一种食用真菌的单孢杂交方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种食用真菌的育种交配方法，具体涉及一种食用真菌的单孢杂交方法。
【背景技术】
[0002]食用真菌育种研究中的交配方法主要是单孢杂交，也称单、单交配。当前，育种者实际杂交操作的是亲本单孢子萌发形成的单核菌丝之间的杂交，而且单孢杂交都是在固体培养基质上进行，同时在固体培养基上配对杂交，需要仔细移植对位种块、挑取交接区域菌丝、培养菌丝插片、取插片菌丝镜检确认具有锁状联合的双核菌丝等操作环节，存在着步骤繁琐、而且交配时间长、效率不高等缺点。
[0003]例如，现有技术刘都才、杨曙湘(1989)的配对杂交方法是将两个不同亲株的单核菌丝体同时接种在平板培养基上，相距0.5?1.0厘米，培养7?10天，待两菌丝体接触后，挑取接触部分的菌丝镜检，如发现锁状联合，立即将此接触部分的菌丝体转移到新鲜斜面培养基上培养。该方法是在PDA固体培养基上进行交配，需要仔细移植配位种块，操作复杂繁琐，花费较多工作精力和工作时间。
[0004]谢芝芳(2005)的单核体配对杂交方法是将两亲本单核体菌株在加富PDA斜面培养基上两两配对杂交，接种块两两间相距约2cm，待两菌落接触后，挑取接触处菌丝体转管繁殖备用。配对组合有:西德33X闵31;西德33X曲师9111 ;西德33XP235 ;西德33X川白I号；西德33X侧5 ;西德33X杂优I号。该方法同样是在PDA固体培养基上进行交配，其缺点仍然是需要仔细移植配位种块，操作显得繁琐，花费较多工作精力和工作时间。
[0005]边银丙、常堃、蔡婧(2014)的多孢自交方法是利用液体培养基多孢自交的育种选育金针菇新菌种，包括以下步骤:(I)从亲本菌株高邮738的子实体中收集单孢子制成孢子液；(2)将含亲本菌株的孢子液加入液体培养基中摇菌，进行多孢自交；(3)将液体菌种摇瓶培养并进行搔菌处理；(4)通过栽培和筛选获得目标菌株金针。该方法是采用多孢悬浮液在常规三角瓶中进行育种，接触不充分，成功率不高。
[0006]邱立友、王兰青、王淑敏等人(2007)的一种食用菌液体菌种的固化处理方法，包括以下步骤:(I)试管保藏母种扩管活化:将保藏的母种转接到试管斜面上，在适温下培养；(2)制作摇瓶液体菌种；(3)发酵罐深层培养；(4)载体物质处理；(5)液体菌种固化。该方法中液体菌种在三角瓶中培养，其缺点是三角瓶在摇瓶时占的位置太大，效率不高；三角瓶的空间太大，菌种块的生长速度慢。
[0007]王瑞娟、尚晓冬、张美彦、周峰(2013) —种食用菌交配型研究中检测锁状联合的方法包括:制备专用培养基；将培养基灭菌，用分液器分装至一次性平板中，将测试单核菌株紧挨两两接种于平板中央，置于25?26°C培养室中培养，7?8天后观测菌丝生长区域是否有锁状联合。该方法同样是在PDA固体培养基上进行交配，其缺点仍然是需要确定可信区域然后挑取菌丝进行镜检观察，这样使得挑取的部位准确性不高，不可避免人为误差和工作量大。
[0008]综上，寻求一种操作简单、时间缩短、省工省力、准确性高的食用真菌的单孢杂交方法，可有效地提高了育种研究工作效率，目前尚未见有食用真菌单孢杂交在液体专用培养基质中进行交配的报道。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的技术问题是，提供一种操作简单、时间缩短、省工省力、准确性高的食用真菌的单孢杂交方法。
[0010]本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种食用真菌的单孢杂交方法，包括以下步骤:
[0011](I)亲本单核菌丝体的预备:分别从食用真菌亲本的子实体中收集孢子，用无菌水制成孢子为0.5?1.5 X 10 6的悬浮液，均匀涂布于PDA培养基上，23?25°C下培养3?4天，挑取连带基质的星芒状细小菌落移植到PDA培养基上再培养，再挑取其菌丝于显微镜下检查无锁状联合，而且出菇试验验证不出菇，即获得了其单核菌丝，培养单核菌丝菌落至7mm以上，备用；
[0012](2) YMG液体专用培养基的制备、分装及灭菌:分别称取酵母膏3.8?4g、麦芽浸膏4.8?5g、葡萄糖18?20g、磷酸二氢钾0.8?lg、硫酸镁0.3?0.5g，混合添加于自来水中，适当加热使其溶解，最后用水定容至1000ml，得到YMG液体专用培养基；然后分装至
2.6cmX 20.2cm玻璃试管中，装液量25?30ml/支，灭菌，冷却；
[0013](3)液体培养下配对交配:在无菌操作下，采用打孔器(打孔直径7_)打取供亲本菌株的两单核菌丝菌种块，两接种块紧密挨着接入试管培养基中，置放于摇床内，在23?25°C、转速100?200r/min条件下振荡培养4?5d，可见，因振荡作用两个菌种块紧密搅浑“成团”在一起，双亲单核菌丝充分接触并交配；
[0014](4)镜检确认双核化菌丝:在无菌操作下，将成团种块移植于PDA平板培养基上培养3?4天，然后在菌落边缘处直接挑取新萌发出的菌丝，镜检具有锁状联合的双核菌丝，即成功获得了单孢杂交的新菌株。
[0015]进一步，步骤(I)中，所述食用真菌为姬菇，平菇、香菇、凤尾菇、金针菇、毛木耳或银耳。
[0016]进一步，步骤(2)中，所述YMG液体专用培养基由酵母膏4g、麦芽浸膏5g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾lg、硫酸镁0.5g，混合添加于自来水中，适当加热使其溶解，最后用水定容至100ml制备而成。
[0017]本发明具有操作简单、交配时间短、省工省力的特点，并可准确地挑取杂交成功部位，适用于具有异宗结合的有性生殖特性的其它大型真菌的单孢杂交育种研究。
【附图说明】
[0018]图1为本发明使用的单核菌丝。
[0019]图2为本发明单核杂交图。
[0020]图3为本发明杂交成功后插片镜检图。
[0021]图4为现有技术中挑取菌丝。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0023]实施例1:
[0024]1、食用真菌的单孢杂交
[0025](I)预备亲本单核菌丝体:分别从姬菇亲本的子实体中收集孢子，用无菌水制成孢子10 6的悬浮液，均匀涂布于PDA培养基上，25°C下培养3?4天，采用解剖针尖挑取连带基质的星芒状细小菌落