专利名称：11,11'－二去氧沃替西林的医学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及11，11’-二去氧沃替西林的医学用途，更具体地说是它的新生血管生成抑制作用及抗肿瘤作用背景技术11，11’-二去氧沃替西林(11，11’-dideoxyverticillin A)为一已知化合物，分子式C30H28N6O4S4。结构式为 11，11′-dideoxyverticillin A该化合物原为从海洋青霉属真菌中获得，文献报道该化合物具有细胞毒作用，体外对HCT-116人结肠癌瘤株的IC50为30ng/ml[B.W.Son，P.R.Jensen，C.A.Kauffman，W.Fenical，New Cytotoxic Epidithiodioxopiperazines Related toVerticillin A from a Marine Isolate of the Fungus Penicillium，Natural ProductLetters，1999，13(3)，213-222]。
中药竹黄在我国南方民间用来治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、坐骨神经痛等。我们从该中药中分得化合物11，11’-二去氧沃替西林，结构经单晶X-衍射及核磁共振、质谱等方法鉴定，波谱数据与文献报道完全一致。
发明内容
我们通过对该化合物进行药理活性筛选，发现该化合物对新生血管生成有明显抑制作用，对小鼠S-180肉瘤及裸鼠A-549人肺癌的生长也有明显抑制作用。
本发明的目的是利用我国中药独特资源获得11，11’-二去氧沃替西林，寻找该化合物新的医学用途，特别是抗肿瘤及新生血管生成抑制作用。
本发明通过如下的药理试验证明化合物11，11’-二去氧沃替西林具有抗肿瘤及新生血管生成抑制作用。
药理药效学实验一.11，11’-沃替西林对新生血管生成的抑制作用实验材料DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；Matrigel购自Becton Dichinson，USA；其它试剂为国产分析纯。
细胞培养 人微血管内皮细胞株(human microvascular endothelial cell line，HMEC-1)；NIH-3T3购自American Type Culture Collection；细胞培养于含15％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2孵箱中培养。待细胞处于对数生长期时进行实验。
1.内皮细胞增殖实验HMEC-1细胞2×103cells/100□l/孔种于96孔板，24小时待细胞贴壁后，加入不同浓度的11，11’-二去氧沃替西林，每个浓度三个复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。加药在37℃、5％CO2条件下培养72小时后，倾去培养液，用10％冷三氯醋酸(TCA)固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的磺酰罗丹明B蛋白染色法(Sulforhodamine，SRB，Sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液(购自Sigma公司)，酶标仪540nm波长下读数。
2.内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶在0℃融化后，迅速加入到96孔板中(60μl/孔)，在37℃静置1小时，使胶凝固。每孔加入HMEC-1细胞悬液5*103cells/100μl/孔。同时分别加入不同浓度11，11’-二去氧沃替西林，使其最终浓度为10μM，2μM，0.4μM，0.08μM，0.016μM。在37℃、5％CO2、95％湿度下培养24小时。在倒置显微镜下观察，随机选三个视野拍照(*100)，每个照片的管腔总长度用图形处理软件Adobe Photoshop 6.0(购自Adobe公司)测量，并计算抑制率。
3.内皮细胞迁移抑制实验1∶3倍稀释的Matrigel胶20□l铺于Transwell膜(8□m孔径Boyden Chambertranswell，Costar，Cambrige，MA)上，25℃让其干燥。将含不同药物浓度(10μM，2μM，0.4μM，0.08μM，0.016μM)的HMEC-1细胞悬液2*104cells/100□l/孔加入到上室，下室加入0.6ml同上室含相同浓度药物的DMEM培养基。37℃、5％CO2、95％湿度下培养48小时。用棉签小心去除膜上未迁移的细胞，将细胞固定，伊红染色。在相差显微镜(Olympus Japan)下观察并拍照(*100)，随机选5个视野计算迁移细胞数，并计算抑制率。
结果1. 11，11’-二去氧沃替西林能明显抑制内皮细胞HMEC-1的增殖，其IC50为0.025□M，作用效果成明显量效关系。
2. 11，11’-二去氧沃替西林在0.016□M仍然明显抑制(＞60％)内皮细胞的管腔形成，作用效果成明显量效关系。
3. 11，11’-二去氧沃替西林在0.016□M仍然明显抑制(＞60％)内皮细胞的迁移。作用效果成明显量效关系。
二.11，11’-二去氧沃替西林体外对多株肿瘤细胞增殖的抑制作用实验材料和方法DMEM购自Gibco公司(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)；磺酰罗单明B(sulforodamine B，SRB)，四氮唑盐(MTT)购自Sigma公司；三氯醋酸(TCA)、醋酸(HAc)和Tris base unbuffer均为国产分析纯。
细胞株P-388小鼠淋巴瘤*HL-60人白血病*MOL-4人白血病*A-549人肺癌SGC-7901人胃癌 MKN-28人胃癌
BEL-7402人肝癌 MCF-7人乳腺癌1.SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(购自Sigma公司)4mg/ml溶液100□l/孔，室温中染色15分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。最后加入150□l/孔的Tris溶液(购自Sigma公司)，酶标仪520nm波长下测定OD值。
