATTG-3‘mSECP3 5' -GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3‘ P4 5 ‘ -TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3‘以实施例1回收的IsdB和mSEC基因为模板，分别以P8和P8、P3和P4为引物进行 重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为模板DNA 1μ 1 ； 10 XPCR缓冲液5 μ 1 ；dNTPs (lOmmol/ L)4y 1 ；引物(0. 025mmol/L)各1μ 1 ；Taq DNA聚合酶(5u/μ 1)0. 5 μ 1，加去离子水至终体 积 50 μ 1。将反应体系混勻，离心处理后，加入30μ 1石蜡油。94°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60°C退火40秒，72°C延伸40秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。反应完毕后取 1 μ 1反应产物，1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。以回收的带有Linker的IsdB337_462和mSEC基因为模板，P8和P4为引物进行重叠 延伸PCR反应，获得IS基因片段。PCR扩增体系同前。重叠延伸PCR扩增反应94°C预变性5分钟，94°C变性30秒s，60°C退火30秒， 72°C延伸70秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。实施例5 ClfA484^559与IS基因融合获得IS_ClfA484_559 (ISC)的获得引物设计与合成给IS 加 P8 5' -TCGGGATCC■ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3‘linkerBamH IP5 5' -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3'ClfA484~559 PlO 5' -GGTGGAGGCGGTTCAACAACACCATATATTG-3‘Pll 5' -GCGCTCGAG CTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3‘XhoI以实施例1回收的ClfA为模板，以实施例4回收的IS基因为模板，以PlO和P11， P8和P5为引物扩增活性功能片段ClfA484_55(1和IS基因。PCR扩增体系为模板DNAl μ 1 ； IOXPCR 缓冲液 5μ 1 ；dNTPs(10mmol/L)4y 1 ；引物(0. 025mmol/L)各 1μ 1 ；Taq DNA 聚合 酶(5u/ μ 1) 0. 5 μ 1，加去离子水至终体积50 μ 1。将反应体系混勻，离心处理后，加入30μ 1石蜡油。94°C预变性5分钟，94°C变性 30秒，60°C退火40秒，72°C延伸70秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。反应完毕后取 1 μ 1反应产物，1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。以回收的带有Linker的IS和活性功能片段ClfA484_55(1为模板，P8和Pll为引物 进行重叠延伸PCR反应，获得三个亚单位的融合基因ISC。PCR扩增体系同前。重叠延伸PCR扩增反应94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C 延伸90秒，35个循环，72°C完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。融合基因ISC PCR产物的克隆及序列分析同前，重叠延伸结果见附图5B所示。
图5的图示结果表明，重叠延伸PCR扩增三个亚单位融合目的基因CSI和ISC成 功。实施例6重组基因表达质粒及高效表达工程菌的构建及筛选1.重组质粒的构建
将含目的基因的pMD-18T载体及表达载体pQE_30 (+)或pET_28a(+)(购自美国 Novagen公司，本室保存)双酶切，酶切产物经1. 0%琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后， 用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒，双酶切，1. O %琼脂糖凝胶电泳鉴定。有关操作具体步骤如下1. 1质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒，按试剂盒使用说明书操作)(1)挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37°C摇床培 养过夜；(2)取菌液分装于1. 5mL离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀；(3)每管加100 μ L溶液I悬浮，充分振荡混勻；
(4)加入100 μ L溶液II，轻柔混勻，冰水浴5分钟；(5)加入250 μ L溶液III，轻振混勻，室温放置10分钟；(6) 40C、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中；(7) 12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液；(8)加入500 μ L洗涤缓冲液于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液，重复 洗涤一次；(9) 12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发；(10)将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液，65°C水浴5分钟， 12000g离心1分钟；(11)取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20°C保存备用。1.2琼脂糖凝胶电泳1. 0%琼脂糖凝胶，IXTAE缓冲液，120_150mA，电泳20-40分钟。