专利名称：能与金葡菌自分泌的rnaiii激活蛋白结合的环多肽及其医药用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组环多肽，具体涉及够与金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白结合的环多肽，该结合肽能特异抑制金葡菌的毒素产生。本发明还涉及这些环多肽在医药领域中的应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一类常见的革兰氏阳性致病菌，是引起烧伤及战伤感染、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。目前临床上对金葡菌的治疗多采用联合使用抗生素的办法，但是效果并不理想。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，控制金葡菌感染是临床医学亟待解决的问题之一。
金葡菌的主要致病物质是毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，及RNAIII控制的。RNAIII激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期其RNAIII水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNAIII的水平是由金葡菌自身分泌的蛋白，RANIII激活蛋白(RNAIII activating protein)，也称RAP调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病。1998年Balaban等在“Science”杂志发表研究结果表明，用他们制备的RAP免疫动物，其抗体可以有效地保护小鼠免受金葡菌的感染(Balaban N，et al.Autoinducer ofvirulence as a target for vaccine and therapy against Staphylococcus aureus.Science，1998，280(17)438-440)。目前，有关RAP的存在及序列尚有争论，也未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一组能够与金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白结合的环多肽，该结合肽能特异抑制金葡菌的毒素产生。
本发明的另一目的是提供这些环多肽在医药领域中的应用。
为实现本发明的第一个目的，我们用改进的文献方法从我国临床致病金葡菌菌株04018中分离出一种可抑制RNAIII活性的蛋白，我们将之命名为RAP(Y)。我们采用噬菌体展示技术从随机环多肽库中筛选出能特异与RAP(Y)分子结合并抑制其活性的小分子多肽，目的是阻断RAP(Y)对毒素产生的诱导作用，从而切断金葡菌毒素产生的信号转导，为治疗金葡菌感染开辟新的途径。本发明的多肽无论从来源还是从结构上完全是新的，未见任何文献报道，其作用靶蛋白RAP(Y)也未见文献报道。
本发明的能够与金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白结合的环多肽，是具有以下通式结构的多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1。
其中，C代表天然L-型半胱氨酸残基或其D-型异构体；X代表下述四种天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体中的任意一种，即谷氨酰胺残基(Q)、谷氨酸残基(E)、天冬氨酸残基(D)和天冬酰胺残基(N)；H代表组氨酸残基或其D-型异构体；A代表天然L-型芳香族氨基酸残基或其D-型异构体，如色氨酸残基(W)、酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)等；脚注数字代表氨基酸残基的个数。
具有上述结构的多肽能够与金葡菌毒力刺激因子RAP(Y)特异结合，并抑制其活性。具体表现为，在体外具有上述结构模式的多肽无论是以何种形式如展示在噬菌体上、或体外化学合成、或用基因工程方法重组表达，都能够与RAP(Y)特异结合，并抑制金葡菌中由RAP(Y)调控的RNAIII的表达，动物实验结果表明，具有上述结构模式的多肽能够抑制金葡菌引起的感染。
本发明的小分子多肽可通过现有技术中的化学合成或用基因工程方法重组表达的方法制得。
传统抗生素治疗产生抗药性的原因主要为用药后细菌在生存压力下产生分解抗生素中有效基团的诱导酶。本发明利用特异抑制RAP(Y)活性的多肽建立的治疗金葡菌感染的方案，由于不杀灭细菌而使细菌的致病性丧失，所以不会象传统抗生素治疗那样对细菌产生选择压力而产生抗药株，这就为一直困扰临床的抗药性金葡菌感染这一常见、多发且有致命性的疾病的治疗找到新的出路。
