专利名称：一种在pet基材表面制备蛋白微图案的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及无机化学、生物化学及有机高分子材料表界面改性技术的领域，特别是涉及ー种在PET(聚对苯ニ甲酸こニ醇酯)基材表面制备蛋白微图案的エ艺。
背景技术：
当前材料领域的研究热点已经从对材料的机械性能等宏观领域的研究上转移到对材料表面微观性能的研究上，材料表面亚微米尺度上表面性质结构的微调控和微加工逐渐成为人们研究的焦点，许多现代技术的发展都来源于新型微观结构的构筑和微型化。在目前的生命科学领域中，可以通过对材料表面改性和实现材料表面微图案化来获取它们与生物分子以及周围环境间相互作用的信息，这对实现医学、エ业与环境中各种分子的检测具有重要意义；此外，微图案化的培养基底上特定区域可用来启动蛋白吸附和细胞贴附，而另外的区域则起到抗蛋白和抑制细胞贴附的作用，从而可以组织并控制细胞在表面上的生长。由此可见，纳微米级蛋白微图案可以实现微区域性质的调控，这使得蛋白微图案在很多领域具有重要应用，例如可用来制作生物芯片、生物传感器、生物医学器件、微电子机械系统以及用于表面生物诊断等[Science 293 (5537)，2001: 2101 2105 ;Nano Lett4(10)，2004:1869 1872]。将生物分子以ー种可以控制的方式选择性的固定于固体材料的表面而仍保持其生物活性是制作微结构生物器件所面临的ー个重大挑战。目前，有关在硬质基材如硅片、玻璃和金表面上制备蛋白图案的报道有很多，但由于此类生物材料的制备成本高，韧性低、透光性差等缺点，使其应用受到很大的限制。因而，人们将目光转向了具有良好的生物相容性、透光性好、韧性高、化学稳定性高、质轻、成本低廉等优点的有机闻分子材料。在材料表面制备蛋白微图案的方法有很多种，例如微接触印刷[Appl. Phys.Lett 63(14), 1993: 2002 2004]、毛细微模塑[Annu Rev Mater Sci 281,998: 153 184]、电子束刻蚀[Sci. Technol. B 16, 1998: 3526 3534]等，但是这些技术都存在自身的不足之处，如过程的控制、选材的特殊要求、保真度、可重复性较差等。所以寻找ー种合适的能够在有机高分子材料表面选择性制备蛋白微图案的エ艺具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提出ー种直接、简便的在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺方法，该PET基材表面的蛋白微图案的制备エ艺简单，制备过程易于控制，成本低廉，蛋白微图案保真性好，并且具有良好的可重复性。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是ー种在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于包括有以下步骤
I)巯基聚こニ醇的吸附
将表面带有金属银微图案的PET基材浸入1(T20 ml浓度为0.01、. I g/ml的SHPEG(巯基聚こニ醇)水溶液中，用手轻摇10 20 min，取出表面带有金属银微图案的PET基材，用蒸馏水超声清洗:Te次，毎次5 10 min，氮气吹干得到吸附了 SHPEG的表面带有金属银微图案的PET基材，保存在真空干燥箱中，备用；
2)FITC (异硫氰酸荧光素)标记BSA (牛血清白蛋白)的吸附
