专利名称：一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物农药的检测方法，具体涉及一种用于测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法。
背景技术：
微生物农药通常包括细菌、真菌和病毒微生物农药。是直接利用细菌、真菌和病毒等产生的天然活性物质或生物活体本身开发的，对植物病虫草割进行防治的农药。这类农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不任务天敌、不易产生抗性等优点。微生物农药中的含菌量(尤其是活菌量)是决定产品质量好坏和田间防治效果的重要因子，因此活菌量是微生物农药产品质量检测的一项重要技术指标。·由于微生物农药的有效成分为活体，不能用化学农药的分析仪器进行含量检测。对于真菌微生物农药，通常采用血球计数板结合孢子萌发的方法进行检测，即先用血球计数板测定总的孢子含量(样品称量、稀释、血球计数板计数、结果计算)，然后测定孢子萌发率(样品称量、稀释、孢子培养、显微观察孢子萌发情况、结果计算)，最后计算活的孢子含量(总的含孢量X孢子萌发率)。上述方法存在以下主要缺点操作繁琐，在显微镜下不易区分真菌孢子和助剂颗粒，而且由于培养时间短，有的孢子尚未萌发，影响测定结果。近年来，一些真菌微生物农药如球孢白僵菌、绿僵菌、木霉、淡紫拟青霉等在国内陆续获得登记，生产上和市场上急需建立这类农药的快速、简便、准确的产品质量检测方法。一种考虑是采用平板菌落计数的方法来直接获得活孢子的含量，但是，按照普通用于细菌计数的平板菌落计数法对真菌进行操作的话，不同孢子的菌落会长在一起连成片，形成大的菌落，影响测定结果；而菌落太小时计数则看不清，且不能区分目标菌落和杂菌的菌落。因此，需要寻找改进的方法。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，以简化操作，获得更为准确的检测结果。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，包括下列步骤(I)在真菌培养基中加入以重量计O. 25%。 5%。的脱氧胆酸钠，并制备成平板；(2)将真菌微生物农药样品在含重量百分比O. 05% O. 1%吐温20或O. 05% O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的灭菌水中浸泡20 40min，再振荡20 40min ；(3)将步骤⑵处理后的样品进行倍数梯度稀释，分别将不同稀释度的样品均匀涂布在步骤(I)获得的平板上，室温下培养48 120h，其中，同一稀释度制作至少2个重复样品；
(4)统计各平板上的菌落数，其中菌落数在30个 300个的平板为有效计数平板；(5)真菌微生物农药中，活孢子的含量为C = TXNXlO,式中C是真菌农药活孢 子含量，单位为CFU/g ；T是统计平板对应的稀释倍数；Ν是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数。脱氧胆酸纳(Sodiumdeoxycholate,CAS号:302-95-4),中文别名为 3 α , 12 α-二羟-5 β -胆烷酸钠以及去氧胆酸钠，系胆酸盐，类似胆汁气味，有强烈苦味，易吸湿，易溶于水，微溶于无水醇，不溶于醚，低毒，半数致死量(大鼠，经口)1370mg/kg，化学结构式如下
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HO1' 个V vOH H脱氧胆酸钠为离子型去垢剂，是一种应用较广泛的生化试剂，其作用主要有裂解细胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等。此外，胆酸盐是重要的生物活性分子，能参与许多生理过程；被广泛应用于粘膜和皮肤给药的促吸收剂。本发明将脱氧胆酸钠添加到培养基中，能够抑制真菌的菌落扩展，同时在低浓度下也不会让真菌孢子致死，实现了采用平板菌落计数法一步直接获得活孢子的含量，而且可以通过肉眼或菌落计数仪统计菌落数。上述技术方案中，步骤(I)中，所述真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，将培养基高压蒸汽灭菌，待冷却到55 62°C时，向培养基中加入脱氧胆酸钠，制备成平板。步骤⑵中，所述振荡在室温、150rpm的条件下进行。优选地，步骤(2)中，浸泡时间为30min，振荡时间为30min。步骤(3)中，采用10倍数梯度稀释，同一稀释度制作3个重复样品。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点I.本发明在培养基中加入一定浓度的脱氧胆酸钠，不抑制真菌孢子萌发，但能抑制孢子萌发后所形成菌落的扩展，然后将真菌农药孢子液涂布在该培养基平板上，从而通过计数菌落的数量换算得到活孢子的含量，可以简便快速测定真菌微生物农药的活孢子含量。2.由于脱氧胆酸钠的应用，本发明能够抑制真菌的菌落扩展，同时在低浓度下也不会让真菌孢子致死，从而可以通过肉眼或菌落计数仪统计菌落数。3.本发明操作过程简便，检测准确度高。
