一种金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白,其制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白,其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，具体地说涉及一种金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法及用途。
背景技术：
金葡菌是医院感染中最常见的病原菌，也是社会上大范围感染的主要病原菌。金葡菌感染可引起心内膜炎、骨髓炎、浓毒性关节炎、肺炎和脓肿等疾病。金葡菌也是重要经济动物的主要病原菌。金葡菌对青霉素这样的首选药物产生抗药性后引起的主要问题是，甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌菌株可抵抗大多数临床上应用的抗生素，因此约10-60％的S.aureus是从医院里分离的；尤其令人忧虑的是，MRSA菌株对治疗葡萄球菌感染最为有效的抗生素——万古霉素的敏感性日益降低，这些对万古霉素不敏感的金黄色葡萄球菌菌株的出现使人们产生了金葡菌不能治愈的恐惧感，因此必须寻找到一种有效的治疗方法。
除了真核细胞外，各种病原性细菌也是通过细胞表面的细胞外结合基质(extracellular-matrix，ECM)结合分子与宿主的ECM发生特定的相互作用。病原性细菌的ECM结合分子属一组蛋白，被称为黏附素或是能够识别黏附基质的细胞表面组分(MSCRAMMs)；它们与ECM的相互作用被认为是细菌感染的先决条件(1.Juliano RL，Haskill S.Signal transduction from theextracellular matrix.J Cell Biol.1993，120(3)，577-85.2.Yamada KM.Adhesiverecognition sequences.J Biol Chem.1991，266(20)，12809-12.)，否则细菌就无法定居和繁殖，也不能产生和释放胞外酶和外毒素。黏附虽非直接导致组织受损，但对组织的选择和疾病的严重程度却有重要的影响。金葡菌的黏附素除介导细菌黏附外，还赋予细菌逃避宿主防御机制的功能。这主要是通过这些黏附素，将机体的可溶性ECM(如纤维粘连素、血纤维蛋白)大量结合在细菌的表面，使细菌菌体完全被宿主ECM包被，从而不被宿主的免疫系统所识别，这对金葡菌感染的结果亦有重要影响。这些蛋白的共同特征是均为细菌表面的蛋白成分，具相似的结构，不形成菌毛等特殊附件；它们所结合的宿主成分皆为ECM；且金葡菌的细胞外结合基质蛋白与ECM的作用系为蛋白质—蛋白质的相互作用，无碳水化合物参与。为了感染宿主，病菌必须紧紧“贴牢”组织以克服外力对其移动。它们除了应用非特异性的疏水力及静电引力与宿主结合外，其表面蛋白与ECM及血浆蛋白还具有特异的亲合力。这些蛋白通常被称作细胞外结合基质蛋白(ECMBPs)，虽然它们之中的一些结合血浆蛋白而不与基质结构相联系。
金葡菌可表达数种细胞外结合基质蛋白(ECMBPs)，这些蛋白均定位于金葡菌细胞表面，具革兰氏阳性菌表面分子的特征。它们均能识别机体ECM成员，并发生特异性结合，并依此介导金葡菌黏附于宿主组织。尽管ECM在正常情况下一般不暴露，但当组织器官被机械作用或化学物质损伤后，ECM暴露出来，则金葡菌黏附其上，并导致感染。此外，在不同动物中，ECM的结构相当保守，故金葡菌能黏附于不同动物的各种组织，而无明显的宿主特异性及组织倾向性。
S.aureus的分离物一个基本的特征是纤连蛋白的结合特性。许多菌株表达两种相关的纤连蛋白结合蛋白，FnBPA及FnBPB；二者是由两个相近的基因编码的(Greene C，McDevitt D，Francois P，Adhesion properties of mutants ofStaphylococcus aureus defective in fibronectin-binding proteins and studies on theexpression of fnb genes.Mol Microbiol.1995，17(6)，1143-52.)。通过同源突变体及重组的蛋白片段表明，这些蛋白介导细菌黏附到体内的纤连蛋白及介导S.aureus的细胞壁黏附到血浆凝块及做为体外的生物材料去黏附宿主。因此，对于感染初期来说它们是重要的因素。胶原蛋白结合蛋白Cna介导细菌黏附到胶原蛋白及成胶(collagenous)的组织。Cna的存在对于S.aureus细胞在体外黏附于软骨是足够的，也是必需的，抗Cna的抗体抑制细菌与胶原蛋白的结合及阻止细菌黏附于软骨。
最近的葡萄球菌病的动物实验研究表明，基于葡萄球菌细胞外基质结合蛋白的重组蛋白疫苗对机体更具保护作用(1.rennermalm A，Li YH，BohaufsL，et al.Antibodies against a truncated Staphylococcus aureus fibronectin-bindingproteins protect against dissemination of infection in therat.Vaccine，2001，19(25-26)3376.2.Lee JC.Development of anti-Staphylococcalvaccines.Curr.Infect.Dis.2001，3(6)517-524.)。
但是，但目前为止，尚未见到纤连蛋白结合蛋白FnBP与胶原蛋白结合蛋白Cna的融合蛋白的报道。

发明内容
本发明公开了一种融合蛋白，该融合蛋白为金黄色葡萄球菌表面蛋白胶原蛋白结合can与纤连蛋白结合蛋白fnb的融合蛋白。
本发明还公开了金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤首先是制备金黄色葡萄球菌表面蛋白cna和fnb的编码基因，制备方法可以通过PCR方法，以金黄色葡萄球菌为模板扩增获得；然后以制备的cna和fnb的编码基因为模板，通过重叠引物延伸PCR技术扩增，将fnb和cna基因连接起来，获得金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的编码基因，将该基因克隆进表达载体进行金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的表达。表达方式可以选用融合表达或非融合表达，优选融合表达方式。