取BSA溶解在NaHCO3缓冲溶液中得到BSA溶液，将5 10 mg的FITC溶解于5 15ml DMSO (无水ニ甲亚砜)中，取120 180 得到的FITC/DMS0溶液逐滴缓缓加入到I 2ml所得的BSA溶液中，边加入边轻微震荡，之后在-4 Iで的环境下反应6 10 h，加入0.00545 0.00595 g NH4Cl使反应结束，之后再在上述溶液中加入0. I 0. 5 ml的丙三醇，震荡5 10 min，以分离出未吸附的FITC，再将溶液超滤，从而得到浓缩的FITC标记的BSA溶液； 将吸附了 SHPEG的表面带有金属银微图案的PET基材放入24孔板中，且金属银微图案一面向上，加入0.15 0. 30 ml FITC标记的BSA溶液，室温下在摇床上轻轻地摇动，吸附2 h，吸出FITC标记的BSA溶液，用0. 15 0. 30 ml的PBS缓冲溶液在摇床上摇动清洗3飞次，毎次10 15 min，即可在PET基材表面制备出蛋白微图案。按上述方案，表面带有金属银微图案的PET基材的制备方法是将光掩膜固定在清洗干净的PET基材表面，置于165 ^195 nm的紫外光灯下，光照时间为1(T20 min，将光照后的PET基材置于镀银溶液中，待PET基材表面出现光亮的镀银层后，取出PET基材，用蒸馏水冲洗3飞次，并用氮气吹干得到表面带有金属银微图案的PET基材，保存在真空干燥器中，备用。按上述方案，镀银溶液的由体积比为1:1的还原剂和氧化剂组成，其中还原剂由葡萄糖(10 20 g/1)和酒石酸钾钠(3 8 g/1)组成，氧化剂为银氨溶液(20 30 g/1)。按上述方案，所述的NaHCO3缓冲溶液的pH为7 9，浓度为5 15 mg/ml。按上述方案，所述的PBS缓冲溶液的配制方法是分别称取15 20 g的NaCl，0. 6 1.0 g的NaH2PO4, 2 5 g的Na2HPO4，溶解在I. 5 2. 5 L去离子水中，即得PBS缓冲溶液。本发明的基本原理是采用高能紫外光对PET基材进行微区域辐射，利用辐射区域与未被辐射区域PET基材表面化学性质的差异实现化学镀银过程中金属银的选择性沉积，将带有金属银微图案的PET基材浸泡在SHPEG水溶液中，镀银区域就吸附上排斥蛋白质的SHPEG，而未镀银区域仍然保留基材本身容易吸附蛋白的性质，则在后续的蛋白吸附过程中，蛋白分子就会吸附在未镀银区域，即在基材表面会形成与镀银微图案互补的蛋白图案。从而在PET基材上制备出蛋白微图案，实现蛋白在PET基材上的的选择性吸附。本发明在表面生物诊断，制作生物传感器和生物医学器件等方面具有十分广泛的用途，且所得的蛋白微图案，也为下ー步进行组织工程的研究奠定了一定的基础。此外，PET基材表面的金属银图案和蛋白图案也可以实现微电子技术与生物传感器的对接，解决了界面生物分子相互作用的信号传输问题。本发明与现有技术的其它方法相比，其有益效果是本发明无需在材料表面接枝单分子膜，因而在蛋白吸附过程中也就不存在因单分子膜接枝密度低或在接枝过程中引入其他杂质、污染物而降低蛋白图案的保真性；其次，本发明中的PET基材上同时具有蛋白微图案与金属银微图案，因为金属银具有导电性，这就很容易实现生物信号和电信号之间的相互转换，为生物器件的制备提供了可能。最后，直接对PET基材表面官能化后，往往会因为高分子链的重排而使表面官能团的稳定性降低，影响后续生物图案化的构筑，通过对PET基材表面金属银微图案化，由于金属银沉积在改性区域，可在PET基材表面形成刚性网络结构，从而阻止高分子链的重排，提高表面功能团的稳定性。
图I是本发明的制备エ艺的示意 图2中，图2a是利用荧光显微镜在自然光下观察到的PET基材表面的镀银微图案，图2b是利用荧光显微镜在495 nm的波长下观察到的PET基材表面的牛血清白蛋白微图案。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进ー步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例I :