50XTAE储存液配方2. Omol/L Tris碱，1. Omol/L NaAc,0. Imol/L Na2EDTA ；用冰 醋酸调节PH8. 3。1. 3质粒DNA的酶切反应1 μ g 质粒 DNA1 μ 1 IOX缓冲液(见上海生工公司产品说明书)1 μ 1 限制性内切酶 Nco I/XhoI 或 NdeI/XhoI (lOu/μ 1)用双蒸水补至10 μ 1混合后37°C温育1-2小时。1. 4琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1. 5mL EP管。加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA结合缓冲液，65°C水浴使凝胶完全溶化并保 持溶液pH在5. O 6. O之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的 液体。加入配套的洗涤缓冲液，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1. 5mL EP管，加入一定体积的TE缓冲 液，65°C孵育10分钟，12000g离心1分钟，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效^ ο 1. 5连接反应(使用上海生工公司连接试剂盒)通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体 摩尔数比一般为1 2 10的原则，设计连接反应体系如下目的DNA 1 μ 1 ；质粒载体1 2 μ 1 ；连接溶液5 μ 1 ；ddH20 2 3 μ 1，总体积 10 μ 1。22°C连接 12-16 小时。1. 6感受态菌的制备(CaCl2法)(1)无菌接种环蘸取_70°C冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37°C培 养12 16h。(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37°C摇床培养12 16h。(3)将过夜培养的DH5a按1 %比例转种至LB培养液中，37°C摇床培养至0D_至 0. 2 0. 4时，8000g离心5分钟收集细菌。(4)加入Iml预冷的0. lmol/LCaCl2重悬沉淀，冰水浴3小时。4°C 8000g离心5 分钟，弃上清。加入100 μ 1预冷的0. lmol/L CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。1.7连接产物转化(1)取感受态菌液100 μ 1，加入连接反应产物；冰水浴60分钟，42°C水浴热休克 100s，迅速放置冰水浴1 2分钟。(2)加100 μ 1 LB培养液，37°C摇床培养1小时。(3)以8000g离心10分钟，吸弃100 μ 1上清后混勻沉淀，各取50 μ 1涂布平板， 37 °C孵箱培养过夜。1. 8阳性工程菌的筛选鉴定(1)挑取转化平板单菌落培养(2)抽提质粒(方法同前)(3)双酶切鉴定(方法同前)PQE30-ClfA、PQE30_mSEC、PQE30_IsdB 双酶切鉴定结果分别见附图 2A、图 2B、图 2C0图2的图示结果表明，酶切的片段大小与预期一致(ClfA1023bp、mSEC786bp、 IsdB1938bp)，表达载体构建成功。pET28a-CSI和pET28a_ISC双酶切鉴定结果分别见附图6A、图6B图6的图示结果表明，酶切的片段大小与预期一致(1425bp)，表明融合基因表达 载体的构建成功。2.高效表达融合蛋白工程菌的诱导及蛋白表达取经鉴定的重组菌接种于3ml含Amp的LB培养液中，37°C摇床培养过夜。次日将 过夜培养的重组工程菌按的比例转种于20ml或Amp的LB培养液中，37°C摇床培养2. 5 小时，以IPTG诱导，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。PQE30-ClfA、PQE30-mSEC、PQE30-IsdB蛋白诱导表达结果分别见附图3A、图3B、图3C。pET28a-CSI和pET28a_ISC蛋白诱导表达结果分别见附图7A、图7B图7A的结果显示经UVP扫描分析目的蛋白表达量为20%;图7B的结果显示经UVP 扫描分析目的蛋白表达量为10%。实施例7基因重组表达工程菌的发酵发酵工艺如下采用德国B. Bron IOL发酵罐，发酵过程中种子菌10%比例接种，保持45%溶氧、 温度37°C、pH7. 4，待葡萄糖浓度降为0. 时加入IPTG 500 μ mol/L诱导4 6小时收菌。发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。 发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0. 6%酵母 浸出液禾口 2mg/L ZnCl2 · 4H20、2mg/LCoCl2 · 4H20、4mg/L FeSO4 · 16H20、5mg/L H3BO3U. 6mg/ LMnCl2 · 4H20、4mg/L CuSO4 而成。发酵后回收菌液，4°C离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。结果10L发酵菌液可以收获细菌湿重600克左右。实施例8重组目的蛋白的纯化及剂型制备1.可溶性上清和包涵体提取将高效表达的菌体200_500g以TE缓冲液(20mmol/ L Tris,5mmol/L EDTA，pH 8.0)1 10 (ff/V)比例悬浮，4°C预冷后采用细胞勻浆机使其混合 均勻。采用高压均质机在压力为70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4 6次)，破菌完毕后， 取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500Xg离 心30分钟，弃沉淀，再以15，000 Xg离心40分钟，收集沉淀即为包涵体。包涵体以1 10 (W/ V)的比例分别用洗涤液 A (20mmol/LTris, 5mmol/LEDTA, pH 8. 0)和洗涤液 B (20mmol/ LTris、2mol/L尿素，pH 8.0)各洗涤2次。