一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。本发明所提供的体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；(2)制备视网膜神经层；(3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系。本发明所提供的RPE细胞与视网膜神经层共培养的方法，形成Bruch膜?RPE细胞?视网膜神经层的“三明治结构”，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟了RPE体内生长环境，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。
【专利说明】
一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002]视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)是具有极性的、单层上皮细胞，在视网膜中RPE基底部为Bruch膜，顶端为视网膜神经层。RPE能够吞噬感光细胞外节、分泌营养因子、参与视循环代谢，组成血一视网膜屏障，对于正常的视网膜功能具有十分重要的功能，许多致盲性眼病的发生都与RPE的功能障碍有关，如老年性黄斑变性、视网膜色素变性等。因此，研究RPE的功能具有十分重要的意义。
[0003]将RPE细胞进行体外培养是研究RPE的必备方法，但一般的细胞培养方法是将RPE细胞培养在普通培养板上，该方法与真实的体内环境有很大差异，无法真实有效地评估细胞在体内环境中的功能。许多研究致力于采用超薄的小孔径PET膜人工模拟Bruch膜，并将RPE细胞培养在这种人工材料上(Sonoda,S.，et al.Nat Protoc，2009，4:662-673)，发现RPE细胞能够在这种材料上形成具有极性的、单层细胞。这种体外培养RPE细胞的方法虽然一定程度上更接近于体内生长环境，但仍然忽视了视网膜神经层对于RPE生长、分化、功能的影响。而视网膜神经层在体外培养过程中极易飘动、卷缩，使得难以与RPE细胞进行直接共培养。
[0004]因此，需要一种有效的培养体系，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟RPE体内生长环境，为深入研究RPE细胞在体内环境中的生长、分化和功能提供一种实验平台。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法。
[0006]本发明所提供的体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤:
[0007](I)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞；
[0008](2)制备视网膜神经层；
[0009](3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系:将所述步骤(2)制备的视网膜神经层移到已接种了所述步骤(I)制备的视网膜色素上皮细胞的Transwell培养小室，使所述视网膜神经层的感光细胞层朝向所述视网膜色素上皮细胞，加入培养基，置细胞培养箱内于37 0C和5 %⑶2条件下共培养，2?3天换液;所述培养基为以Neurobasal-A培养基为基础，加入如下质量百分比浓度的组分:2%B-27添加剂、I %N-2添加剂和0.4%L_谷氨酰胺。
[0010]所述步骤(I)中所述制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞包括如下步骤:将人胚胎干细胞Hl不传代连续培养35?45天后，出现直径Imm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为视网膜色素上皮细胞，待生长至融合时，经质量百分比浓度为0.25 %胰蛋白酶37 °C消化I Omin，计数，以I X 1 Vcm2的密度将所述视网膜色素上皮细胞均匀接种于已包被过基质胶的Transwell培养小室的上层;移至细胞培养箱中，于37°C、5%C02培养视网膜色素上皮细胞14天后形成具有极性的单层视网膜色素上皮细胞。
[0011]所述培养视网膜色素上皮细胞所需的培养基为:高糖DMEM基础培养基中添加质量百分比浓度为20%KSR、质量百分比浓度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。