图1为纯化RAP蛋白电泳图谱图2为RAP(Y)活性的检测3为ELISA方法检测GST-C7融合蛋白与RAP(Y)结合情况图4为RAP(Y)结合肽-GST融合蛋白对金葡菌细胞内RNAIII水平的影响本发明对研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽药物具有重要意义，并具有广泛的应用价值及广阔的市场前景，从而实现了本发明的第二个目的。另外，金葡菌毒力刺激因子RAP(Y)结合肽作为生物制剂也有潜在的应用价值，如可用于RAP(Y)的亲和纯化或作为探针用于RAP(Y)的检测等。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1.RAP(Y)的分离纯化将生长至对数晚期(4.7×109细菌/ml)的金葡菌菌液7000×g离心15分钟取上清，煮沸10分钟后离心15分钟，再取上清。用截留分子量10kD的滤膜体积浓缩十倍后，取3ml用分子筛层析方法分离纯化。分离介质为S-300(100ml，2.2×26cm)，缓冲液为50mMTris-Cl，pH＝8.0，收集目标蛋白峰。常规SDS-PAGE聚丙稀酰胺凝胶电泳检测纯度和观察分子量。结果表明所获得的蛋白为单一条带，分子量约为38kD(见附图1，图中1表示RAP蛋白，2表示蛋白标准，3表示牛凝血酶(～36kD)。
实施例2.利用Northern blot检测RAP(Y)活性常规方法提取金葡菌的总RNA，甲醛变性电泳后，通过半干转移将RNA转移到尼龙膜。预杂交60℃，1小时后，加入标记RNAIII特异的DNA探针。60℃，16小时后，洗膜进行放射自显影。在RAP(Y)活性检测中，阳性对照为浓缩10倍的对数生长晚期上清0.5ml(含高浓度RAP(Y))加入4.5ml培养基接种对数生长早期(5×108细菌/ml)金葡菌培养60分钟；样品为5ml培养基加入0.5mg纯化的蛋白接种同样金葡菌培养60分钟；阴性对照为5ml培养基接种同样金葡菌培养60分钟。
1.Northern blot结果表明纯化的蛋白在对数生长早期激活细胞内RNAIII转录，使其水平显著升高(见附图2，图中1表示浓缩上清，2表示纯化RAP(Y)，3表示培养基对照)。表明纯化的38kD蛋白RAP(Y)具有激活金葡菌细胞内RNAIII转录的生物学作用。
实施例3.RAP(Y)结合肽的筛选首先用100μl纯化的RAP(Y)蛋白包被于酶联板，置4℃过夜。经过2％的明胶封闭1h后，加入噬菌体肽库，室温孵育1h，用TBST(50mmol/LTris-HCl，0.1％TWEEN20，pH7.5)洗涤非特异结合的噬菌体，再用0.2mmol/L甘氨酸-HCl pH2.2洗脱特异结合的噬菌体，洗脱液用1mmol/L Tris-HCl pH9.0中和。按照试剂盒提供的方法，测定洗脱液中的噬菌体的滴度，以未包被的靶蛋白的洗脱噬菌体的滴度作为对照，测定投入产出比。同时将洗脱的与RAP结合的噬菌体扩增，并测定其下滴度，用于下一轮的筛选。经过3轮筛选后，测定的投入产出有了明显的提高，产率由第一轮的0.865×10-4％提高到3.846×10-2％，即第三轮时特异与RAP(Y)结合的噬菌体克隆得到了极大的富集。随机挑取18个克隆进行测序。分析后得到具有以下通式结构的多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1。
其中，C代表天然L-型半胱氨酸残基或其D-型异构体，X代表下述四种天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体任意一种，即谷氨酰胺残基(Q)，谷氨酸残基(E)，天冬氨酸残基(D)或天冬酰胺残基(N)，H代表组氨酸残基或其D-型异构体，A代表天然L-型芳香族氨基酸残基或其D-型异构体，如色氨酸残基(W)，酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)等，脚注数字代表氨基酸残基的个数，具有上述结构通式的多肽。
实施例4.RAP(Y)结合肽-GST融合蛋白的基因工程表达及其对金葡菌细胞内RNAIII水平的影响利用分子生物学方法构建GST-环7RAP(Y)结合肽融合蛋白基因表达载体，经测序鉴定正确后，将GST-C7融合蛋白在大肠杆菌中表达，通过ELISA的方法检测，发现分离纯化的GST-C7融合蛋白能与RAP(Y)特异性结合，如附图3。
利用实施例2测活方法发现，GST-C7融合蛋白(0.2mg/ml)能明显抑制金葡菌中RNAIII水平，而GST对照蛋白无此作用(见附图4，图中1表示培养基对照，2表示GST对照，3表示GST-C7融合蛋白)。
权利要求
1.能够与金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白结合，并具有以下结构的环多肽C1-X1-H1-A2-H1-A2-C1式中，C代表天然L-型半胱氨酸残基或其D-型异构体；X代表下述四种天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体任意一种谷氨酰胺残基(Q)、谷氨酸残基(E)、天冬氨酸残基(D)和天冬酰胺残基(N)；H代表L-型组氨酸残基或其D-型异构体；A代表天然L-型芳香族氨基酸残基或其D-型异构体；脚注数字代表氨基酸残基的个数。
2.权利要求1所述的环多肽，其特征在于A代表色氨酸残基(W)、酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)。
3.权利要求1或2所述的环多肽在制备抗金葡菌感染药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一组能够与金葡菌自分泌的RNAIII激活蛋白结合、具有以下结构的环多肽C
文档编号C07K7/06GK1569889SQ0315020
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月21日 优先权日2003年7月21日
发明者邵宁生, 杨光, 柳川, 高亚萍, 董洁, 丁红梅, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 海南通用同盟药业有限公司