所用的表达载体可以是原核表达载体或真核表达载体，优选pET-32a(+)表达载体，将金黄色葡萄球菌表面蛋白fnb和can编码基因通过重叠引物PCR法连接起来，置于与载体pET-32a(+)表达的硫氧还蛋白(Thioredoxin protein，Trx)之后，以融合蛋白的形式获得可溶性高水平表达。
表达后的融合蛋白进行纯化，纯化方法可以采用亲和层析，优选采用金属螯和介质亲和层析。
实验结果显示获得了金黄色葡萄球菌表面蛋白can-fnb基因在大肠杆菌中的融合表达蛋白。
本发明还公开了金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
将纯化后的融合蛋白进行蛋白免疫效应试验研究。首先制备金葡菌表面蛋白的融合蛋白疫苗，免疫动物，然后进行动物的体液免疫功能的测定、脾淋巴细胞增殖实验、抗体介导的调理吞噬作用和免疫保护实验。试验结果表明本发明的融合蛋白较好地保持了其天然结构，具有较高的免疫原性。
本发明的融合蛋白可以增强金黄色葡萄球菌表面蛋白fnb和cna编码基因的表达功能，提高免疫原性，提高疫苗保护范围，在新型疫苗的研究中具有重要的价值。到目前为止，本发明的融合蛋白在国内外尚未见到相关报道。


图1为fnb、cna基因PCR扩增图谱。其中1fnb基因(345bp)PCR扩增条带；2cna基因(1509bp)PCR扩增条带；M为DNA marker DL2000，大小从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp.
图2为fnb-T、cna-T重组质粒酶切图谱，其中1pET-32a(+)；2pET-32a(+)(BamH I和Xhol I双酶切)；MDNA marker DL2000；3cna-T质粒(BamH I和Xhol I双酶切)；4fnb-T质粒(BamH I和Hind III双酶切)。
图3为表达质粒trx-fnb-pET-32a(+)双酶切鉴定图谱，其中MDNA marker DL2000，1pET-32a(+)；2质粒trx-fnb-pET-32a(+)(BamH I/Hind III)；3质粒trx-fnb-pET-32a(+)(Nde I/Hind III)图4为表达质粒trx-cna-pET-32a(+)双酶切鉴定图谱，其中MDNA marker DL2000，1cna基因，2trx-cna-pET-32a(+)双酶切鉴定，3质粒trx-cna-pET-32a(+)图5为trx-fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE图谱，其中1pET-32a(+)诱导表达结果；2trx-fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达的全菌SDS-PAGE；3trx-fnb-pET-32a(+)重组菌诱导表达的全菌超声破碎后上清；4trx-fnb-pET-32a(+)重组菌诱导表达的全菌超声破碎后沉淀；M标准分子量蛋白，大小依次为97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da。
图6为trx-fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE薄层扫描分析，图中峰10为目的蛋白峰。
图7为trx-cna-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE分析，其中1trx-cna-pET-32a(+)重组菌诱导表达的全菌超声破碎后沉淀；2trx-cna-pET-32a(+)重组菌诱导表达的全菌超声破碎后上清；3trx-fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达的全菌SDS-PAGE；4；pET-32a(+)诱导表达的全菌超声破碎后上清；5pET-32a(+)诱导表达结果；M标准分子量蛋白，大小依次为97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da。
图8为trx-cna-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE薄层扫描分析，图中峰3为目的蛋白峰。
图9为Trx-FnBP蛋白纯化的SDS-PAGE图10为Trx-cna蛋白纯化的SDS-PAGE图11为Cna蛋白纯化的SDS-PAGE图12为Cna蛋白纯化的FPLC色谱13为PCR扩增结果，其中1Cna+fnb基因；2fnb基因；3cna基因；M为DNA marker DL2000，大小从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
图14为Cna+fnb-T质粒的酶切鉴定图谱，其中MDNA marker DL2000；1pET-32a(+)质粒；2pET-32a(+)质粒BamHI和Xhol I双酶切；3Cna+fnb-T质粒BamH I和Xhol I双酶切；4Cna+fnb-T质粒。
图15为Cna+fnb-pET-32a(+)质粒的酶切鉴定图谱，其中1Cna+fnb-pET-32a(+)质粒(BamH I和Xhol I双酶切)；M为DNA markerDL2000；2pET-32a(+)质粒；3Cna+fnb-pET-32a(+)质粒。
图16为Cna-fnBP蛋白的表达SDS-PAGE分析，其中M标准分子量蛋白，大小依次为97000Da，66000Da，45000Da，30000Da，20100Da，14000Da；1重组菌诱导表达的全菌超声破碎后沉淀；2重组菌诱导表达的全菌超声破碎后上清；3重组菌IPTG诱导表达的全菌；4pET-32a(+)诱导表达的全菌超声破碎后上清；5pET-32a(+)诱导表达结果。
图17为Cna+fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE薄层扫描分析，图中峰3为目的蛋白峰。