洗涤条件为4°C搅拌20分钟，15，000 X g离心 40分钟，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液(lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris、 8mol/L尿素pH 8· 0)以1 10 (ff/V)的比例混合，4°C搅拌3小时，15，000 X g离心45分钟， 取上清作为下一步纯化的原料。包涵体提取所用缓冲液1)TE 缓冲液:20mmol/L Tris,5mmol/L EDTA, pH 8. 02)包涵体洗涤液 A :5mmol/L EDTA、20mmol/L TrisU% Triton X-100，pH 8. 03)包涵体洗涤液 B :20mmol/L Tris、2mol/L 尿素，pH 8. 04)包涵体溶解液lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L 尿素(pH 8. 0)2.金属离子螯合层析选择亲和层析柱Chelating S印harose进行纯化，使用 20mmol/L Tris,5mmol/L EDTA，pH7. 0 9. 0对目的蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱。3.阴离子柱纯化选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，使用20mmol/L Tris,5mmol/ L EDTA, pH7. 0 9. 0对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。4. Superdex凝胶过滤层析脱盐步骤3所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩 或超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex过滤脱盐，脱尿素及咪唑。5.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。其中， 步骤2所述镍离子亲和纯化填料包括Chelating S印harose HPXhelating S印haroseFF ；
步骤3 所述阴离子纯化填料包括 Q Sepharose HP,Q Sepharose FF、Q Sepharose XL ；步骤4 所述凝胶过滤层析柱包括 Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30。纯化结果如附图3所示。6.上述方法获得的重组蛋白分别被制备成冷冻干燥剂型或胶囊剂。其中冷冻干燥剂型加纯化水或注射用水溶解后供口服。冷冻干燥剂型制备方法为向纯化所获得的目的 蛋白中加入适当比例(5% 20%)的稳定剂甘露醇(果糖或山梨醇)，混勻，除菌过滤分装 后冷冻干燥；胶囊剂型制备方法为首先向纯化所获得的目的蛋白中加入适当比例(5% 20% )的稳定剂甘露醇，混勻，除菌过滤分装后冷冻干燥，再装填入肠溶胶囊。目的蛋白ClfA、mSEC、IsdB纯化结果分别见附图4(A、B、C)目的蛋白CSI与ISC纯化结果见附图8实施例9动物免疫及抗体检测目的蛋白经过纯化后免疫Balb/c小鼠，100 μ g/只，100 μ 1抗原与等量Al (OH) 3 佐剂混合，注射小鼠腹部和腹股沟皮下免疫。每周一次，分别于免疫3、4次后的4天采血， ELISA检测血清特异性抗体效价的改变。结果免疫3次后的抗体阳性率在90%，免疫4次后的抗体阳性率达到98%。实施 例10免疫动物的攻毒保护同实施例9的免疫方案，免疫4次后的第10天采用致死剂量的MRSA菌超声上清 液(含SEC毒素及其他致病物质，蛋白浓度lmg/mL)0. 05ml腹腔注射对免疫小鼠及对照小 鼠进行攻毒实验，观察各组小鼠的死亡情况，在10天的观察期后计算免疫小鼠的死亡/生 存率，如表1。表1注射免疫BALB/c小鼠后攻毒免疫保护效果 结果显示，ClfA, IsdB和mSEC单亚单位免疫组的免疫保护率分别为13.3%、31. 0%和27. 6%，而三个亚单位的物理混合或融合免疫组的免疫保护率提高到60. 和65. 6%和62. 1%，经统计分析结果显示，多亚单位抗原组较单一亚单位组的免疫保护率高， 且相差显著；融合蛋白组免疫保护率比多亚单位物理混合组免疫保护率略高，但差异不显 著。结果证实单一抗原很难诱导有效和全面的保护性免疫应答，多种抗原组合能够诱导更 有效的保护性免疫应答。 结论基因工程多亚单位融合疫苗抗原CSI和ISC免疫BALB/c小鼠较其他各组可 产生针对MRSA活菌攻击有效的保护作用，同时融合方式的疫苗便于生产操作，避免了多个 亚单位分别生产、纯化的缺点，使制作工艺更加简单。
权利要求
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗，其特征在于该疫苗的活性成分是MRSA抗原组分ClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活 性功能片段通过接头序列与肠毒素C突变体连接在一起后，再通过接头序列与IsdB活性功 能片段连接在一起而得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述活性成分是将MRSA抗原组分ClfA活 性功能片段首先与肠毒素C突变体的融合基因，再与IsdB活性功能片段在基因水平上通过 接头序列融合在一起形成的多亚单位基因工程重组融合蛋白质。
4.采用MRSAClfA和IsdB活性功能片段以及肠毒素C突变体基因制备的疫苗制剂，其 特征在于所述疫苗由权利要求1-3中任一所述的基因工程疫苗活性成分与Al (OH)3佐剂、 不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、分枝杆菌卡介苗佐剂等按常规方法组成。
