基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法，具体方法如下：先饲养家蚕并用家蚕微孢子虫进行感染，饲养直至家蚕上蔟结茧；然后将结茧后的蚕蛹进行表面消毒，取蚕蛹血淋巴，筛选成功感染家蚕微孢子虫的蚕蛹血淋巴加入鳞翅目昆虫细胞sf9中培养，即获得感染家蚕微孢子虫的sf9细胞。本发明的方法步骤简单，感染效率高，并且不容易引入杂菌，实现了家蚕微孢子虫对鳞翅目昆虫细胞高效而稳定的侵染，为家蚕微孢子虫功能基因组、遗传操作、侵染机制等方面的研究材料提供了新的制备方法。
【专利说明】
基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染鱗翅目昆虫细胞的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染鱗 翅目昆虫细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 微抱子虫(microsporidia)是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物，其寄主极 为广泛，几乎能够感染从无脊椎动物到脊椎动物甚至包括人在内的所有动物。微抱子虫是 昆虫、鱼类、晒齿类动物、兔类、皮毛动物及灵长动物的重要病原，同时也是幢虫生物防治的 杀虫剂。经过长期的演化，微抱子虫已展现出了十分丰富的物种多样性，目前已被鉴定发现 的微抱子虫已超过1400多种，分布于超过150个属，并且每年都还有新的物种被发现。
[0003] 家蚕微抱子虫(Nosema bombycis，N.b)是第一个被人们所鉴别的微抱子虫，由瑞 ±植物学家化rlNagcIi于1857年在家蚕中发现并命名，其寄生于家蚕体内引发家蚕微粒子 病，2012年，国际原生生物进化和分类委员会认可了将微抱子虫归于真菌。因其可经卵垂直 传播而被世界各养蚕国家和地区列为蚕业生产的唯一法定检疫对象。目前该病害仍然对蚕 业生产产生着巨大的危害。作为自然界中最成功的寄生虫之一，微抱子虫对人类的生产生 活具有巨大的威胁，有大量学者对微抱子虫的形态结构、遗传进化、致病机理等生物学特性 进行着研究。
[0004] 目前，由于家蚕微抱子虫的严格细胞内寄生的特性所W无法直接进行离体培养， 只能通过家蚕或鱗翅目昆虫（lepidopteran)细胞进行培养。2005年李艳红等人建立了家蚕 微抱子虫侵染草地贪夜蛾卵巢细胞体系，该方法利用从家蚕丝腺和中肠分离的家蚕微抱子 虫经K0H处理后侵染sf21细胞株，该方法虽然能够成功感染sf21细胞株，但是稳定性和重复 性差，因此运极大的制约了利用细胞对家蚕微抱子虫进行研究。因此建立高效而稳定的家 蚕微抱子虫侵染鱗翅目昆虫细胞的方法对家蚕微抱子虫功能基因组、遗传操作、侵染机制 等方面的研究有着重要的作用。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染鱗翅 目昆虫细胞的方法，方法操作简单，感染效率高。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0007] 基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染鱗翅目昆虫细胞的方法，包括如下步 骤：
[0008] 1)饲养家蚕并用家蚕微抱子虫进行感染，然后饲养至家蚕上康结虽；
[0009] 2)将结虽后的蚕蛹进行表面消毒，取蚕蛹血淋己，然后筛选成功感染家蚕微抱子 虫的蚕蛹血淋己加入鱗翅目昆虫细胞sf9中培养，即获得感染家蚕微抱子虫的sf9细胞。
[0010] 优选的，步骤1)为将家蚕5龄起蚕，按照104个家蚕微抱子虫每头将家蚕微抱子虫 混悬液涂抹在桑叶上进行添食，饲养直至上康结虽。
[0011] 优选的，步骤2)中，所述表面消毒为依次用质量分数为2%的次氯酸钢、体积分数 为75 %的乙醇、无菌水分别浸泡5min。
[0012] 优选的，步骤2)中，感染家蚕微抱子虫的蚕蛹血淋己加入量按家蚕微抱子虫与感 染鱗翅目昆虫细胞数比例为1:10~10:1。
[0013] 优选的，步骤2)中，所述培养是在溫度为28°C条件下培养。
[0014] 更优选的，所述鱗翅目昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞。
[0015] 本发明的有益效果在于:本发明公开了基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染 鱗翅目昆虫细胞的方法，通过利用蚕蛹血淋己作为感染材料，利用蚕蛹血淋己具有较高感 染活性和纯净度的家蚕微抱子虫的优点，实现了家蚕微抱子虫对鱗翅目昆虫细胞高效而稳 定的侵染，并且该方法不需要对蚕蛹血淋己中的微抱子进行提取，减少了操作步骤，因此降 低了引入杂菌的风险，并且利用本发明的方法感染鱗翅目昆虫细胞还具有感染效率高，重 复性好的优点，为家蚕微抱子虫功能基因组、遗传操作、侵染机制等方面的研究材料提供了 新的制备方法。