图18为Cna-fnBP蛋白纯化的FPLC色谱19为Cna-fnBP蛋白纯化的SDS-PAGE图20为小鼠免疫后第2周效价测定结果(n＝8，包被Trx-FnBP蛋白)图21为小鼠免疫后第2周效价测定结果(n＝8，包被Trx-Cna蛋白)图22为小鼠免疫后第4周效价测定结果(n＝8，包被Trx-FnBP蛋白)图23为小鼠免疫后第4周效价测定结果(n＝8，包被Trx-Cna蛋白)图24为FN组小鼠免疫后第6周效价测定结果(包被Trx-FnBP蛋白)图25为CN组小鼠免疫后第6周效价测定结果(包被Trx-Cna蛋白)图26.1为CN-FN group小鼠免疫后第6周效价测定结果(包被Trx-FnBP蛋白)图26.2为CN-FN group小鼠免疫后第6周效价测定结果(包被Trx-Cna蛋白)图27为各免疫组小鼠各次免疫后抗体滴度变化图28为Fn组小鼠脾淋巴细胞增殖变化图29为CN组小鼠脾淋巴细胞增殖变化图30为CN-FN组小鼠脾淋巴细胞增殖图31为各组小鼠NBT test结果图32Western Blot结果，其中左为Trx-Cna蛋白；右为Cna-fnBP蛋白图33Western Blot结果，其中左为Cna蛋白；右为FnBP蛋白具体实施方式
实施例一金黄色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb基因在大肠杆菌中的克隆表达、纯化一、材料1、菌株金黄色葡萄球菌(S.aureus)FRI1169为国际标准株，市购。
2、载体与宿主菌克隆载体PMD 18-T Vector为Takara公司产品、表达载体pET-32a(+)Vecter为Novagen产品，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)为Stratagene产品。
3、培养基LB培养基，按常规方法配制。
4、工具酶内切酶BamH I，Nde I，Hind III，Xho I；连接酶Ligation SolusionI均为Takara公司产品。
5、主要试剂及试剂盒PCR试剂购自上海Sangon，X-gal，IPTG，DNAMarker DL2000为Takara公司产品，眯唑为QIAGEN产品，十二烷基硫酸钠(SDS)为SIGMA产品，丙烯酰胺，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺，低分子量标准蛋白为Amersham Biosciences产品，Wizard Plus SV Minipreps DNAPurification System为Promega公司产品，DNA片段玻璃奶回收试剂盒为北京博大科技产品。其他试剂均为分析纯，市购。
6、常用缓冲液TE，TAE，5*Tris-甘氨酸缓冲液，PBS，6×DNA加样缓冲液，SDS-PAGE凝胶染液，SDS-PAGE凝胶脱色液，Lysis Buffer，WashBuffer，Elution Buffer，蛋白转移缓冲液，Wester blotting溶液等均按照文献(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著.黄培堂等译.分子克隆实验指南[M].北京科学出版社.)配制。
7、仪器(1)PCR仪GeneAmp PCR System 2400，PERKIN ELMER(2)高速低温离心机AllegraTM 21R Centrifμge，BECKMANCOMLTER(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳仪为BIORAD产品(4)酶联免疫吸附仪SPECTRA MAX PLUS，软件为MR4 PLUSELISA-FLEXTM(5)蛋白纯化分析仪AKTA FPLC，Amersham Pharmacia Biotech(6)低温冻干机FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR(7)ST-1型半干式转移电泳槽，大连竞迈生物科技公司二、方法1、引物的设计与合成根据NCBI已发表的S.aureus的编码基因序列，使用DNAClub软件辅助分别设计了fnb，cna gene引物，由上海博亚生物技术公司合成。引物序列为fnb up5’-GCGGATCCCATATGGGCCAAAATAGCGGTAAC-3’fnb down5’-GCAAGCTTTAAGCTTACTTTTGGAAGTGT-3’cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3’cna down5’-GCCTCGAGTTAGATTGGTTTTTCAGTATTAG-3’其中GGATCC为BanH I酶切位点，CATATG为Nde I酶切位点，AAGCTT为Hind III酶切位点，CTCGAG为Xhol I酶切位点。
2、PCR模板DNA的获取用接种环刮取S.aureus菌落于100μl生理盐水中，沸水中煮10min，再冰浴5min，如此反复几次，该液可作为PCR模板使用。
3、PCR扩增目的基因扩增条件为98℃预变性10min。94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。
4、cna/fnb重组克隆质粒的构建及鉴定(1)cna/fnb PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(180v，6min)。
(2)使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收目的DNA片段。
(3)回收的cna/fnb PCR产物连接克隆载体PMD 18-T Vector，连接条件为16℃，1-2hr。
(4)感受态细胞的制备采用CaCl2法。
(5)连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。
(6)重组子的筛选(α-互补)和鉴定挑取平板上生长的白色菌落进行PCR鉴定，PCR条件为98℃预变性10min。94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸45s，25个循环。72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。
接种经PCR鉴定为阳性的菌落于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃水浴摇床培养过夜，按WizardPlus SV Minipreps DNA PurificationSystem试剂盒方法提取质粒。重组质粒命名为fnb-T，cna-T。