[0012]所述步骤(2)中所述制备视网膜神经层包括如下步骤:准备好出生后30天LongEvens大鼠的离体眼球，利用视网膜取出器在5秒内完整取出离体眼球的视网膜神经层，将取出的视网膜神经层剪成梅花状，保持展平。
[0013]所述步骤(3)还包括将视网膜压平器压在所述视网膜神经层上，以保持所述视网膜神经层展平以及所述视网膜神经层与所述视网膜色素上皮细胞的紧密接触的步骤。
[0014]本发明中，RPE细胞是原代分离或经过各种干细胞分化来的RPE细胞或经基因修饰的RPE细胞。所述干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、各种成体干细胞、以及采用治疗性克隆技术制备的干细胞等。
[0015]本发明中，若视网膜神经层来源于不同种属、不同遗传背景，可进行相关的免疫排斥研究。
[0016]根据实验的设计的需要，检测RPE细胞的生长、分化及功能，包括细胞的增殖、分化、吞噬感光细胞外节、分泌营养因子，参与视循环代谢等，为深入研究RPE细胞在体内环境中的功能提供可靠实验依据。
[0017]本发明所提供的RPE细胞与视网膜神经层共培养的方法，形成Bruch膜-RPE细胞-视网膜神经层的“三明治结构”，既模拟了Bruch膜又保持RPE与视网膜神经层直接共培养，完全模拟了 RPE体内生长环境，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。本发明为一种完全模拟体内环境的RPE细胞培养方法，提供了一个有价值的研究体内环境下RPE细胞生长、分化、功能的实验平台。
【附图说明】
[0018]图1中A-C为RPE细胞培养在Transwell膜上的示意图，及细胞形态、细胞极性的免疫荧光鉴定图。
[0019]图2为分离的视网膜神经层剪成梅花状后的示意图。
[0020]图3为视网膜压平器的结构示意图
[0021 ]图4为具有极性的单层RPE细胞与视网膜神经层共培养的示意图。
[0022]图5为共培养后检测RPE细胞的吞噬功能。
[0023]图6为共培养后Western blot检测RPE细胞RPE65的表达。
[0024]图7为共培养后检测RPE细胞的超微结构。
【具体实施方式】
[0025]下述实施例中所使用的检测、鉴定、纯化方法如无特殊说明，均为常规方法;下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
[0026]实施例1、视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层共培养的方法
[0027]—、人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞与大鼠视网膜神经层共培养的方法
[0028]1、制备具有极性的单层RPE细胞:将人胚胎干细胞Hl(购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，货号为SCSP-306，记载过人胚胎干细胞Hl的非专利文献是:郭新，秦洁，张键荣，唐爱发，余振东，石敏，桂耀庭，蔡志明；人胚胎干细胞Hl培养条件的优化;解剖学杂志，2008年03期)不传代连续培养35?45天后，出现直径约Imm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为RPE细胞，待生长至融合时，经0.25 % (质量百分比浓度)胰蛋白酶370C消化1min，计数，以I X 105/cm2的密度将RPE细胞均匀接种于已包被过基质胶(354230，美国BD公司)的Transwell培养小室(3470，美国Corning公司)(孔径为0.4um的PET膜)的上层。小心移至细胞培养箱中，37°C，5%⑶2培养。2?3天半量换液，培养14天后可形成具有极性的单层RPE细胞，参见图1。
[0029]RPE细胞培养所需的培养基为:高糖DMEM基础培养基，20% (质量百分比浓度)KSR(KnockOut?Serum Replacement) ,1% (质量百分比浓度)非必需氨基酸，ImML-谷氨酰胺，均购自美国Invitrogen公司。
