竹黄分离真菌瓶生顶孢霉及其在生产麦角甾酮中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物资源利用领域，设及到微生物医药产业中麦角酱酬天然活性产 物的生产方法，具体就是一株真菌瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)及其所产麦角酱 酬化合物的固体发酵方法。
【背景技术】
[0002] 麦角酱酬主要分布在多种药用真菌和药用植物中，分离纯化自真菌菌丝、子实体 及发酵液的研究较多。从真菌中获得麦角酱酬的文献如陈若芸等（1991)从赤芝抱子脂溶 部分分离获得麦角酱酬。项晨等（2011)从银白离權伞的子实体中用氯仿/甲醇（1:1，V/ V)浸提获得2：3g浸膏，最终分离获得21. 5mg麦角酱酬，得率约为0. 93%。。高锦明等（2002) 从野生真菌耳状网權菌子实体中分离得到麦角酱酬。Leeetal(2005)从猪等菌核中分 离出麦角酱酬，并发现其对HT-29 (结肠癌），化La细胞229 (子宫颈癌），Hep3B细胞（肝 癌），和AGS(胃癌）具有一定的细胞毒活性。李向敏等（2009)对灵芝抱子进行萃取所得到 的脂溶性组分应用硅胶层析、反相硅胶层析、葡聚糖凝胶层析和高效液相半制备等色谱技 术分离纯化获得麦角酱酬。从植物中获得麦角酱酬的文献如刘红兵等（2005)从东京枫杨 的茎皮中利用Se地adexLH-20和硅胶等柱色谱和重结晶等技术分离到麦角酱酬。崔奎等 (2007)从IOKg中华雜猴桃根中用95%乙醇浸提获得7mg麦角酱酬。王忠昭等（2011)从 半红树的茎和树皮中用石油酸和乙酸乙醋浸提获得123g浸膏，通过一系列分离手段获得 6. 7mg麦角酱酬。另外，还有一些通过液体发酵获得麦角酱酬的报道，如李想等（2007)从 红树植物内生真菌Penicilliumsp.的发酵菌丝中浸提得到37g浸膏，最终分离获得23mg 麦角酱酬，得率约为0.62%。。牛芸（2013)从1化大皮伞的发酵液中用乙酸乙醋浸提获得 6. 6g浸膏，最终分离得到7.Smg麦角酱酬，得率约为1.18%。。邓慧颖等（2011)从海莲内生 真菌化Stalotiopsisclavispora的发酵液中分离获得麦角酱酬。李壮壮等（2014)从条 纹拟盘多毛抱化StalotopsisVirga化Ia的发酵液中分离到麦角酱酬。关于麦角酱酬的专 利有：CN103816163A:发现从火木层孔菌的液体发酵液和子实体中分离到的麦角酱酬具 有抗禽流感活性。CN103864874A:从桑黄子实体中分离出麦角酱酬，并研究了其在制备 抗肿瘤药物中的应用。CN103044511A:从桑黄菌丝发酵全液中分离麦角酱酬的方法。CN 103265597A:研究了从虎杖药材中制备麦角酱酬的方法。CN101785776A:研究了麦角酱 酬在制备治疗慢性肾衰竭药物中的应用。CN101596201A:研究了麦角酱酬在制备利尿药 物中的应用。CN103265596A:研究了麦角酱酬用于制作化学传感器材料和装饰材料的应 用，其制成的化学传感器巧光性能优异。
[0003] 目前，尚未见关于固体发酵获得麦角酱酬的公开文件。本专利利用竹黄分离真菌 瓶生顶抱霉CAOl固体发酵生产麦角酱酬，极大地提高了产率，得率高达1. 89%。，明显高于 已文献报道中的产量。并且可用于扩大生产。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种竹黄分离真菌瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl，及 其通过固体发酵获得麦角酱酬的方法，包括菌株的获得和发酵。首先采集竹黄子实体，表面 消毒后采用组织分离法分离真菌菌株，对产生麦角酱酬的菌株进行固体发酵，然后将发酵 料烘干、粉碎，用有机溶剂浸提，经减压柱、常压硅胶柱等手段进行分离纯化，然后在甲醇中 重结晶获得目标产物，通过HPLC在350皿处检测其纯度。该化合物为黄绿色晶体（甲醇）， 分子量：392,分子式：〔2化。0,在365皿紫外灯下显蓝色巧光。。
[0005] 本发明的技术解决方案将进一步说明。
[0006] 一株真菌瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)，该菌株编号为CAOl，分离自竹 黄子实体，菌株保藏号为CGMCCNo. 10816。
[0007] 本发明还公开了瓶生顶抱霉CAOl菌株在生产麦角酱酬中的应用。
[0008] 一种用瓶生顶抱霉CAOl菌株生产麦角酱酬的方法，是瓶生顶抱霉CAOl菌株通过 固体发酵生产麦角酱酬。
[0009] 固体发酵的固体培养基配方是：大米93~98% (Wt)，黄豆粉3~5% (Wt)，鱼粉 1 ~2 % (Wt)，皿2?〇40. 5 ~1 % (Wt)，CaC〇30. 5 ~1 % (Wt)，NaCl0. 5 ~1 % (Wt);培养基 的抑6.0~7.0。93~98%的大米在清水中浸泡2~化加3~5%的黄豆粉，1~2%的 鱼粉，0. 5 ~1 % 的KHzPO" 0. 5 ~1 % 的CaC〇3,0. 5 ~1 % 的NaCl,抑调至 6. 0 ~7. 0,12TC 下灭菌2次，两次灭菌间隔时间为4她，得固体发酵料；将瓶生顶抱霉CAOl的种子培养液接 种到固体发酵料中，将固体发酵料于25~28°C下培养10~18天，待发酵料充分变红后收 获，30~55°C烘箱中烘干并粉碎，获得干燥物用于麦角酱酬的提取。