(7)重组质粒的双酶切鉴定对fnb-T质粒用Nde I和Hind III以及BamHI和Hind III进行双酶切鉴定。对cna-T质粒用Nde I和Xhol I以及BamH I和Xhol I进行双酶切鉴定。酶切条件37℃ 3-4hr。1％琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物。
(8)测序挑选PCR、酶切鉴定结果为阳性的重组菌，提取并纯化质粒测序。测序引物为M13 primers，由上海博亚生物技术公司测序。
5、重组表达质粒fnb-pET-32a(+)，cna-pET-32a(+)的构建(1)上述酶切的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳分离后，使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒进行回收。同时对表达载体pET-32a(+)进行相应位点的双酶切。各酶切体系在37℃恒温水浴锅内反应3-4hr。1％琼脂糖凝胶电泳检查酶切产物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒进行回收。
(2)连接将酶切好的fnb-T质粒和cna-T质粒与酶切好的相应的表达载体pET-32a(+)连接，16℃ 1-2hr。
(3)转化取5μl连接产物转入200u E.coli BL21(DE3)感受态。取200μl涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板。
(4)重组子的筛选和鉴定逐一挑取平板上生长的菌落作为模板进行PCR鉴定。接种PCR鉴定为阳性的菌落于LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃摇床培养过夜，按WizardPlus SV Minipreps DNA Purification System试剂盒方法提取质粒。分别进行相应的双酶切鉴定。
6、重组菌的诱导表达将重组菌落接种于5ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃摇床培养至对数生长前期(OD值约为0.6)，加入1mol/l IPTG诱导3-4hr。取适量菌液离心集菌后进行SDS-PAGE分析表达情况。fnb基因表达的蛋白命名为纤维粘连蛋白FnBP(fibronectin-binding protein)，cna基因表达的蛋白命名为胶原结合蛋白Cna(collagen-binding protein)。
表达的蛋白均在破碎上清中，这就使蛋白纯化较为简便，进行大量培养，准备纯化。
7、SDS-PAGE蛋白电泳取培养好的菌液1.5mL，以8000rpm室温离心5分钟集菌，弃上清，200μl纯水悬起沉淀，取25μl悬浮液加入25μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10分钟，取20μl进行SDS-PAGE分析。电压180V，约1-2hr。
进行染色、脱色。对凝胶染色30分钟后，脱色1小时后进行分析。
8、表达蛋白的纯化-Ni-NTA亲和层析。
(1)新Ni柱的预处理①用至少1倍柱体积的去离子水洗柱；②用2倍体积的100mM NiSO4洗柱；③用2倍柱体积的去离子水洗柱；(2)纯化过程①用5倍柱体积的Lysis buffer平衡柱子，流速2mL/min；②将所集菌用Lysis buffer悬起，超声破碎(超声破碎30次，声20s，间隔10s)后，4℃，8000，离心15，收集上清；将上清用Lysis buffer进一步稀释后，分3-5次上样，并收集穿透液；③使用5-10倍柱体积的Lysis buffer洗柱，收集洗液；④使用5-10倍柱体积的Wash buffer洗柱，收集洗液；⑤使用5-10倍柱体积的Elution buffer洗脱蛋白，每2mL收集1管，做好标记；⑥将所收集样品使用SDS-PAGE检测。
(3)纯化完后，依次用15L 0.2M乙酸，15mL 30％甘油，15mL纯水，15mL30％乙醇处理。最后用乙醇3保存于备用。
9、蛋白定量(1)BCA法蛋白定量使用PIERCE公司的BCATMProtein Assay Kit操作。
(2)双波长法样品稀释后，测280nm和260nm的OD值。代入公式(1.55×OD280-0.75×OD260)*稀释倍数10、纯化后的蛋白使用低温冻干机FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR冻干制成成品，动物实验备用。
三、结果1、金葡球菌表面蛋白cna，fnb基因在大肠杆菌中的克隆表达、纯化结果(1)目的基因的扩增提取S.aureus的染色体DNA作为模板进行PCR扩增，扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳。fnb基因360bp处有一致密斑；cna基因在1500bp左右有一致密斑。二者与预期结果一致(图1)。
(2)fnb-T质粒，cna-T质粒的构建琼脂糖凝胶电泳回收(玻璃奶回收)fnb、cna基因片段，与克隆载体PMD18-T Vector连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含X-gal和IPTG的LB平板(含氨卞)。37℃培养过夜后，挑取白色菌落作为模板进行PCR鉴定。为阳性的菌落提取fnb-T质粒后用BamH I和Hind III进行双酶切；cna-T质粒用BamH I和Xhol I进行双酶切。行1％琼脂糖凝胶电泳(图2)。
3、序列测定挑选cna-T其中一个经鉴定为阳性的重组菌落，提取质粒，纯化后以通用引物M13primers进行DNA测序。将测序结果合并，得出cna基因的序列。cna基因全长1509bp，编码503个氨基酸。将测序结果提交NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性检索(advanced BLAST)分析，断定获得了cna基因。
挑选fnb-T其中一个经鉴定为阳性的重组菌落，提取质粒，纯化后以通用引物M13 primers进行DNA测序。fnb基因全长345bp，编码115个氨基酸。将测序结果提交NCBI进行同源性检索(advanced BLAST)分析，断定获得了fnbB基因。