[0030]2、制备视网膜神经层:准备好出生后30天Long Evens大鼠(购买自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心)的离体眼球，利用“视网膜取出器”(发明专利号:ZL201310162184.7;公布号:CN103211677)和“视网膜神经细胞层体外分离制备的方法”(发明专利申请号:201310162180.9;授权公告号:CN 103234774B)，在5秒内快速完整的取出离体眼球的视网膜神经层，视网膜神经层剪成梅花状，保持展平，参见图2。
[0031 ]取出视网膜神经细胞层的具体步骤如下:
[0032]A.清洁眼球:首先用预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.4)充分冲洗眼球;根据眼球来源，选择相应的抗生素加入预冷的生理盐水内充分冲洗眼球(如使用庆大霉素则每毫升生理盐水内含有20IU);眼球放在装有冰块的离体眼球固定器(授权公告号:CN 203341904U)上，去除眼球表面的所有血样附属物和其他附属的组织，保留四条直肌。
[0033]注意事项:
[0034]a.因为来自动物或遗体捐献的眼球，眼球表面有许多血样附属物和其他附属的组织，为了防止组织细胞之间的污染，小心用弯剪刀仔细剪除眼球表面的组织和血迹附属物，保留四条直肌。因为眼球壁较薄，小动物眼球壁大约0.6-0.8mm，大动物眼球壁大约0.8-1.2_，人的眼球壁大约1.0-1.5_，切记不要把眼球壁剪破。
[0035]b.该步骤要求动作准确迅速，确保在0°C-4°C低温条件下操作，以保证眼球各种细胞的活性。
[0036]c.每一个眼球，需要更换一次眼球固定器的塑料覆盖膜，以防污染。
[0037]B.固定眼球:将清洁处理过的实验动物来源的眼球或遗体捐献的眼球的四条直肌固定在与眼球大小相应的装有冰块的眼球固定器上。
[0038]注意事项:
[0039]a.为了防止污染，每一只眼球在冲洗后，更换一张眼球固定器的塑料纸。
[0040]b.在固定眼球时，千万注意不要强行牵拉四条直肌，因为直肌巩膜附着点的巩膜厚度大约为0.3mm，以免造成眼球破裂。
[0041]c.选择大小合适的眼球固定器，以眼球的直径大小为依据来选择。如果眼球固定器大小不适宜，切开眼球壁的时候，严重者可造成眼内容物的脱出，也可带来造成操作的不便。
[0042]C.切开眼球壁:在解剖显微镜下，用视网膜取出器C端的一次性刀片在小鼠、大鼠或荷兰猪的眼球，沿角巩膜缘后Imm切开全层的眼球壁360度，大型实验动物小香猪、家兔、狗、猕猴等大型实验动物的眼球，或遗体捐献的眼球，沿眼球的平坦部(角膜缘后4mm)切开全层眼球壁360度。
[0043]注意事项:
[0044]a.—次性刀片必须确保其刀刃的锋利，以确保手术时避免对眼球施加任何的压力，避免重复使用，以防治污染。
[0045]b.根据不同眼球壁的厚度，掌握好切开球壁的深度，一般成年小动物眼球壁厚度大约为0.6-0.8mm，大动物眼球壁厚度大约为0.8-1.2mm，人的眼球壁厚度大约为1.0-1.5_，同一类眼球不同发育年龄其眼球壁的厚度也有所差异，应注意。
[0046]c.该步骤必须在显微镜下仔细操作，不要切开的过浅或过深，二者均可造成眼球组织细胞的损伤。
[0047]d.小动物眼球壁切开是沿着角膜缘外Imm切开，大动物眼球壁切开是在角膜缘后4_处切开，预先用标记笔画出所要切开的部位，以免错位，造成视网膜和眼内组织的损伤。
[0048]e.清除眼内容物:掀起眼球的前部，用视网膜取出器B端的视网膜一次性取出勺，沿着眼球壁的切口进入眼内，把晶状体和玻璃体轻轻托出。
[0049]注意事项:
[0050]a.操作时，小动物用视网膜取出勺从眼球壁的切口沿球壁的弧形进入，轻轻将晶状体和玻璃体一起托出；大动物分两步，先用视网膜取出勺沿眼球壁切口水平进入将晶状体托出，然后沿球壁的弧形进入将玻璃体轻轻托出。
[0051]b.视网膜取出勺进入眼内操作时，动作一定要轻柔，切记不可使用其搅动眼内物，以免牵拉视网膜，造成视网膜人为的脱离。
[0052]D.取出视网膜神经层:此时剪除眼球的前部组织，用无齿镊轻轻夹住眼球壁呈灰白色的内层，沿眼球壁切口的全周给于充分的分离，分离深度大约5mm左右，用视网膜取出勺沿球壁的弧度进入视网膜下腔，取出完整的视网膜神经细胞层，呈灰白色球形。用微型剪刀将视网膜神经层切成“梅花形”，将视网膜神经层展平。
[0053]注意事项:
[0054]a.由于眼球离体后，尤其是人体捐献的眼球，离体时间越长，视网膜神经层越容易与视网膜色素上皮层脱离，该步骤操作时动作一定要轻柔，沿着视网膜下腔的自然弧度进入，将全层视网膜神经层取出。