[0010] 从竹黄分离真菌CAOl的固体发酵物中分离麦角酱酬的具体步骤如下：
[0011] (I)CAOl的固体发酵：将CAOl菌株在PDA平板上培养6天，之后转接到PDA液体培 养基中，28°C下震荡培养4天。将种子培养液接种到固体发酵培养基中。固体发酵培养基 的配方为大米93~98%，黄豆粉3~5%，，鱼粉1~2%，皿2口〇4 0. 5~l%，CaC〇30. 5~ 1%，化Cl0.5~1%，P册.0~7.0,12TC下灭菌2次（两次灭菌间隔时间为4她）。将固 体培养基于28°C下培养10~18天左右（每天观察并混匀）；待培养基充分变红后收获， 30~55°C烘箱中烘干并粉碎备用。 阳〇1引 似固体发酵物的提取：将粉碎的干燥发酵产物按1:2~l:5w/v加入細2化进行 浸提3次。在减压条件下将有机溶剂挥干，获得浸膏。
[001引 做减压柱粗分划段：将浸膏与硅胶l:lw/w混匀干法上样，W石油酸-乙酸乙醋 为洗脱液，从石油酸：乙酸乙醋=60:1开始，依次为55:1、50:1…1:1。通过TLC点板，合并 紫外灯下含蓝色巧光的组分，减压浓缩获得含麦角酱酬的粗体物。
[0014] (4)硅胶柱分离纯化：将上述粗体物用少量石油酸溶解，湿法上样，所用硅胶 200-300目，采用石油酸：乙酸乙醋梯度洗脱，依次为100:1、90:1…1:1，通过TLC点板，合并 紫外灯下含蓝色巧光的组分，减压浓缩获得麦角酱酬粗品。
[0015] (5)结晶纯化：将上述麦角酱酬粗品溶于甲醇中，用有机滤膜过滤后，于室溫条件 下静置结晶。
[0016] (6)纯度检测：通过HPLC在365皿波长处检测其纯度。
[0017] 与现有技术相比，本发明提供了一株新有菌株用于固体发酵获得麦角酱酬；为大 量获得麦角酱酬提供了 一条新途径。
[0018] 本发明菌株CAOl于2015年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分 类命名为瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)，保藏编号为CGMCCNo. 10816。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1竹黄分离真菌瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl的获得
[0020] 选用新鲜的竹黄子实体，采用组织分离法，即将新鲜的竹黄子实体用清水冲洗表 面，惊干后用75%酒精进行表面消毒，然后用无菌刀片将子实体切成约3mmX3mmX3mm的 小块，再在75 %的酒精中消毒30秒，然后用无菌水冲洗3~4次后，将组织块放在已倒有 PDA培养基的平板上，每个平板放入3~4个组织块，置于28°C培养箱中培养。
[0021] 待组织块上有菌丝长出，转接到新的PDA平板上，将真菌多次纯化后保存到试管 斜面中备用，分别标号为CAO1、CA02…CA67。
[0022] 实施例2筛选产麦角酱酬的菌株 阳02引将获得的67株真菌分别接种到PDA液体培养基中，于28°C下震荡（130巧m/min) 培养4天，之后过滤掉菌丝，发酵液用二氯甲烧萃取。通过TLC点板，在紫外灯下观察有无 蓝色巧光物质。根据筛选结果，将产生蓝色巧光物质的菌株CAOl作为实验菌株。
[0024] 实施例3瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)CAOl菌株的显微形态特征及分 子鉴定 阳02引 CAOl菌株的显微形态特征：PDA培养基上，菌丝初期呈白色，浓密，6~7天后菌落 中央的菌丝变黄，菌落出现中央至四周的福射状裂痕。该菌株生长缓慢，扩散面积较小。在 生长3~4天后菌株开始分泌紫红色色素，且色素的扩散速度远大于 [00%] 菌丝的扩散速度。5~7天后也可在菌落上分泌滴状紫红色色素。100倍油镜下 观察分生抱子光滑，楠圆形，在抱子梗顶端呈链状，大小为3. 2~4ymX1. 2~2ym。
[0027] 分子生物学鉴定：利用通用引物口S-4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(沈QIDNO. 2)和 口S-5 :GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG(SEQIDNO. 3)扩增获得长度在 500 ~750bp间的PCR产 物。将PCR产物送去测序，结果如下SEQIDNO. 1所示。将W下序列在NCBI核酸序列总库中 进行BLAST比对，结果该序列与瓶生顶抱霉（Acremoniumcavaraeanum)菌株的相似性高达 99%，因此可确定该菌株为半知菌类、丛梗抱目（Moniliales)、丛梗抱科（Moniliaceae)、 葡萄抱方矣度otrytideae)、顶抱霉属（AcremoniumLk.exFr.)的