4、表达质粒trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的构建分别用Nde I，Hind III及BamH I，Hind III双酶切pET-32a(+)和fnb-T质粒后。酶切产物连接后，转化E.coli BL21(DE3)感受态。过夜培养后，挑取平板上生长的菌落，进行PCR鉴定。分别挑取阳性结果提取质粒(trx-fnb-pET-32a(+)质粒)，进行相应位点的双酶切鉴定(图3)。
分别用Nde I，Xhol I及BamH I，Xhol I双酶切pET-32a(+)和cna-T质粒后。酶切产物连接后，转化E.coli BL21(DE3)感受态。过夜培养后，挑取平板上生长的菌落，进行PCR鉴定。分别挑取阳性结果提取质粒(trx-cna-pET-32a(+)质粒)，进行相应位点的双酶切鉴定(图4)。
5、重组trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的表达接种含trx-fnb-pET-32a(+)，trx-cna-pET-32a(+)的工程菌于LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃摇床培养至对数生长期后加入1mol/lIPTG诱导3-4hr。取1ml培养液行SDS-PAGE蛋白电泳，结果显示用BamH I，Hind III双酶切的trx-fnb-pET-32a(+)重组菌出现一条新增的蛋白带，而诱导后的pET-32a(+)载体菌则无此蛋白带产生(图5)。经诱导表达的全菌超声破碎后离心，分离上清、沉淀后SDS-PAGE蛋白电泳显示，目的蛋白主要以可溶形式分泌表达。
trx-fnb-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE分析结果显示，重组菌获得高的蛋白表达量，经薄层扫描分析可知目的蛋白的表达量占全菌蛋白总量的52.8％(图6)。
用BamH I、Xho I双酶切的trx-cna-pET-32a(+)重组菌在分子量约处出现一条新增的蛋白带，而诱导后的pET-32a(+)载体菌则无此蛋白带产生(图7)。
trx-cna-pET-32a(+)重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE分析结果显示，重组菌获得高的蛋白表达量，经薄层扫描分析可知目的蛋白的表达量占全菌蛋白总量的58.8％(图8)。
6、蛋白纯化结果
Trx-FnBP蛋白和Trx-cna蛋白使用蛋白纯化分析仪KTA FPLC。进行Ni-NTA亲和层析(HiTrap Chelating HP)。使用Lysis Buffer(50mMNaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH调pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCL，20mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)和Elution Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)做线形洗脱，收集蛋白峰，进行SDS-PAGE分析纯化效果(图9，10)。
cna蛋白使用蛋白纯化分析仪KTA FPLC，进行离子交换层析(QSepharose HP)。缓冲液为，A5mM Tris-Hcl，pH8.4；B5mMTris-Hcl，5M的Nacl.以5ml/s的流速做线形洗脱，收集蛋白峰，进行SDS-PAGE分析纯化效果(图11，12)。
7、纯化蛋白的定量经纯化的蛋白BCA法蛋白定量(使用PIERCE公司的BCATMProtein AssayKit)结果为Trx-FnBP蛋白可达1.25mg/ml和Trx-cna蛋白可达2mg/ml。
实施例二 金黄色葡萄球菌表面蛋白cna-fnb基因在大肠杆菌中的融合表达一、材料1、目的基因含cna，fnb基因的fnb-T质粒，cna-T质粒。
2、载体与宿主菌克隆载体PMD 18-TVector(为Takara公司产品)、表达载体pET-32a(+)Vecter(为Novagen产品)，大肠杆菌DH5α为本室保存，大肠杆菌BL21(DE3)(为Stratagene产品)。
3、引物cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3’4、工具酶内切酶BamH I，Nde I，Xhol I；连接酶Ligation Solusion I均为Takara公司产品。
5、缓冲液及PCR试剂同实施例一。
二、方法1、引物的设计与合成根据NCBI已发表的S.aureus的cna，fnb编码基因序列，使用DNAClub软件辅助分别设计了三条引物，由上海博亚生物技术公司合成。引物序列为cna up5’-GCGGATCCCATATGGCACGAGATATTTCATCA-3zh15’-GATTGGTTTTTCAGTATTAG-3’zh25’-CTAATACTGAAAAACCAATCGGCCAAAATAGCGGTAAC-3’zh35’-GCCTCGAGTTAGCTTACTTTTGGAAGTGT-3’其中GGATCC为BamH I酶切位点，CATATG为Nde I酶切位点。zh1和zh2中的黑体部分为反向互补序列，用于将cna，fnb基因连接起来。
2、重叠引物延伸PCR(1)以S.aureus J72为模板，以cna up和zh1为引物PCR法获得cna基因片段。PCR反应条件为98℃预变性10min。94℃变性60s，45℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环。72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收DNA目的片段。
(2)以S.aureus J72为模板，以zh2和zh3为引物PCR法获得fnb基因片段。PCR反应条件为98℃预变性10min。94℃变性60s，45℃退火60s，72℃延伸60s，30个循环。72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收DNA目的片段。
(3)以上述两轮PCR的回收产物为模板，以cna up和zh3为引物扩增cna+fnb长基因片段。PCR反应条件为98℃预变性5min。94℃变性45s，45℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环。72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。使用北京博大公司DNA片段玻璃奶回收试剂盒回收DNA目的片段。至此所的产物为cna+fnb长基因片段。