【附图说明】
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0017] 图1为实施例1中感染家蚕微抱子虫家蚕蚕蛹血淋己中的抱子。
[001引图2为实施例1中侵染后12化的感染情况镜检。
[0019]图3为实施例1中不同时间sf9细胞中家蚕微抱子虫的绝对定量。
[0020] 图4为实施例2中感染家蚕微抱子虫家蚕蚕蛹血淋己中的抱子。
[0021] 图5为实施例2中不同时间sf9细胞中家蚕微抱子虫的感染情况观察(A:转染干扰 质粒的感染家蚕微抱子虫细胞;B:转染对照质粒的感染家蚕微抱子虫细胞）。
[0022] 图6为实施例2中不同时间sf9细胞中家蚕微抱子虫的绝对定量。
[0023] 图7为实施例2中不同时间sf9细胞中家蚕微抱子虫干扰祀基因相对表达量
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第=版，J.萨姆布鲁克等著） 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[00巧]W下实施例中培养sf9细胞使用的培养基为：Sf-900? III SFM(Thermo Fisher Scientific)。
[0026] 本发明中干扰ABCGl基因表达的载体，由家蚕微抱子虫ABCGl基因作为祀基因，并 W该基因739bp-938bp的正向和反向序列，正向序列与反向序列之间用含家蚕肌动蛋白基 因 Actin 3内含子连接，形成ABCGl基因正向序列-Actin 3内含子-ABCGl基因反向序列，然 后连入载体骨架进行表达，其构建步骤参见公开号为CN102492711A的中国专利中1180- IElP-gp64S-A3intron-甜 64A-SV40 载体构建步骤。
[0027] 实施例1
[00%]基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染sf9细胞的方法，包括如下步骤：
[0029] 1)将家蚕5龄起蚕，按照lO4个家蚕微抱子虫每头将家蚕微抱子虫混悬液涂抹在桑 叶上进行添食，饲养直至上康结虽；
[0030] 2)上康5天后将感染家蚕微抱子的蚕蛹用质量分数为2%的次氯酸钢、体积分数为 75%的乙醇、无菌水分别浸泡5min，然后取蚕蛹血淋己，使用显微镜观察蚕蛹并对蚕蛹血淋 己进行家蚕微抱子虫计数(图1);
[0031] 3)按照家蚕微抱子虫与sf9细胞数比例为1:1加入家蚕微抱子虫与sf9细胞数比例 为1:10、1:1、10:1将蚕蛹血淋己加入S巧细胞中，在28°C进行培养，6h后更换新鲜培养基;之 后每3天将原有培养基去除，添加新鲜培养基28°C进行培养。
[0032] 培养过程中，每两天进行显微观察，图2为培养6天利用多聚甲醒固定DAPI染色观 察结果。结果显示，家蚕微抱子虫与sf9细胞数比例为1:10、1:1、10:1均可W成功感染sf9细 胞，并且随着家蚕微抱子虫与sf9细胞数的比例增加感染效率也随之增加，在感染第=天= 组感染率分别达:93.56 %、39.38 %、9.01 %。
[0033] 培养过程中，分别于化、3h、化、1化、2地、7化、120h取出部分细胞提取总DNA，用家 蚕微抱子虫微管蛋白e-tubulin的特异性引物进行定量分析家蚕微抱子虫的增殖情况，结 果如图3所不。
[0034] e-tubulin的特异性引物序列如下：
[00；35] Nbl\i-F:5，-agaaccaggaacaatggacg-3,（SEQ ID NO. 1);
[0036] Nbl\i-R:5'-agcccaattat1:accagcacc-3'(沈Q ID N0.2);
[0037] 结果显示，蚕蛹血淋己家蚕微抱子虫感染sf9细胞后，在12h内家蚕微抱子虫数量 增加，而在12h至24h期间家蚕微抱子虫数量出现减少，之后随着时间增加家蚕微抱子虫数 量逐渐增加，运表明在感染1化时家蚕微抱子虫对宿主细胞的入侵达到最大值，随后宿主细 胞内基于溶酶体等系统对入侵物质的清除使得在侵染12h到24h-部分家蚕微抱子虫被清 除，而一部分逃脱宿主细胞的清除作用并进入增殖阶段进行增殖。
[003引实施例2
[0039] 基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染sf9细胞进行干扰实验，具体步骤如下：
[0040] 1)将家蚕5龄起蚕，按照104个家蚕微抱子虫每头将家蚕微抱子虫混悬液涂抹在桑 叶上进行添食，饲养直至上康结虽；
