双靶向递送化疗药物纳米体系制备方法及其增强抗肿瘤应用
【技术领域】
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[0001]本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种双靶向递送化疗药物纳米体系及其制备方法与在增强抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
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[0002]常规的抗癌治疗着意于直接杀死肿瘤细胞，不可避免地杀死人体正常细胞和破坏免疫系统，从而引发严重的系统毒性。药物的给药方式对药效的发挥起很大的作用，很多药物有一个最适宜的浓度范围，即在这个范围可以产生理想的药效，高于或低于此浓度则影响药效的发挥，甚至产生毒副作用。同时，一些重大疾病治疗的研究进展十分缓慢，这产生了综合运用多种方案来将药物靶向运输到疾病组织的需求。于是，一些控制药物代谢动力学、非特异性毒理学、免疫学、生物识别、药物效能等方面的新想法应运而生，这些新的方案，就是我们常说的的药物运输系统。
[0003]纳米药物运输系统将纳米技术与现代药剂学结合，具有的药物缓控、控释性和靶向性等特点可以大幅度提高药物的生物利用率、降低用药量、减少毒副作用，已成为国际肿瘤药物研制中的热点和前沿。特定位点靶向性的药物输运对调节有效药物剂量和治疗疾病是很重要的，而靶向性药物运输系统具有细胞特异性，可以有效地将载有药物的运输系统运送到靶细胞，通过细胞内吞进入细胞内，有效的杀灭病变细胞，而不伤及其他正常细胞，因此能大幅度提高药物生物利用率、降低药物服用量和对其他器官的毒性。在众多的靶向纳米载体中，应用最多的是主动靶向性纳米载体，主动靶向性纳米载体是指以抗体、配体或磁性为导向的纳米载体，由于其对靶器官或靶细胞具有高度的特异性和选择性，因此近年来得到迅速发展。
[0004]5-氟尿嘧啶是化疗常用抗癌药物之一，它进入细胞后，经过代谢作用，转变成5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，从而抑制脱氧胸苷酸合成酶，进而抑制DNA的合成，最终杀死细胞。5-氟尿嘧啶抗瘤谱广，适用于乳腺癌、胃癌、肝癌等，但体内代谢快，有效期短，与其它化疗药物一样，患者直接应用5-氟尿嘧啶时，副作用较大。由于肿瘤细胞活性增强，周围组织局部温度高于正常组织温度，脉管系统宽渗漏范围等特点。但5-氟尿嘧啶化疗时毒副反应强，病患的化疗反应很痛苦，如何做到5-氟尿嘧啶到达肿瘤部位后能够更快地释放药物，并促使肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的内吞，从而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用是目前急需解决的问题。本发明采用带有正电的PEI与温度敏感的PNIPAM形成纳米凝胶载体，通过PEI的正电荷和化疗药物5-Fu的负电荷相互作用，将5-Fu包裹进凝胶载体内，避免了游离药物在体内对正常组织的毒副作用；另外，肿瘤部位较高的温度和载体表面抗体主动靶向能够显著增强肿瘤细胞对载药纳米凝胶的内吞，纳米载体进入肿瘤组织和细胞后，肿瘤组织独特的微环境作用下可以实现药物在肿瘤部位有效快速的释放，从而有效的杀死肿瘤细胞。
[0005]EGFR广泛分布于哺乳类动物的细胞膜上，基因位于7号染色体P12-14区域，其家族包括 EGFR (ErBl/HERl)、ErbB2 (HER2/neu)、ErbB3 (HER3)、ErbB4 (HER4)等 4 个成员。随着人类医学科学的快速发展生物靶向治疗已经成为目前治疗恶性肿瘤的重要手段，近几年许多分子靶向表皮生长因子受体(EGFR)药物已经广泛应用于临床，以ABX-EGF、頂C-C225(西妥昔单抗cetuximab)、MAB528、MAB225为代表的单抗类药物已经应用于临床肿瘤治疗，在治疗中也取得良好疗效。这些抗Her-1单抗隆抗体包括对胃癌(SGC7901)、人肺癌(H125)、人直肠(DiFi)、表皮细胞癌(A431)以及食管鳞癌的治疗等。
[0006]中国专利申请CN201210048338.5，发明名称为“一种纳米复合温敏凝胶剂及其制备方法和应用”，申请公布号为CN102525882A，其实施例1公开了一种包载5-氟尿嘧啶(5-Fu)的PLGA-PLL-cRGD温敏复合凝胶剂的制备和应用，是采用复乳法制备:取8mgPLGA-PLL-cRGD溶于400 μ L 二氯甲烷，加入40 μ L浓度为20mg/mL的5-氟尿嘧啶(5_Fu)溶液，超声乳化后，再加入4.4mL 2wt%的泊洛沙姆F68水溶液中，再次超声。然后室温下搅拌3h除去有机相，即得纳米粒混悬液。上述制得的纳米粒粒径控制在1-1OOOnm,在以上纳米粒水分散体中加入F-127使浓度为15%，即得复合凝胶剂。
【发明内容】