3、回收的cna+fnb PCR产物连接克隆载体PMD 18-T Vector，连接条件16℃ 1-2hr。
4、转化与筛选、鉴定连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞。重组菌经α-互补筛选和PCR鉴定为阳性的提取质粒、酶切鉴定后交上海博亚生物技术公司测序。
5、酶切经测序为正确的序列的重组质粒和表达载体pET-32a(+)Vecter分别用BamH I，Xhol I和Nde I，Xhol I两次双酶切。体系同实施例一。
6、连接酶切的基因片段和相应位点酶切的pET-32a(+)Vecter在16℃，LigationSolusion I(Takara公司)作用下连接2-3hr。体系同第一部分。
7、转化与筛选、鉴定连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态。重组菌经PCR、酶切鉴定为阳性的提取质粒、15％甘油保菌。
8、诱导表达将重组菌落接种于5ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃摇床培养至对数生长前期(OD值约为0.6)，加入1mol/l IPTG诱导3-4hr。取适量菌液离心集菌后进行SDS-PAGE分析表达情况。Cna和fnb基因融合表达的蛋白命名为Cna-fnBP(Cna-fnb binding protein)。
9、蛋白纯化大量诱导重组菌后，以4℃、6000rpm离心15分钟集菌。用PBS悬起沉淀，超声破碎仪(300W，30s，30次)破碎菌体，4℃、6000rpm、15分钟离心分离上清和沉淀，SDS-PAGE蛋白电泳分析可见，目的蛋白主要以可溶形式分泌表达在上清中。
取分离的上清注射器上样后(Chelatine Sepharose High performance金属螯和介质亲和预装柱；HiTrap Chelating，Amersham)，使用蛋白纯化分析仪KTAFPLC(Amersham Pharmacia Biotech)。
使用Lysis Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH调pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCL，20mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)和Elution Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)做线形洗脱，收集蛋白峰，进行SDS-PAGE分析纯化效果。
10、纯化后的蛋白BCA法蛋白定量(同前)。
11、纯化后的蛋白使用低温冻干机FREEZE DRY SYSTEM，LABCONCOR冻干制成成品，动物实验备用。
三、结果1、目的基因的扩增提取S.aureusJ72染色体DNA作为模板，以cna up和zh1为引物进行PCR扩增获得cna基因，以zh2和zh3为引物进行PCR扩增获得fnb基因。扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳，分别在360bp和1500bp处有一致密斑，二者与预期结果一致(图13)。以cna up和zh3为引物，上述PCR产物经回收后作为模板进行PCR扩增获得Cna+fnb基因。
2、Cna+fnb-T质粒的构建琼脂糖凝胶电泳回收(玻璃奶回收)Cna+fnb基因片段，与克隆载体PMD18-T Vector连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含X-gal和IPTG的LB平板(含氨卞)。37℃培养过夜后，挑取白色菌落作为模板进行PCR鉴定。为阳性的菌落提取质粒(Cna+fnb-T质粒)后用BamH I和Xhol I进行双酶切(图14)。结果表明，我们通过重叠引物延伸法成功地把cna基因和fnb基因连在一起，并连接到克隆载体PMD 18-T Vector。
3、序列测定及分析挑选Cna+fnb-T其中一个经鉴定为阳性的重组菌落，提取质粒，纯化后以通用引物M13 primers进行DNA测序。将测序结果合并，得出Cna+fnb基因的序列。Cna+fnb基因全长1854bp，编码618个氨基酸。将测序结果提交NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行同源性检索(advancedBLAST)分析，确定为Can和fnb序列.
4、Cna+fnb-pET-32a(+)质粒的构建分别用Nde I，Hind III及BamH I，Hind III双酶切pET-32a(+)和Cna+fnb-T质粒后。酶切产物连接后，转化E.coli BL21(DE3)感受态。过夜培养后，挑取平板上生长的菌落，进行PCR鉴定。分别挑取阳性结果提取质粒(Cna+fnb-pET-32a(+)质粒)，进行相应位点的双酶切鉴定(图15)。
5、Cna-fnBP蛋白的表达结果接种含Cna+fnb-pET-32a(+)质粒的工程菌于LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃摇床培养至对数生长期后加入1Mol/l IPTG诱导3-4hr。取1ml培养液行SDS-PAGE蛋白电泳，结果显示重组菌在分子量约97 000Da处出现一条新增的蛋白带，而诱导后的pET-32a(+)载体菌则无此蛋白带产生(图16)。经诱导表达的全菌超声破碎后离心，分离上清、沉淀后SDS-PAGE蛋白电泳显示，目的蛋白主要以可溶形式分泌表达。
Cna+fnb-pET-32a(+)质粒的工程重组菌IPTG诱导表达SDS-PAGE分析结果显示，重组菌获得较高的蛋白表达量，经薄层扫描分析可知目的蛋白的表达量占全菌蛋白总量的26.5％(图17，峰3)。