如图I所示，ー种在PET基材表面制备牛血清白蛋白微图案的方法，它包括如下步骤 I)金属银微图案的制备
将光掩膜(铜网，线宽约20 Pm)固定在清洗干净的I cmXl cm的PET基材表面，置于165 nm的紫外光灯下，光照时间为10 min。将光照后的基材置于镀银溶液(溶液组成为V(还原剤)V(氧化剂)=1:1，其中还原剂由葡萄糖(12 g/1)和酒石酸钾钠(3 g/1)组成，氧化剂为银氨溶液(21 g/1))中，待基材表面出现光亮的镀银层后，取出基材，用蒸馏水冲洗3次，并用氮气吹干，保存在真空干燥器中，备用。2)巯基聚こニ醇(SHPEG)的吸附
将表面带有金属银微图案的PET基材浸入10 ml浓度为0. 04 g/ml的SHPEG溶液中，用手轻摇10 min。之后,将基材取出，用蒸懼水将片材超声清洗3次,姆次5 min ,将附着在未镀银区域的SHPEG清洗掉，氮气吹干，保存在真空干燥箱中，备用。3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记牛血清白蛋白(BSA)的吸附
将BSA溶解在NaHCO3缓冲溶液中(pH为7)，浓度为5 mg/ml。将5 mg的FITC溶解于5 ml无水ニ甲亚砜(DMSO)中，取120 U I的FITC/DMS0溶液逐滴缓缓加入到I ml上述BSA溶液中，边加入边轻微震荡，之后在-2 V的环境下反应6 h。加入0.00545 g NH4Cl使反应结束，之后再在上述溶液中加入0.2 ml的丙三醇，震荡5 min，以分离出未吸附的FITC，再将溶液超滤(2000 rpm)，从而得到浓缩的FITC标记的BSA溶液(即BSA-FITC溶液)。分别称取15 g的NaCl，0.6 g的NaH2PO4, 2 g的Na2HPO4，溶解在I. 5 L去离子水中，即得PBS缓冲溶液。将吸附了 SHPEG的带有镀银微图案的PET基材放入24孔板中，图案表面向上，カロ入0. 15 ml BSA-FITC溶液，室温下在摇床上轻轻地摇动(40 rpm)使BSA-FITC在PET的未改性区域吸附2 h，吸附完毕，用吸管小心地吸出BSA-FITC溶液，用0. 15 ml的PBS缓冲溶液在摇床上摇动清洗3次，毎次10 min。整个实验过程要在避光条件下进行。通过上述步骤，即可在PET基材表面上制备得到保真性较好的牛血清白蛋白微图案。在图2a中，较暗的方格状区域即为沉积于PET基材表面的金属银，较亮区域则是基材部分。在图2b中，网格区域因为吸附了牛血清蛋白在荧光显微镜下呈现出緑色，而较暗的方格状镀银区域因吸附了排蛋白的SHPEG则不会出现荧光，很显然这两个图案是互补、的，而且图案棱角分明，说明图案的保真性好。实施例2
ー种在PET基材表面制备牛血清蛋白微图案的方法，它包括如下步骤
(I)金属银微图案的制备
将光掩膜(铜网，线宽约20 Pm)固定在清洗干净的I cmXl cm的PET基材表面，置于170 nm的紫外光灯下，光照时间为15 min。将光照后的基材置于镀银溶液(溶液组成为V(还原剤)V(氧化剂)=1:1，其中还原剂由葡萄糖(15 g/1)和酒石酸钾钠(6 g/1)组成，氧化剂为银氨溶液(24 g/1))中，待基材表面出现光亮的镀银层后，取出基材，用蒸馏水冲洗4次，并用氮气吹干，保存在真空干燥器中，备用。 (2)巯基聚こニ醇(SHPEG)的吸附
将表面带有金属银微图案的PET基材浸入15 ml浓度为0. 06 g/ml的SHPEG溶液中，用手轻摇15 min。之后,将基材取出，用蒸懼水将片材超声清洗5次,姆次8 min ,将附着在未镀银区域的SHPEG清洗掉，氮气吹干，保存在真空干燥箱中，备用。(3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记牛血清白蛋白(BSA)的吸附
将BSA溶解在NaHCO3缓冲溶液中(pH为8)，浓度为10 mg/ml。将8 mg的FITC溶解于8 ml无水ニ甲亚砜(DMSO)中，取150 U I的FITC/DMS0溶液逐滴缓缓加入到I. 5 ml上述BSA溶液中，边加入边轻微震荡，之后在0 V的环境下反应8 h。加入0.00565 g NH4Cl使反应结束，之后再在上述溶液中加入0.4 ml的丙三醇，震荡8 min，以分离出未吸附的FITC，再将溶液超滤(2500 rpm)，从而得到浓缩的FITC标记的BSA溶液(即BSA-FITC溶液)。分别称取18 g的NaCl，0.8 g的NaH2PO4, 3 g的Na2HPO4，溶解在2 L去离子水中，即得PBS缓冲溶液。将吸附了 SHPEG的带有镀银微图案的PET基材放入24孔板中，图案表面向上，カロ入0.2 ml BSA-FITC溶液，室温下在摇床上轻轻地摇动(100 rpm)，使BSA-FITC在PET的未改性区域吸附2 .5 h，吸附完毕，用吸管小心地吸出BSA-FITC溶液，用0.25 ml的PBS缓冲溶液在摇床上摇动清洗4次，毎次12 min。整个实验过程要在避光条件下进行。采用本实施例在PET基材表面制备的牛血清白蛋白微图案与实施例I相同。实施例3:
ー种在PET基材表面制备牛血清蛋白微图案的方法，它包括如下步骤
(I)金属银微图案的制备
将光掩膜(铜网，线宽约20 Pm)固定在清洗干净的I cmXl cm的PET基材表面，置于185 nm的紫外光灯下，光照时间为20 min。将光照后的基材置于镀银溶液(溶液组成为V(还原剤)V(氧化剂)=1:1，其中还原剂由葡萄糖(19 g/1)和酒石酸钾钠(8 g/1)组成，氧化剂为银氨溶液(27 g/1))中，待基材表面出现光亮的镀银层后，取出基材，用蒸馏水冲洗5次，并用氮气吹干，保存在真空干燥器中，备用。(2)巯基聚こニ醇(SHPEG)的吸附
将表面带有金属银微图案的PET基材浸入20 ml浓度为0. I g/ml的SHPEG溶液中，用手轻摇20 min。之后,将基材取出，用蒸懼水将片材超声清洗6次,姆次10 min ,将附着在未镀银区域的SHPEG清洗掉，氮气吹干，保存在真空干燥箱中，备用。(3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记牛血清白蛋白(BSA)的吸附将BSA溶解在NaHCO3缓冲溶液中(pH为9 )，浓度为15 mg/ml。将10 mg的FITC溶解于15 ml无水ニ甲亚砜(DMSO)中，取180 的FITC/DMS0溶液逐滴缓缓加入到2 ml上述BSA溶液中，边加入边轻微震荡，之后在6 V的环境下反应9 h。加入0.00595 g NH4Cl使反应结束，之后再在上述溶液中加入0.5 ml的丙三醇，震荡10 min，以分离出未吸附的FITC，再将溶液超滤(3000 rpm)，从而得到浓缩的FITC标记的BSA溶液(即BSA-FITC溶液)。 分别称取20 g的NaCl ,1.0 g的NaH2PO4, 5 g的Na2HPO4,溶解在2. 5 L去离子水中，即得PBS缓冲溶液。将吸附了 SHPEG的带有镀银微图案的PET基材放入24孔板中，图案表面向上，カロ入0. 30 ml BSA-FITC溶液，室温下在摇床上轻轻地摇动(240 rpm)，使BSA-FITC在PET的未改性区域吸附3 h，吸附完毕，用吸管小心地吸出BSA-FITC溶液，用0 . 3 ml的PBS缓冲溶液在摇床上摇动清洗5次，毎次15 min。整个实验过程要在避光条件下进行。采用本实施例在PET基材表面制备的牛血清白蛋白微图案与实施例I相同。
权利要求
1.ー种在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于包括有以下步骤 1)巯基聚こニ醇的吸附 将表面带有金属银微图案的PET基材浸入10 20 ml浓度为0. 01 0. I g/ml的SHPEG溶液中，用手轻摇10 20 min，取出表面带有金属银微图案的PET基材，用蒸馏水超声清洗3 6次，每次5 10 min，氮气吹干得到吸附了 SHPEG的表面带有金属银微图案的PET基材，保存在真空干燥箱中，备用； 2)FITC标记BSA的吸附 取BSA溶解在NaHCO3缓冲溶液中得到BSA溶液，将5 10 mg的FITC溶解于5 15 mlDMSO中，取120 180 u I得到的FITC/DMS0溶液逐滴缓缓加入到I 2 ml所得的BSA溶液中，边加入边轻微震荡，之后在-4 8で的环境下反应6 10 h，加入0.00545 0. 00595 gNH4Cl使反应结束，之后再在上述溶液中加入0. I 0.5 ml的丙三醇，震荡5 10 min，以分离出未吸附的FITC，再将溶液超滤，从而得到浓缩的FITC标记的BSA溶液； 将吸附了 SHPEG的表面带有金属银微图案的PET基材放入24孔板中，且金属银微图案一面向上，加入0.15 0.30 ml FITC标记的BSA溶液，室温下在摇床上轻轻地摇动，吸附2 h，吸出FITC标记的BSA溶液，用0. 15 0. 30 ml的PBS缓冲溶液在摇床上摇动清洗3飞次，毎次10 15 min，即可在PET基材表面制备出蛋白微图案。
2.按权利要求I所述的在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于表面带有金属银微图案的PET基材的制备方法是将光掩膜固定在清洗干净的PET基材表面，置于165 ^195 nm的紫外光灯下，光照时间为1(T20 min，将光照后的PET基材置于镀银溶液中，待PET基材表面出现光亮的镀银层后，取出PET基材，用蒸馏水冲洗3飞次，并用氮气吹干得到表面带有金属银微图案的PET基材，保存在真空干燥器中，备用。
3.按权利要求2所述的在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于镀银溶液的由体积比为1:1的还原剂和氧化剂组成，其中还原剂由葡萄糖和酒石酸钾钠组成，氧化剂为银氨溶液。
4.按权利要求I或3所述的在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于步骤2)所述的NaHCO3缓冲溶液的pH为7 9，浓度为5 15 mg/ml。
5.按权利要求I或3所述的在PET基材表面制备蛋白微图案的エ艺，其特征在于步骤2)所述的PBS缓冲溶液的配制方法是分别称取15 20 g的NaCl，0.6 ^1.0 g的NaH2PO4,2 5 g的Na2HPO4，溶解在I. 5 2. 5 L去离子水中，即得PBS缓冲溶液。
全文摘要
本发明涉及一种在PET基材表面制备蛋白微图案的工艺，首先在PET基材表面制备金属银微图案，将带有金属银微图案的PET基材浸泡在SHPEG水溶液中，镀银区域就吸附上排斥蛋白质的SHPEG，而未镀银区域仍然保留基材具有吸附蛋白质的本性，从而在PET基材上制备出蛋白微图案，控制蛋白质在PET基材表面的选择性吸附。本发明的PET基材表面的蛋白微图案，可用于表面生物诊断，制作生物传感器和生物医学器件等。该PET基材表面的蛋白微图案，也为下一步进行组织工程的研究奠定了一定的基础。同时，该PET基材表面的蛋白微图案的制备工艺简单，制备过程易于控制，成本低廉，蛋白微图案保真性好，并且具有良好的可重复性。
文档编号C08L67/02GK102643446SQ20121011943
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者吴仲岿, 唐红肖, 李少英, 杨军 申请人:武汉理工大学