[0055]b.根据眼球的大小，选择相适应直径的视网膜取出勺。调整视网膜取出勺恰当的角度后，沿着眼球壁的自然弧度进入视网膜下腔，切记操作动作不要粗暴，这一步最容易造成视网膜取出不完全或视网膜呈碎片状。
[0056]3、构建RPE与视网膜神经层的共培养体系:将步骤2中准备好的视网膜神经层移到已接种了 RPE细胞的Transwe 11培养小室(购自Corning公司，产品目录号为3470)中，使得视网膜神经层的感光细胞层朝向RPE细胞，再用视网膜压平器压在视网膜上方(图4)。视网膜压平器(参见图3)，中空，圆锥状，直径较大的一端为底座，底座呈圆环状，底座上方设有一圈流通孔，另一端为顶端。高18_，底座直径为6mm，内径5mm。流通孔距离底座高1.5mm，直径1mm，顶端直径为5mm。整个视网膜压平环采取有机塑料制成。
[0057]在TranswelI培养小室的上室和下室中加入适量适合视网膜生长的培养基，该培养基以Neurobasal-A培养基(购自Life Technologies公司，产品目录号为10888-022)为基础，加入如下质量百分比浓度的组分:2%B-27添加剂(质量百分比浓度)(购自LifeTechnologies公司，产品目录号为17504044)，I %N-2添加剂(质量百分比浓度)(购自LifeTechnologies公司，产品目录号为17502-048)，0.4%L-谷氨酰胺(质量百分比浓度)，置细胞培养箱内于37 °C和5 % CO2条件下共培养，2?3天换液。
[0058]二、共培养2天后检测RPE细胞吞噬感光细胞外节功能
[0059]采用上述方法将RPE与视网膜神经层共培养2天后，去除视网膜神经层，将PET膜从Transwel I培养小室上剪下，对RPE细胞片进行免疫荧光检测。
[0060]具体步骤包括:PBS洗3遍后，4 %多聚甲醛室温固定15分钟后，再次用I3BS洗3遍，加A0.2%Trit1n X-100，室温处理30min后，PBS洗3遍，5%山羊血清室温封闭Ih，用封闭液稀释兔来源Rhodopsin抗体(货号ab81702，美国abeam公司)，4°C孵育过夜，次日I3BS洗3遍后，加二抗，370C孵育60min，加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽，室温染色60分钟，PBS洗3次，DAPI染细胞核10分钟，PBS洗细胞3次后，加荧光封片液封片，荧光或共聚焦显微镜下观察。如图5中A所示，Rhodopsin阳性的、呈点状的感光细胞外节全部被吞噬到RPE细胞中，结果特异性好。
[0061]而常规方法检测RPE细胞吞噬感光细胞外节时，需要事先剥离、纯化感光细胞外节，再用FITC标记后与培养的RPE细胞进行共培养，采用同样的免疫荧光方法，但不加Rhodopsin抗体，iFluor 594标记的鬼笔环肽用于显示细胞轮廓。如图5中B所示，FITC标记的、呈碎片状的感光细胞外节部分被吞噬到RPE细胞中，结果特异性较差。
[0062]三、共培养14天后检测RPE细胞的分化
[0063]RPE65是RPE细胞特异性的蛋白质，标记着细胞分化成熟度。用Western blot方法检测细胞共培养前后RPE65的表达，并以未进行共培养的RPE细胞进行比较。具体步骤包括:
[0064]1.RPE与视网膜神经层共培养14天后，去除视网膜神经层，PBS洗3遍。再将共培养(Co-culture)和非共培养的RPE细胞用0.25 %胰酶消化，培养基中和消化后，离心，弃上清，取出细胞沉淀，置于冰上，加入10ul RIPA裂解液(强)(P0013B，Beyotime)，混匀后，14000rpm离心5min后，取上清及细胞总蛋白。
[0065]2.将提取的蛋白与蛋白上样缓冲液混合(4:1)，100 °C变性1min。
[0066]3.配浓缩胶和12%分离胶后，上样，电泳条件为80V，恒压，当跑至分离胶时，120V，恒压，直至loading buffer跑到凝胶外。
[0067]4.切胶后，将蛋白转至PVDF膜，转膜条件为100V，恒压，70min。
[0068]5.取出PVDF膜，加入Western封闭液(P0023B，碧云天)，封闭60分钟。
[0069]6.用一抗稀释液稀释小鼠来源RPE65抗体(货号为abl3826，abcam公司)一1:400,4°(:孵育过夜，内参β-actin抗体(货号为BM0627，Boster公司)一1:1000，4°C孵育过夜。
[0070]7.TBST(0.05%Tween_20)洗3遍，每遍 10分钟。
[0071]8.用TBST稀释HRP标记羊抗小鼠抗体(Boster，BA1050)——1:1000，37°C孵育2h。
