一种表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种金纳米颗粒阵列及其应用，尤其涉及一种表面亲疏水性质差异化 的球形金纳米颗粒阵列及其应用;属表面功能化修饰的纳米材料及其应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 纳米材料以其独特的物理化学性质如不同的尺寸、形貌、大的比表面积以及不同 的表面化学修饰等特点使它具有广泛的应用。特别是在生物医药领域，普遍应用到疫苗佐 剂、生物成像、纳米载药、纳米传感等方面，但同时纳米材料的广泛应用可能会产生基因毒 性、细胞毒性、组织器官毒性及产生免疫反应等一些负面影响。其中纳米材料的表面化学在 其与生物体相互作用过程中起着重要的作用，而表面修饰配位体的亲疏水性、电荷密度、氢 键性质键密度、空间位阻结构等都是影响其作用的重要因素。
[0003] 免疫系统作为人体的第一道防线，可以阻挡外来物质的入侵，并且敏锐识别外来 物质后做出有效的抵抗措施。树突状细胞是目前认为最主要的专职抗原递呈细胞，是连结 固有性免疫反应和适应性免疫反应的重要桥梁。他们存在于皮肤、肺部以及体腔等有利于 吞噬抗原及呈递抗原的部位。未成熟的抗原递呈细胞有很强的吞噬作用，吞噬抗原后，吞噬 能力丧失，转变成活化的抗原递呈细胞，表现出很强的抗原递呈能力。活化的抗原递呈细胞 的标志是其细胞膜上表达⑶I Ic，组织相容性分子MHCII，以及表达各种共刺激分子⑶40， CD80，CD86等。活化的树突状细胞可以迀移到淋巴结，使T细胞产生特异性反应。活化的树突 状细胞和巨噬细胞可以产生各种细胞因子和化学因子引起免疫反应。目前，金纳米颗粒经 表面化学修饰后的免疫毒性及调节功能尚不明确，采用免疫系统中有重要地位的抗原递呈 细胞(树突状细胞)研究金纳米颗粒的功能化修饰与抗原递呈细胞的免疫效应的关系显得 尤为有价值。
[0004] 经检索，有关表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其对树突状细胞的 免疫调节或其在药物载体以及免疫药物佐剂制备方面的应用还未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有纳米材料表面化学修饰及应用存在的不足，本发明的目的在于提供一种 表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列及其对树突状细胞的免疫调节或其在药物 载体以及免疫药物佐剂制备方面的应用。
[0006] 本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列，是通过调节亲水配位 体和疏水配位体的相对比例，并使所述配位体分子与金纳米颗粒连接后制得；
[0007] 其特征在于：
[0008] 所述阵列中亲水配位体是硫辛酸三聚乙二酰胺，疏水配位体是硫辛酸正九酰胺， 配位体分子通过金硫键共价作用与金纳米颗粒连接依次形成8种平均粒径为5.0 ± 0.2纳米 的金纳米颗粒，分别以 GNP-I、GNP-2、GNP-3、GNP-4、GNP-5、GNP-6、GNP-7、GNP-8表示，该8 种 金纳米颗粒共同组成球形金纳米颗粒阵列;其中GNP-I表面连接有100%单配位体分子硫辛 酸三聚乙二酰胺，GNP-8表面连接有100%单配位体分子硫辛酸正九酰胺，GNP-2、GNP-3、 GNP-4、GNP-5、GNP-6或GNP-7表面连接有双配位体分子硫辛酸三聚乙二酰胺与硫辛酸正九 酰胺，其中硫辛酸三聚乙二酰胺相对硫辛酸正九酰胺的比例GNP-2至GNP-7呈现连续依次降 低变化，但其相对比例之和为100%;所述球形金纳米颗粒阵列表面亲疏水性呈单一变化， 用IogP指数表征亲疏水性的大小，GNP-I至GNP-8依次为：-1.43511，-1.03967，-0.41074，-0 · 19551，0 · 174569，0 · 376064，1 · 241267，1 · 621869，其中 IogP指数越负，表示亲水性越强， IogP指数越正，表示疏水性越强。金纳米颗粒阵列示意图见图1。
[0009] 本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备针对树突状细 胞的免疫调节制剂中的应用。
[0010] 本发明所述表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗粒阵列在制备药物载体以及 免疫药物佐剂中的应用。
[0011] 为了更好地理解本发明的实质和它的应用价值，下面用金纳米颗粒的制备实验及 其表征结果和金纳米颗粒阵列与树突状细胞的相互作用来说明金纳米颗粒在药物载体以 及免疫药物佐剂制备方面的应用。
[0012] 1.金纳米颗粒阵列配位体及金纳米颗粒的制备：
[0013] 选择硫辛酸作为与金纳米颗粒相连的链接分子，另一端选择了三聚乙二胺和正九 胺作为亲疏水性质的调节分子，通过酰胺反应制备硫辛酸三聚乙二酰胺(配体1)和硫辛酸 正九酰胺(配体2)两种配位体。
[0014] 将单配位体(配体1和2)分子或者不同比例的双配位体(硫辛酸三聚乙二酰胺/硫 辛酸正九酰胺)分子溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将氯金酸加到此溶液中并在室温 下搅拌30分钟，再将硼氢化钠的水溶液滴加入其中，在室温下继续搅拌4小时。所得的金纳 米颗粒溶液用离心洗涤的方法进行纯化，即得到表面亲疏水性质差异化的球形金纳米颗 粒。