5.制备权利要求1-4任一所述的基因工程疫苗的方法，主要包括以下步骤(1)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA和IsdB亚单位保护性抗原以及MRSA肠毒素C突 变体目的基因的PCR扩增、基因克隆与序列分析，得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA亚 单位活性功能片段基因；(2)将步骤(1)所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA亚单位活性功能片段基因通 过重叠延伸PCR方法与肠毒素C突变体基因连接后，再与IsdB亚单位活性功能片段基因通 过重叠延伸PCR方法连接起来；或者先将亚单位活性功能片段基因与肠毒素C突变体基因 mSEC基因水平连接后，再与亚单位活性功能片段基因水平连接，构建表达基因工程重组多 价融合蛋白疫苗，得到ClfA和IsdB活性功能片段与肠毒素C突变体的融合基因，连接到原 核表达质粒中，得到重组表达质粒pET28a-CSI或pET28a_ISC ；(3)用步骤(2)的得到的重组表达质粒转化的宿主细菌细胞，得到基因过程重组菌株 pET28a-CSI/BL21 或pET28a_ISC/BL21 ；(4)在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤(3)的基因工程重组菌株 pET28a-CSI/BL21 或 pET28a_ISC/BL21 ；(5)分离并纯化步骤(4)产生的重组蛋白质，即得到本发明所述耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌重组多亚单位基因工程疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是在步骤1中，克隆ClfA、IsdB、mSEC亚单 位基因使用的引物如下ClfA Pl 5' TCGGGATCC g ATGGTAGCTGCAGATGCACCGGCTG 3'BamHIP2 5' GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCAC 3'XhoIIsdB P3 5' TCGGGATCC |g| ATGAACAAACAGCAAAAAGAATT 3'BamH IP4 5' GCGCTCGAGGTTTTTACGTTTTCTAGGTAATAC 3'XhoImSEC P7 Pl :sense primer 5'-GTGTTAAGTCTTGCAGCTTACTATTTATGTTAAATGGCGCTCCTAAAC-3' P8 P2 =Antisense primer 5' TTATTTTTTGGTTAAATGAACTTCTAC 3' P9 5' ATGAAGTTATTTGCTTTTATCTTCATATGTGTTAAGTCTTGCAGC 3'。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤2中构建融合基因使用的合成引物 如下Pl 5' -TCGGGATCC @ ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3 ‘ClfA484-559BamH IP2 5 ‘ -TGAACCGCCTCCACCCTCTGGAATTGGTTC-3‘ P3 5 ‘ -GGTGGAGGCGGTTCAATGAAGTTATTTGCT-3‘mSECP4 5 ‘ -TTTTTTGGTTAAATGAACTTCTACATTA-3‘ Pl 5'-TCGGGATCC§ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘CS 加 LinkerBamH IP5 5 ‘ -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3‘ P6 5 ‘ -GGTGGAGGCGGTTCACCAACAAATGAAAAAATG-3‘IsdB337-462P7 5 ‘ -GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3‘ XhoIPl 5'-TCGGGATCC§ATGACAACACCATATATTGTAGTTGTTA-3‘CSIBamH IP7 5 ‘ -GCGCTCGAGAGATTTATCGGTATTGGCTTTTGTA-3‘ XhoIP8 5 ‘ -TCGGGATCC@ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3‘IsdB337-462BamH IP9 5' -TGAACCGCCTCCACC AGATTTATCGGTATTG-3‘ P8 5 ‘ -TCGGGATCCgATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3‘IS 加 LinkerBamH IP5 5 ‘ -TGAACCGCCTCCACCTTTTTTGGTTAAATG-3‘ PlO 5' -GGTGGAGGCGGTTCAACAACACCATATATTG-3'ClfA484-559Pll 5' -GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3' XhoIP8 5' -TCGGGATCC g ATGCCAACAAATGAAAAAATGAC-3' BamH IISCPll 5' -GCGCTCGAGCTCTGGAATTGGTTCAATTTCACCCG-3'。 XhoI
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤4中，所述阴离子纯化填料 选自QS印harose HP、Q Sepharose FF或Q Sepharose XL ；镍离子亲和纯化填料选自 ChelatingSepharose HP 或 Chelating Sepharose FF ；凝胶过滤层析柱选自 Superdex 75、 Superdex 200 或 Superdex HR 10/30。
全文摘要
本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法。该疫苗选用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ClfA和IsdB两个抗原分子的活性功能片段与MRSA较特异的肠毒素C突变体重组融合表达，构建获得基因工程重组融合多价抗原蛋白，辅以铝佐剂，制备基因工程重组多亚单位疫苗。该基因工程疫苗构建方法独特，制备工艺简捷、容易放大、重复性好，所获疫苗蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。
文档编号A61K39/085GK101843899SQ20101018069
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月24日 优先权日2010年5月24日
发明者向云, 周红, 周维英, 李军, 李斌, 毛旭虎, 潘夕春, 石云, 蔡昌芝, 邹全明, 郭刚, 陈晓红 申请人:中国人民解放军第三军医大学