[0072]9.TBST(0.05 % Tween-20)洗3遍，每遍 10分钟。
[0073]10.加入ECL显色液(P0018，碧云天)，曝光。
[0074]如图6所示，内参表达水平相似，而共培养的RPE细胞(Co-culture)的RPE65表达水平明显高于未共培养的对照组(Control)，说明共培养有利于RPE细胞的分化成熟。
[0075]四、共培养30天后检测RPE细胞的超微结构
[0076]采用上述方法将RPE与视网膜神经层共培养30天后，去除视网膜神经层，与非共培养的RPE细胞一起用投射电镜检测其超微结构。具体步骤如下:
[0077]1.将PET膜从Transwe 11培养小室上剪下，2.5 %戊二醛固定；
[0078]2.0.1M PBS漂洗两次，30分钟/次；
[0079]3.1%锇酸后固定2小时；
[0080]4.0.1M PBS漂洗;
[0081]5.丙酮梯度脱水；
[0082]6.环氧树脂618包埋；
[0083]7.半薄切片定位；
[0084]8.超薄切片，铀染，铅染；
[0085]9.FEI公司TECNAI10透射电子显微镜观察
[0086]如图7所示，共培养的RPE细胞形成了典型了RPE形态，其细胞顶端出现了丰富的微绒毛，色素颗粒集中在胞质内的上方，细胞核位于细胞质下方，细胞呈单层，相连细胞之间形成了紧密连接。而非共培养的RPE细胞虽然也呈单层，但尚未出现明显的色素颗粒和微绒毛。说明共培养更有利于使体外培养的RPE细胞形成典型的超微结构。
【主权项】
1.一种体外培养视网膜色素上皮细胞的方法，包括如下步骤: (1)制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞； (2)制备视网膜神经层； (3)构建视网膜色素上皮细胞与视网膜神经层的共培养体系:将所述步骤(2)制备的视网膜神经层移到已接种了所述步骤(I)制备的视网膜色素上皮细胞的Transwell培养小室，使所述视网膜神经层的感光细胞层朝向所述视网膜色素上皮细胞，加入培养基，于37°C和5 % C02条件下共培养，2?3天换液;所述培养基为以Neurobasal-A培养基为基础加入如下质量百分比浓度的组分:2%B-27添加剂、I %N-2添加剂和0.4% L-谷氨酰胺。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步骤(I)中所述制备具有极性的单层视网膜色素上皮细胞包括如下步骤:将人胚胎干细胞Hl不传代连续培养35?45天后，出现直径Imm大小的色素灶，将色素灶挑出后接种在培养板中，从色素灶中长出的细胞即为视网膜色素上皮细胞，待生长至融合时，经质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶37°C消化lOmin，计数，以I X 1Vcm2的密度将所述视网膜色素上皮细胞均勾接种于已包被过基质胶的TranswelI培养小室的上层;移至细胞培养箱中，于37°C、5%C02培养视网膜色素上皮细胞14天后形成具有极性的单层视网膜色素上皮细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述培养视网膜色素上皮细胞所需的培养基为:高糖DMEM基础培养基中添加质量百分比浓度为20 %KSR、质量百分比浓度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步骤(2)中所述制备视网膜神经层包括如下步骤:准备好出生后30天Long Evens大鼠的离体眼球，利用视网膜取出器在5秒内完整取出离体眼球的视网膜神经层，将取出的视网膜神经层剪成梅花状，保持展平。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步骤(3)还包括将视网膜压平器压在所述视网膜神经层上，以保持所述视网膜神经层展平以及所述视网膜神经层与所述视网膜色素上皮细胞的紧密接触的步骤。
【文档编号】C12N5/071GK106047792SQ201610436669
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】吴畏, 徐海伟, 曾玉晓, 彭广华, 阴正勤
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第附属医院, 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院