[0041] 2)上康5天后将感染家蚕微抱子的蚕蛹用质量分数为2%的次氯酸钢、体积分数为 75%的乙醇、无菌水分别浸泡5min，然后取蚕蛹血淋己，使用显微镜观察蚕蛹并对蚕蛹血淋 己进行家蚕微抱子虫计数(图4);
[0042] 3)按5X 105个/孔将sf9细胞加入24孔板中，并按照化g/孔转染干扰ABCG1基因表 达的载体，在转染化后更换新鲜培养基，将步骤2)中计数后的感染家蚕微抱子虫的蚕蛹血 淋己按照家蚕微抱子虫与sf9细胞数比例为1:1加入，28°C进行培养，6h后更换新鲜培养基； 之后每3天将原有培养基去除，添加新鲜培养基28°C进行培养。
[0043] 培养过程中，分别于1211、2地、7211、12化对细胞的感染情况进行观察，结果如图5所 示。结果显示，在瞬时转染干扰ABCG1基因表达载体后家蚕微抱子虫可W感染sf9细胞并进 行增殖，运表明运种获得感染sf9细胞的方法适用于利用RNAi技术进行家蚕微抱子虫基因 功能的研究。然后分别收集细胞提取总DNA，用家蚕微抱子虫微管蛋白0-化bulin的特异性 引物（引物序列同上)进行绝对定量分析家蚕微抱子虫的增殖情况，结果如图6所示。结果显 示，转染干扰载体的sf9细胞中家蚕微抱子虫的数量显著低于对照组，表明干扰ABCGl基因 表达后能够抑制家蚕微抱子虫在sf9细胞内的增殖。
[0044] 然后提取感染家蚕微抱子虫的sf9细胞的总RNA，反转录获得sscDNA后W特异引物 对干扰祀基因 ABCG1转录量进行检测，特异引物序列如下：
[0045] ABCGl-F:5'-gagaagagacacgcttatatg-3'（SEQ ID N0.3);
[0046] ABCGl-R:5'-atcaagtccagatgtaggtt-3'（SEQ ID N0.4);
[0047] 检测结果如图7所示。结果显示，转染干扰载体的sf9细胞感染家蚕微抱子虫中 ABCG1基因的表达被显著下调。
[004引稳定性试验：
[0049] 按照实施例1的方法将感染家蚕微抱子虫的蚕蛹血淋己按照家蚕微抱子虫与sf9 细胞数比例为1:1加入sf9细胞中进行培养，由不同的操作实验人员进行操作，然后统计感 染后第3天的感染效率，同时W李艳红等人公开的方法作为对照，结果如表1所示。
[0050] 表1、基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染sf9细胞的重复性
[0化1 ]
[0052] 由表1可知，本发明所公开的基于家蚕血淋己分离的家蚕微抱子虫感染sf9细胞重 复性更好，因此可W作为家蚕微抱子虫感染鱗翅目昆虫的平台方法，为家蚕微抱子虫功能 基因组、遗传操作、侵染机制等方面的研究材料提供了新的制备方法。
[0053] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方法，其特征在于，包 括如下步骤： 1) 饲养家蚕并用家蚕微孢子虫进行感染，然后饲养至家蚕上蔟结茧； 2) 将结茧后的蚕蛹进行表面消毒，取蚕蛹血淋巴，然后筛选成功感染家蚕微孢子虫的 蚕蛹血淋巴加入鳞翅目昆虫细胞sf9中培养，即获得感染家蚕微孢子虫的sf9细胞。2. 根据权利要求1所述基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方 法，其特征在于:步骤1)为将家蚕5龄起蚕，按照10 4个家蚕微孢子虫每头将家蚕微孢子虫混 悬液涂抹在桑叶上进行添食，饲养直至上蔟结茧。3. 根据权利要求1所述基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方 法，其特征在于:步骤2)中，所述表面消毒为依次用质量分数为2%的次氯酸钠、体积分数为 75 %的乙醇、无菌水分别浸泡5min。4. 根据权利要求1所述基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方 法，其特征在于:步骤2)中，感染家蚕微孢子虫的蚕蛹血淋巴加入量按家蚕微孢子虫与感染 鳞翅目昆虫细胞数比例为1:10~10:1。5. 根据权利要求1所述基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆虫细胞的方 法，其特征在于:步骤2)中，所述培养是在温度为28°C条件下培养。6. 根据权利要求1~5任一项所述基于家蚕血淋巴分离的家蚕微孢子虫感染鳞翅目昆 虫细胞的方法，其特征在于:所述鳞翅目昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞。
【文档编号】C12N5/07GK106047790SQ201610465548
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】李春峰, 孙滨, 潘国庆, 周泽扬, 许晨
【申请人】西南大学