2.MTT法按不同肿瘤生长速率，将一定数量处于对数生长期的肿瘤细胞90□l/孔接种于96孔微量培养板内，培养24h后加入药液10□l/孔，对每个细胞株，每个浓度均为三个复孔。另设无细胞调零孔、如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，加MTT(购自Sigma公司)液5mg/ml用生理盐水配制20□l/孔；继续培养4小时后，加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.01mol/lHCl)50□l/孔，于CO2培养箱中过夜。然后在570nm用酶标仪测定OD值。
3.按下列公式计算被测物对癌细胞生长的抑制率，半数抑制量IC50值采用Logit法计算。肿瘤抑制率＝(对照组OD值-治疗组OD值)/对照组OD值×100％结果11，11’-二去氧沃替西林能明显抑制8株不同来源肿瘤细胞的增殖，且作用效果成明显的量效关系。
IC50(nM)细胞株P-388 MOL-4 HL-60 A-549 MKN-28 SGC-7901 BEL-7402 MCF-7浓度(μM) 4.30 20.2 13.9 3.37 25.713.1 34.1 39.6三.11，11’-二去氧沃替西林的休内抗肿瘤作用
1.动物瘤实验方法将处于生长旺盛期的小鼠瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约4.5-5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔注射给药。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤生长抑制率并进行T检验。 2.裸小鼠实验方法取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100-300mm3后(剔除移植瘤过大、过小以及未生长的裸小鼠)将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周2次，每次测量同时还称鼠重。实验组及阳性对照组每周腹腔给药3次，共给药3周，阴性对照组同时给等量生理盐水。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下T/C(%)=TRTVCRTV×100]]>TRTV治疗组RTV；CRTV阴性对照组RTV。
结果11，11’-二去氧沃替西林在1mg/kg剂量时对小鼠S180肉瘤和小鼠肝癌H22有明显的生长抑制作用，抑制率分别为59％和60.7％，对人肺腺癌A-549的最好T/C为50.4％。
本发明的优点是(1)对中药竹黄的利用开辟了新的用途；(2)对肿瘤的治疗有望提供新的药物。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但并不限制本发明。
实施例111，11’-二去氧沃替西林对小鼠S-180肉瘤的实验治疗作用实验材料(1).动物KM小鼠18-22g，雌性。由中科院上海动物中心提供。
合格证编号中科第005号。
(2).瘤种S-180肉瘤由中科院上海药物研究所提供。
(3).测试物11，11’-二去氧沃替西林。
给药方法及疗程选用18-22克雌性KM小鼠及生长良好的7-11天的S-180瘤种，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约1-2.5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔给药七天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。 实验结果组别 剂量 给药动物数 体重瘤重 抑瘤率P值途径 开始 最后 开始最后x±SD ％NS---- 20 2020.328.1 1.85±0.52 --11，11’-二去氧0.5mg/kg i.p 10 1020.120.4 0.51±0.23 72.4 ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧0.75mg/kg i.p 10 1020.221.6 0.69±0.24 62.7 ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧1mg/kg i.p 10 9 20.125.0 1.08±0.44 41.6 ＜0.01沃替西林5-氟尿嘧啶40mg/kgi.p 10 1020.322.0 0.55±0.34 70.3 ＜0.0111，11’-二去氧沃替西林0.75mg/kg给药5次，1mg/kg给药2次。
合格证编号中科第005号(2).瘤种H22由中科院上海药物研究所提供。
(3).测试物11，11’-二去氧沃替西林。
给药方法及疗程选用18-22克雌性KM小鼠及生长良好的7-11天的H22瘤种，将瘤组织制成细胞悬液，接种于小鼠右侧腋部皮下，约1-2.5×106细胞/只，接种24小时后随机分笼，腹腔给药七天。停药后24小时处死动物，称体重、瘤重，计算各组平均瘤重，按下公式求出肿瘤抑制率并进行T检验。 实验结果组别 剂量给药动物数 体重瘤重 抑瘤率P值途径 开始最后 开始 最后 x±SD ％NS---- 20 2019.9 27.81.97±0.61 --11，11’-二去氧0.5mg/kg i.p 10 1020.0 19.80.44±0.23 77.7 ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧0.75mg/kgi.p 10 1019.7 22.10.64±0.33 67.5 ＜0.01沃替西林11，11’-二去氧1mg/kg i.p 10 1019.9 26.81.11±0.29 43.7 ＜0.01沃替西林5-氟尿嘧啶40mg/kg i.p 10 1019.8 20.70.53±0.27 73.1 ＜0.0111，11’-二去氧沃替西林0.75mg/kg给药5次，1mg/kg给药2次。
权利要求
1.一种如下结构的化合物11，11’-二去氧沃替西林， 其特征在于它在新生血管生成抑制剂药物中应用或在抗肿瘤药物中应用。
2.根据权利要求1所述的化合物11，11’-二去氧沃替西林，其特征在于它在抗实体瘤药物中应用。
全文摘要
本发明提供11，11’－二去氧沃替西林(11，11’－dideoxyverticillin A)的医学新用途，经药理试验，它具有对新生血管生成的抑制作用和抗肿瘤作用，可在抗实体瘤药物中应用或新生血管生成抑制剂中应用。
文档编号A61K35/66GK1429552SQ01145719
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者赵维民, 丁健, 袁盛涛, 施玉花, 童云广, 林莉萍, 唐坚 申请人:中国科学院上海药物研究所