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[0007]本发明的目的在于提供一种具备良好的肿瘤靶向和杀伤能力的双靶向递送化疗药物纳米体系，本发明的另一目的是提供上述双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，本发明的第三目的在于提供上述双靶向递送化疗药物纳米体系在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0008]本发明的主要技术方案是:采用自由基共沉淀的方法制备出5-氟尿嘧啶高载药量的温度敏感性核壳结构微凝胶，该载体以温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺为内核，带正电荷的聚乙烯亚胺为外壳，借助电荷间的相互吸附可以装载并实现5-氟尿嘧啶的载药量可以调节控制。微凝胶包裹5-氟尿嘧啶之后，可以延长其半衰期，促使更多的5-氟尿嘧啶到达肿瘤部位，微凝胶在受到肿瘤局部高温刺激后，发生塌缩进而减小粒径，促进肿瘤细内吞5-氟尿嘧啶，并更快的释放药物，从而降低5-氟尿嘧啶的毒副作用。本发明还通过连接物连接抗Her-1抗体,革El向微凝胶/5-氟尿啼唆复合体具备良好的肿瘤革El向和杀伤能力。
[0009]本发明的第一方面，提供一种双靶向递送化疗药物纳米体系，所述的药物纳米体系包括:
[0010]药物载体，以温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为内核，以带正电荷的聚乙烯亚胺(PEI)为外壳；
[0011 ] 化疗药物，为5-氟尿嘧啶(5-FU)；
[0012]药物载体通过电荷间的相互吸附装载5-氟尿嘧啶；以实现5-氟尿嘧啶载药量的可控调节；
[0013]药物载体中的马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(mPEGs)通过mPEGs上马来酸酐中双键与巯基化抗Her-1抗体上的巯基发生加成反应，将抗体连接到mPEGs上，同时mPEGs上的琥珀亚酰胺与载体材料中的游离氨基发生取代反应，从而得到抗体靶向的纳米载体；以实现靶向微凝胶载药体系对Her-1阳性的肿瘤具备良好的靶向性。
[0014]所述的温度敏感性的聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，在32度是发生临界相转变行为。
[0015]所述的聚乙烯亚胺(PEI),分子量25KD,为分枝状；
[0016]所述的纳米粒径为300nm±25nm。
[0017]优选的，所述的温度敏感性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，体积相变温度(VPTT)约32 °C，即当温度接近肿瘤病灶部位温度时，温度T大于(相转变温度)VPTT时，能够明显促进细胞对载体的内吞。
[0018]本发明的第二方面，提供一种双靶向递送化疗药物纳米体系的制备方法，该方法包括如下步骤:
[0019]A、阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI的制备
[0020]先将PE1、NIPAM、N, N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中，向该PBS体系中通入N2除氧后，加入叔丁基过氧化氢(TBHP)，在80°C的油浴封闭环境下搅拌反应2-6h ;反应结束后，通入O2搅拌停止反应；37°C下，15000rpm离心纯化凝胶10—20min ;用去离子水(Mill1-Q water)重新溶解凝胶；用30KD的透析膜在Mill1-Q water中透析5-10天,制得阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI。
[0021]所述的PE1、NIPAM、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)这三者的重量比例为4/6/0.1 ?6/4/0.10
[0022]B、靶向纳米凝胶包裹化疗药物5-Fu的制备
[0023]步骤A制备得到的阳离子纳米凝胶PNIPAM/PEI与带有一定负电荷的化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶于纳米凝胶溶液中，所述的纳米凝胶与药物的质量比为1:1，1:3，1:5。根据载体载药后药物的释放情况以及载体的稳定性确定纳米凝胶载体与5-Fu的质量比为1:1?1:3之间最为合适；然后通过mPEGs将巯基化的抗体和纳米凝胶载体交联起来，巯基化抗体的质量与载体的质量比为1:10为佳。
[0024]所述的步骤A具体为:
[0025]先将25KD的PE1、NIPAM、N, N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)溶于PBS中向该体