[0015] 2.金纳米颗粒的形貌分析：
[0016] 将制备的全部球形金纳米颗粒进行透视电子显微镜的观察。在透视电子显微镜下 观察到的金纳米颗粒形貌，结果如图2所示:金纳米颗粒为粒径为5.0纳米左右的球形金纳 米颗粒。
[0017] 3.球形金纳米颗粒阵列的亲疏水性指数Log P的测定：
[0018] 将正辛醇(优级纯）与高纯水等体积混合，搅拌24h，静置分层，分别取两相，保存备 用。上层为水饱和的正辛醇溶液，下层为正辛醇饱和的水溶液。然后取一定量的表面亲疏水 性质不同的球形金纳米颗粒溶液，加入正辛醇饱和的水溶液，超声混匀后，加入等体积的水 饱和的正辛醇溶液。然后置于振摇器，25°C振摇24小时。
[0019] 24小时后分别取两相真空干燥后用王水消解，ICP-MS测定油相(正辛醇层)和水相 中Au的含量，利用公式log P = lg(Co/Cw)计算每种金纳米颗粒的亲疏水性指数log P的值。
[0020] 结果见表1。
[0021] 表1:金纳米阵列的亲疏水性指数Log P的测定结果
[0023] 4.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料的细胞存活率：
[0024] 分离和纯化小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。
[0025] BMDC细胞培养在含胎牛血清、抗生素、丙酮酸钠、HEPES、非必需氨基酸和β-巯基乙 醇的1640培养液中。
[0026] 将BMDC细胞接种在96孔板中，置于37°C，5%⑶2的恒温培养箱中孵育24小时后补 加 IOOyL含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养基，处理24小时后以cell titer 方法检测细胞的存活率(操作步骤参照cell titer说明书），每个实验平行测三次。其中脂 多糖(LPS) 100ng/mL为阳性对照组。
[0027] 结果见图3。
[0028] 5.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料对树突状细胞的 活化影响：
[0029] 将BMDC细胞接种于12孔板中，置于37°C，恒温培养箱中孵育24小时后补 加 ImL含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养液，处理24小时后收集细胞，用 MHCII-FITC和⑶86-FITC两种抗体在4°C条件下标记细胞膜上的蛋白分子，然后用流式细胞 仪检测标记的荧光强度，每个实验平行测三次。其中脂多糖(LPS)100ng/mL为阳性对照组。
[0030] 分析结果见图4,图5(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性，#p<0.001，代表 实验组与对照组有显著性差异）。
[0031] 6.表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列用于研究纳米材料对树突状细胞的 炎症效应：
[0032] 将BMDC细胞接种在96孔板中，置于37°C，5%⑶2的恒温培养箱中孵育24小时后补 加1〇〇此含有本发明所述金纳米颗粒阵列材料的新鲜培养基，处理一定时间后以ELISA方法 检测细胞产生的炎症因子TNF-α和IL-12(操作步骤参照ELISA说明书），每个实验平行测三 次。其中脂多糖(LPS) 100ng/mL为阳性对照组。
[0033] 结果见图6,图7(*p<0.05,代表实验组与对照组有差异性，#p<0.001，代表实验 组与对照组有显著性差异）。
[0034]由以上实验结果可以得出以下结论：
[0035] 根据透射电镜结果，我们可以看出金纳米颗粒的粒径都在5纳米左右(见图2)，同 时我们通过测Logp的数值对纳米材料的亲疏水性进行了表征(见表1)，可以看出，我们成功 制备了表面亲疏水性差异化的金纳米颗粒阵列。
[0036] 本发明制备表面亲疏水性差异化的金纳米颗粒阵列由8种金纳米颗粒组成，这些 纳米颗粒亲疏水性质不同，在与细胞发生相互作用时表现出不同的作用，所以可以得出以 下结论:亲疏水性质影响纳米材料与细胞之间的相互作用，纳米颗粒越疏水对树突状细胞 的活化越明显（图4、图5)，纳米颗粒越疏水对树突状细胞的促炎效果越明显（图6、图7)。由 此可实现研究纳米颗粒与细胞之间的作用机制，还可以指导作为药物载体，药物佐剂等应 用于生物医学领域的设计。
【附图说明】
[0037] 图1:本发明所述表面亲疏水性质差异化的金纳米颗粒阵列示意图。
[0038] 图2:制备的金纳米颗粒粒径表征。其中：
[0039] a:为GNP-I在透射电子显微镜下的图片；其中比例尺为20nm;
[0040] b:为GNP-2在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
[00411 c:为GNP-3在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
[0042] d:为GNP-4在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
[0043] e:为GNP-5在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
[0044] f:为GNP-6在透射电子显微镜下的图片;其中比例尺为20nm;
[0045] g: