一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法。该方法首先在光敏材料表面实现细胞体外培养，体外培养结束后通过施加光场，材料表面发生光电转变，实现细胞脱附，避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤。本发明所利用的光敏材料为具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜。该方法利用可见光获得的细胞片层保留了重要的细胞外基质蛋白，如离子通道、连接蛋白等，细胞间可以更好地进行信号传递，保持功能的协调一致。大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。所述实验方法流程简单，实验条件温和，成本低，具有良好的可操作性，且便于推广实施。
【专利说明】
一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法
技术领域
[0001]本发明属于组织工程领域，具体涉及一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/ 细胞薄层的方法。【背景技术】
[0002]近年来，由于现有组织工程方法的局限，细胞片层组织工程技术在组织修复及重建过程中，作为一种新的可构建的类组织及类器官结构表现出巨大潜力。细胞片层最大的优势在于可以保存组织所必须的细胞表面蛋白、细胞外基质环境及细胞间连接的完整。目前，细胞片层技术被用于治疗食管癌，心脏、角膜、肝脏、牙周及泌尿系统疾病等，并表现出光明的前景。因此，如何以温和的非侵入式的方法获得完整的细胞片层对于细胞片层组织工程来说是关键问题。目前，大多数的细胞片层获取都是采用温敏系统，即通过降低温度改变材料表面的亲疏水性进而获得细胞片层。但长时间的低温在一定程度上会损伤细胞功能。近年来，一些其他的细胞收割方法也相继被报道，包括电致、磁致、pH改变及紫外光致细胞脱附等。事实上，在这些脱附过程中，也伴随着细胞质蛋白分子的调节而影响细胞功能。 因此，更有效的及更易操纵的细胞收割方法对细胞片层技术的发展非常关键。
[0003]洪逸等采用光敏半导体二氧化钛通过紫外光照改变材料表面的亲疏水性成功获得细胞片层(Yi Hong，Mengfei Yu，Wenjian Weng，et al.Light-1nduced cell detachment for cell sheet technology,B1materials,34(2013)11-18)。但是，紫外光对细胞存在一定的毒性并可能造成基因突变，故这种方法也存在一定缺陷。因此，利用可见光实现细胞脱附受到关注。
[0004]太阳能是人类取之不尽的清洁能源，传统的太阳能电池材料即对可见光敏感，并可将其转化为电能。选取对可见光响应的带有p/n结的太阳能电池基板作为细胞培养表面， 通过可见光的强弱、p/n结的深度、表面粗糙度及细胞的种类等来调控光敏材料对可见光的响应及光电效应，研究可见光下材料与细胞或细胞与细胞之间的相互作用，对于细胞片层脱附、组织工程、细胞治疗等的发展都有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，该方法利用具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜作为细胞培养表面，可以在可见光照射下高效温和的获取低损伤的完整细胞片层。
[0006]本发明利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，包括以下步骤:
[0007]a.将具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜以紫外光照或蒸气消毒方式消毒；
[0008]b.将上述具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜作为体外细胞培养表面，在其表面以3 X 104?1 X 106个/cm2的密度种植细胞，加入细胞培养基，并放入37摄氏度恒温及5% 二氧化碳的细胞培养箱中培养1?1 〇天；
[0009]C.将经上述培养后的培养表面移入PBS中，以波长为400?800纳米、强度30?200mW/cm2的可见光照射上述光敏半导体片材或其薄膜1?20分钟，即可使培养后的细胞或细胞薄层脱附。
[0010]上述技术方案中，所述的具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜，其中光敏半导体为P型或n型的单晶硅、多晶硅或者非晶硅，在其表面通过施主元素(磷或锑元素)扩散或受主元素(硼或铟元素)扩散形成有p/n结。所述p/n结的结深为0.3?2wii。
[0011]所述的具有P/n结的光敏半导体片材或其薄膜的表面通常为绒面，即具有金字塔结构的粗糙表面。
[0012]所说的光敏半导体片材的厚度通常为100微米?1000微米。
[0013]所说的光敏半导体薄膜的厚度通常为300纳米?20微米。
[0014]所述的光敏半导体片材表面的粗糙度为1?10微米。
[0015]所说的光敏半导体薄膜表面的粗糙度为100?500纳米。
[0016]所述的细胞为在体外模拟生理环境下培养的贴壁细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞、成肌细胞、上皮细胞、内皮细胞及干细胞。
[0017]本发明方法选择在可见光照射下表面可发生光电转变的含有p/n结的光敏半导体材料，在细胞培养过程中将其作为细胞培养表面，所培养的细胞在经可见光照射后，培养表面发生光电转变，细胞自发从培养器具表面脱离，实现细胞/细胞薄层的脱附。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
[0019]本发明方法避免了传统酶解法对细胞功能造成的损伤，保留了重要的细胞外基质蛋白，如离子通道、连接蛋白等，细胞间可以更好地进行信号传递，保持功能的协调一致，且大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。本发明具有高效的、低损伤、操作简便并适用细胞范围广等特点，具有很强的实用性。本发明细胞培养表面所需的光敏材料成本低，易于实现，便于推广应用。对于散在的细胞，本发明方法可使90%以上的细胞脱附；对于细胞薄层，则可使细胞薄层完整脱附。【附图说明】
[0020]图1为实施例1中培养细胞在可见光光照前的激光共聚焦图。
[0021]图2为实施例1中培养细胞在可见光光照后的激光共聚焦图。[〇〇22]图3为细胞脱附流程图。
[0023]图4为荧光显微镜获得的细胞片层再迀移荧光图片。【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。
[0025]购买p型或n型的单晶、多晶及非晶硅片，经过磷、硼、铟及锑元素扩散后，获得含有结深为0.3?2WI1的p/n结，并以此片材或薄膜作为细胞培养表面，进行下列培养。片材的厚度为100微米?1000微米，粗糙度为1?10微米，薄膜的厚度为300纳米?20微米，粗糙度为 100?500纳米，片材或薄膜表面均呈绒面。
[0026]实施例1
[0027]在上述单晶硅基板表面(p/n结深0.3WH，磷扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为3X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400?800纳米、强度30mW/cm2的可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射20分钟，即可使95 % 细胞从表面脱离。图1和图2分别为采用激光共聚焦显微镜所观察到的实施例1中培养细胞在可见光照前、后的激光共聚焦显微图。对比图1和图2,可以看出经可见光照射后大量细胞脱离，说明可见光实现单细胞的脱附。[〇〇28] 实施例2
[0029]在上述多晶硅基板表面(p/n结深0.5wn，磷扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为IX 105个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养培养5天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10 分钟，即可使细胞片层从表面脱离。图3为采用Nikon相机所观察到的实施例2中培养细胞片层在可见光照前、后的照片。可以看出经可见光照射后整个细胞片层实现完整脱附。
[0030]实施例3
[0031]在上述非晶硅基板表面(p/n结深0.9WH，磷扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为5X105个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度70mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射8分钟， 即可使细胞片层从表面脱离。图4为采用荧光显微镜所观察到的实施例3中培养细胞片层在可见光照后脱附再培养2天后的迀移荧光图片。可以看出经可见光脱附后的细胞片层重新再培养后，能够很好的爬出新的细胞，并保持良好的细胞形态及活力，说明可见光脱附的细胞片层保持了良好的再迀移性能，这在组织工程中细胞片层的再应用是很关键的。
[0032]实施例4
[0033]在上述单晶硅基板表面(p/n结深lwii，硼扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为1 X 106个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度40mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射15分钟， 即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0034]实施例5
[0035]在上述非晶硅基板表面(p/n结深2WH，硼扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为5 X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养10天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射5分钟，即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0036]实施例6
[0037]在上述多晶硅基板表面(p/n结深2WH，硼扩散)，进行成骨细胞体外培养，接种密度为8X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养7天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度200mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射1分钟， 即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0038]实施例7
[0039]在上述多晶硅基板表面(p/n结深lwii，铟扩散)，进行小鼠成纤维细胞体外培养，接种密度为IX 105个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度30mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射6 分钟，即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0040]实施例8
[0041]在上述单晶硅基板表面(p/n结深2wii，铟扩散)，进行成肌细胞体外培养，接种密度为2X105个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养5天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射12分钟， 即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0042]实施例9
[0043]在上述非晶硅基板表面(p/n结深lwii，铟扩散)，进行小鼠上皮细胞体外培养，接种密度为2X105个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养3天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度50mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射3分钟，即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0044]实施例10
[0045]在上述非晶硅基板表面(p/n结深2wn，锑扩散)，进行大鼠骨髓间充质干细胞体外培养，接种密度为3 X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养10 天后，细胞形成膜片，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10分钟，即可使细胞片层从表面完整脱离。
[0046]实施例11
[0047]在上述单晶硅基板表面(p/n结深2WH，锑扩散)，进行小鼠成纤维细胞体外培养，接种密度为5X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400?800纳米、强度30mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射5分钟，90 %细胞从基板表面脱离。
[0048]实施例12
[0049]在上述多晶硅基板表面(p/n结深2WH，锑扩散)，进行成肌细胞体外培养，接种密度为5X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为 400?800纳米、强度50mW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10分钟，92 %的细胞从基板表面脱离。
[0050]实施例13
[0051]在上述单晶硅基板表面(p/n结深2WH，铟扩散)，进行小鼠上皮细胞体外培养，接种密度为5X104个/cm2,放入37摄氏度恒温及5%二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射10分钟，96%的细胞从基板表面脱离。
[0052]实施例14
[0053]在上述非晶硅基板表面(p/n结深2wn，锑扩散)，进行大鼠骨髓间充质干细胞体外培养，接种密度为6 X 104个/cm2，放入37摄氏度恒温及5 %二氧化碳的细胞培养箱中培养1天后，以波长为400?800纳米、强度lOOmW/cm2可见光从细胞培养器皿顶部入射，照射20分钟， 91 %的细胞从基板表面脱离。
【主权项】
1.一种利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特征在于，包括以下 步骤:a.将具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜以紫外光照或蒸气消毒方式消毒；b.将上述具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜作为体外细胞培养表面，在其表面以3 X 104?1 X 106个/cm2的密度种植细胞，加入细胞培养基，并放入37摄氏度恒温及5%二氧化 碳的细胞培养箱中培养1?10天；c.将经上述培养后的培养表面移入PBS中，以波长为400?800纳米、强度30?200mW/cm2 的可见光照射上述光敏半导体片材或其薄膜1?20分钟，即可使培养后的细胞或细胞薄层 脱附。2.根据权利要求1所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所述的具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜，其中光敏半导体为p型或n型的单晶 娃、多晶娃或者非晶娃，在其表面通过施主元素扩散或受主元素扩散形成有p/n结。3.根据权利要求2所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所述p/n结的结深为0 ? 3?2ym。4.根据权利要求2所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所述的具有p/n结的光敏半导体片材或其薄膜的表面为绒面。5.根据权利要求2所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所说的光敏半导体片材的厚度为100微米?1000微米。6.根据权利要求2所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所说的光敏半导体薄膜的厚度为300纳米?20微米。7.根据权利要求5所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所述的光敏半导体片材表面的粗糙度为1?10微米。8.根据权利要求6所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特 征在于，所述的光敏半导体薄膜表面的粗糙度为100?500纳米。9.如权利要求1所述的利用可见光照射获取体外培养的细胞/细胞薄层的方法，其特征 在于，所述的细胞为成骨细胞、成纤维细胞、成肌细胞、上皮细胞、内皮细胞或干细胞。
【文档编号】C12N5/077GK106085948SQ201610429597
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】程逵, 王小召, 翁文剑
【申请人】浙江大学