6、Cna-fnBP蛋白的纯化使用蛋白纯化分析仪KTA FPLC。进行Ni-NTA亲和层析(HiTrapChelating HP)。使用Lysis Buffer(50mM NaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，20mM咪唑用NaOH调pH至8.0)平衡柱子后；用Wash Buffer(50mM NaH2PO4，300mMNaCL，20mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)和Elution Buffer(50mMNaH2PO4.2H2O，300mM NaCL，250mM咪唑，用NaOH调pH至8.0)做线形洗脱，收集蛋白峰，进行SDS-PAGE分析纯化效果(图18，19)。
7、Cna-fnBP蛋白的定量结果为2.8mg/ml。
实施例三 Trx-FnBP、Cna、Trx-Cna、TrxCn-fnBP蛋白免疫效应研究一、材料1、重组蛋白Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白为所纯化蛋白透析后的低温冻干制品。
2、免疫佐剂FREUND’S ADJUVANT Complete和FREUND’SADJUVANT Incomplete为SIGMA公司产品。
3、其它试剂MUCIN(Type IICrude；From Porcine Stomach)为SIGMA产品；Ficoll-paque为Pharmacia产品；CellTiter 96RAqueous Non-RadioactiveCell Proliferation Assay为Promega公司试剂盒；Thioglycolate Broth withResazurine为Fluka产品；羊抗小鼠IgG-HRP北京中山生物技术公司产品；ELISA试剂均为分析纯。
4、实验动物5-6周昆明系二级雌性小鼠和Balb/c雌性小鼠均购自军事医学科学院实验动物中心。
二、实验方法1、制备金葡菌蛋白疫苗冻干保存的Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白溶于PBS(0.03mol/l，pH7.2)，浓度为100μg/100μl。各蛋白100μl分别与100μl的FREUND’SADJUVANT Complete和FREUND’S ADJUVANT Incomplete佐剂充分混合乳化后用于动物免疫。
2、小鼠免疫程序及剂量5-6周昆明系雌性小鼠或Balb/c雌性小鼠随机分组。各组免疫三次(0、2、3周)剂量为100μg。第一次采用腹部皮下多位点注射(100μg蛋白/每只。弗氏完全佐剂乳化)；第二次采用腹腔注射(100μg蛋白/每只。弗氏不完全佐剂乳化)；第三次腹腔注射(100μg蛋白溶于PBS)。末次免疫后一周(第四周)采取实验样品。
3、免疫小鼠体液免疫功能的测定各次免疫后(2、3、4周)断尾采取血样，间接ELISA法测定抗体效价(参见朱立平，陈学清主编.免疫学常用实验方法[M].北京人民军医出版社.)。
将1μg的Trx-FnBP，Cna，Trx-Cna，Cna-FnBP蛋白以100μl/孔包被ELISA板，4℃过夜→弃包被液，PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→加入封闭液(PBST稀释的3％BSA)，37℃封闭40min→弃封闭液，PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→分别加入免疫血清(各组小鼠血清自1∶10进行10倍梯度稀释)，按100μl/孔加样，37℃作用1hr→PBST 120μl/孔洗三次，3min/次→加入酶标羊抗小鼠IgG(1∶1000稀释)，37℃作用40min→PBST 120μl/孔洗四次，3min/次→加入A、B液显色4min，加入2N H2SO4终止液→OD450nm测值。
4、免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验(1)脾细胞的制备末次免疫的Balb/c雌性小鼠一周后处死，无菌分离脾脏。脾脏经筛网研磨后，挤出脾细胞，用RPMI-1640细胞培养液洗细胞两次，再调整细胞数为5*106cell/ml。
(2)淋巴细胞增殖实验(MTS法)(参见朱立平，陈学清主编.免疫学常用实验方法[M].北京人民军医出版社.)96孔细胞板每孔加入100μl细胞液→取各纯化蛋白分别加入各孔中，使终浓度分别为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.65μg/ml(倍比稀释)，每孔100μl，总体积为200μl/孔。置37℃、5％CO2孵箱72hr，并设细胞对照孔→各孔加入20μl显色液(Promega公司CellTiter 96RAqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay试剂盒)，孵育2.5hr→以RPMI-1640+20μl显色液调零，590nm处测OD值。
5、抗体介导的调理吞噬作用中性粒细胞的调理吞噬作用(NBT test)(参见朱立平，陈学清主编.免疫学常用实验方法[M].北京人民军医出版社.)三名健康成人血清，加入5％的肝素防凝血。用3％的含葡聚糖盐溶液，37℃作用30min以沉淀红细胞。用Ficoll-paque(Pharmacia)密度梯度离心分离中性粒细胞，RPMI-1640细胞培养液洗细胞两次，再调整细胞数为5*106cell/ml。经抗体调理的细菌，可以刺激中性粒细胞。产生的超氧化物可以使无色的四作唑氮蓝(NBT)降解成蓝色甲(月赞)产物。
实验步骤为①20μl S.aureus strain S-6(1*109CFU)与30μl免疫血清(倍比稀释1∶2至1∶32)混合，加入96孔细胞板，37℃孵育60min；②100μl新制的中性粒细胞(5*106cell/ml)和50μl 0.1％过滤除菌的NBT液共加入细胞孔，37℃孵育60min；③用50μl的0.5M HCl终止反应；⑤甲(月赞)产物用1200rpm离心10min，小心吸弃细胞孔中液体200μl；再用DMSO 200μl/孔重悬；⑥540nm处测OD值。
6、免疫保护实验5-6周昆明系雌性小鼠，末次免疫后一周进行攻毒实验。S.aureus strain S-6(5*107CFU，5％的MUCIN)(参见文献Ali I.Fattom，Jawad Sarwar，Alberto Ortiz，et al.A Staphylococcus aureus capsular)，1ml/只，腹腔注射后，观察保护率。各组存活小鼠四天后，活杀后取内脏组织(心、肝、脾、肺和肾)做病理切片，行HE染色观察病理变化。
7、Western Blot检测目的蛋白(1)当SDS-PAGE电泳即将结束时，用蒸馏水清洗石墨板；(2)带上手套，切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜。滤纸和膜的大小完全相等或小于凝胶，否则两张滤纸的边缘接触会造成电流短路，达到大大降低转移的效率；(3)把硝酸纤维膜漂浮于一盘去离子水面上，借毛细作用使膜从下往上湿润后，将膜完没于水中，浸泡5分钟以除去滤膜上残留的气泡；(4)在一浅托盘中加入少量转移缓冲液，把6张滤纸浸没于其中；(5)安装转移电泳槽平放石墨电极的底座，此石墨板为阳极；在石墨板上放置3张经转移液浸泡过的滤纸，对齐后用一玻璃移液管在滤纸上面滚动，以排除残留气泡；把硝酸纤维素滤膜放在滤纸堆上，要保证精确对齐，避免在滤纸与硝酸纤维素滤膜之间有气泡；从电泳槽中取出SDS-PAGE凝胶，把凝胶转移到一盘去离子水中略为漂洗一下，然后准确平放于硝酸纤维素滤膜上，把凝胶左下脚至于硝酸纤维素滤膜的标记角上，带手套排除所有气泡；把另一组的3张滤纸放在凝胶上方，同样须确保各层精确堆齐并避免气泡；将转移电泳槽上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上，连接电源，注意正负极，根据凝胶面积0.65-1.0mA/cm2接通电流，电转移0.5-2h；断开电源并拔出槽上插头，逐一卸转移装置，取出凝胶进行抗体标记；将转移完的硝酸纤维素膜以3％BSA/B液封闭过夜；弃封闭液，液洗涤3次，间隔5min/次；加入一抗anti-TSST-1(1∶500稀释)，与硝酸纤维素膜室温作用1小时；弃一抗，用洗涤5次，间隔5min/次；加入羊抗兔抗体(1∶1000稀释)，室温作用30分钟；弃二抗，用洗涤5次，间隔5min/次；将3mg DAB加于5mLA+10μl H2O2，然后与硝酸纤维素膜充分反应；以蒸馏水终止反应，显色观察。
三、结果1、免疫Balb/c雌性小鼠血清抗体滴度变化5-6周Balb/c雌性小鼠，随机分为四组(FN组、trx-CN组、CN+FN组和对照组)，每组8只。给药情况FN组，Trx-FnBP蛋白；trx-CN组，Trx-Cna蛋白；CN+FN组，Trx-FnBP蛋白和Trx-Can蛋白各100μg/次；对照组，100μl PBS/次。各次免疫后(第2、3、4周)断尾取血(各只小鼠血清混合)进行ELISA测抗体效价。
(1)免疫小鼠第一次免疫后(第2周)血清抗体滴度测定(2003-4-14)见图20，21(2)免疫小鼠第二次加强免疫后(第4周)血清抗体滴度测定(2003-4-28)见图22，23(3)免疫小鼠第三次免疫后(第6周)血清抗体滴度测定(2003-5-15)见图24-27。
2、免疫小鼠脾淋巴细胞增殖实验表1 Fn组小鼠脾淋巴细胞增殖情况

成对t检验P＝0.000249，表明用抗原FnBP分别刺激Fn组、Control组的脾淋巴细胞，二者增殖具有显著性差异(P＜0.001)图28表2 CN组小鼠脾淋巴细胞增殖情况

图29表3 CN-FN组小鼠脾淋巴细胞增殖情况

图303、中性粒细胞的调理吞噬作用健康三名成人血清，加入5％的肝素防凝血。用3％的含葡聚糖盐溶液，37℃作用30min以沉淀红细胞。用Ficoll-paque(Pharmacia)密度梯度离心分离中性粒细胞，RPMI-1640细胞培养液洗细胞两次，再调整细胞数为5*106cell/ml。经抗体(抗血清)调理的细菌，可以刺激中性粒细胞。产生的超氧化物可以使无色的四作唑氮蓝(NBT)降解成蓝色甲(月赞)产物。
图314、免疫保护实验表4 免疫保护实验的有关参数

各组小鼠攻毒后，其存活率明显高于对照组，初步表明我们所获蛋白具有较好的保护效果。不过，由于样本数少，还需增加样本数目进一步证实其效果。
5、Western Blot分析Trx-Cna、Trx-FnBP、Cna和融合Trx的Cna-fnBP蛋白经SDS-PAGE分离后，进行膜转印，进行抗原抗体结合反应。一抗为各组小鼠免疫抗血清。
图32，3权利要求
1.一种金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，其特征在于是由金黄色葡萄球菌表面蛋白cna和fnb融合而成。
2.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)金黄色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb编码基因的制备；(2)金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白编码基因的制备；(3)金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白的表达。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于采用重叠引物延伸PCR技术，将fnb和cna基因连接起来，制备金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白编码基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于表达融合蛋白所用载体为pET-32a(+)。
5.权利要求1所述的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌表面蛋白的融合蛋白，还公开了其制备方法及用途。本发明融合蛋白是由金黄色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb融合而成，其制备方法包括金黄色葡萄球菌表面蛋白cna，fnb编码基因的制备，融合蛋白编码基因的制备，融合基因的表达等步骤。本发明的融合蛋白是可溶性蛋白，保持了天然蛋白的免疫原性。经检测该融合蛋白具有良好的体液免疫和细胞免疫应答的效果，扩大了蛋白疫苗的保护范围，可以防治绝大部分金黄色葡萄球菌引起的感染。
文档编号A61K39/085GK1884299SQ20051007773
公开日2006年12月27日 申请日期2005年6月24日 优先权日2005年6月24日
发明者姜永强, 郑玉玲, 周宏 , 宁保安, 马茹, 江华, 荆红波 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所