图I是本发明实施例中测定方法流程图。图2是对比例中培养平板的照片。图3是实施例中培养平板的照片。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例采用图I所示的方法，分别对木霉可湿性粉剂、淡紫拟青霉可湿性粉剂、淡紫拟青霉液剂、球孢白僵菌母药的活孢子含量进行测定。作为实施例I至实施例4。测定步骤如下(I)将马铃薯葡萄糖琼脂粉(PDA)38g加入IOOOmL蒸馏水中，加热煮沸，分装入500mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌后，待冷却至60°C左右后分别制备O. 25%。、O. 5%。、I %、2%、5%。含量的脱氧胆酸钠PDA平板；(2)在无菌操作条件下，将样品搅拌均匀，准确称取3. Og样品，溶入27. OmL的含O. 05% Tween20的无菌水中浸泡30min后，振荡30min，得到稀释10倍的样品溶液，标记为 O号，然后依次进行梯度稀释，每个稀释度设3个重复样品；(3)将上述各梯度稀释液分别吸取100 μ L用L形玻棒均匀涂布在步骤(I)所得平板上，于25°C下培养48 120h后，选择适宜的稀释度，菌落数在30个 300个的平板为有效计数平板；(4)计算加入不同浓度脱氧胆酸钠后的孢子含量测定结果活孢子含量为C = TXNXlO式中C――真菌农药活孢子含量，单位为CFU/g ；T-----稀释倍数；N3个有效计数平板上的平均菌落数。测量结果参见表I和表2所示,平板照片如图3所示。对比例称取样品I. 00g，共称取3个试样，分别进行以下操作(I)将样品分别置于捣碎机的盛液杯中，加入O. 05%吐温20溶液IOOmL,缓慢搅拌，尽量使孢子充分润湿。(2)用移液管从溶液中部移取孢子悬浮液2mL到试管中，加蒸馏水8mL，于旋涡混合器上振荡约30sec。(3)重复步骤(2)，制备梯度浓度孢子悬浮液，以5中格孢子数为100 300的稀释度为有效稀释浓度。(4)将孢子液静置约30sec，用细头吸管从溶液中部吸取孢子悬浮液，在盖玻片边缘滴I滴，使液体沿边缘渗入盖玻片下，刚好充满盖玻片与计数板计数区域之间，以孢子液不入槽为度，应无气泡且计数区域四周凹槽无液体，如有多余液体，用小条吸水纸吸去。(5)用显微镜观察，选取待浮动孢子静止后进行计数。在规划格区内，计四周及中央的5个中格即双线范围内80小格。然后根据稀释倍数计算孢子总含量。(6)将马铃薯葡萄糖琼脂粉(PDA)38g加入IOOOmL蒸馏水中，加热煮沸，分装入500mL锥形瓶中，高压蒸汽灭菌后，待冷却至60°C左右后分别制备PDA平板。(7)将D步骤的孢子悬浮液100 μ L用L形玻璃棒涂布PDA平板上，在25°C下培养12h后于显微镜下统计萌发和未萌发孢子数，以显微镜(物镜X目镜倍数400倍)下20个孢子的稀释度为有效计数浓度。最后计算孢子萌发率。结果比较对实施例和对比例的测试结果进行比较，如表I所示。从表I可以看出，4个实施例采用本发明的方法的测定结果均略高于常规的血球计数板结合孢子萌发的方法，说明本发明更加准确，且操作更加简便。表I血球板计数法与本实施例方法(加入250mg/L脱氧胆酸钠)的活孢子含量测定结果比较
权利要求
1.一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，包括下列步骤 (1)在真菌培养基中加入以重量计O.25%。 5%。的脱氧胆酸钠，并制备成平板； (2)将真菌微生物农药样品在含重量百分比O.05% O. I %吐温20或O. 05% O. 1%聚乙二醇辛基苯基醚的灭菌水中浸泡20 40min，再振荡20 40min ； (3)将步骤(2)处理后的样品进行倍数梯度稀释，分别将不同稀释度的样品均匀涂布在步骤(I)获得的平板上，室温下培养48 120h，其中，同一稀释度制作至少2个重复样品; (4)统计各平板上的菌落数，其中菌落数在30个 300个的平板为有效计数平板； (5)真菌微生物农药中，活孢子的含量为 C = TXNX10, 式中C是真菌农药活孢子含量，单位为CFU/g ；T是统计平板对应的稀释倍数；Ν是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数。
2.根据权利要求I所述的快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，其特征在于步骤(I)中，所述真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，将培养基高压蒸汽灭菌，待冷却到55 62°C时，向培养基中加入脱氧胆酸钠，制备成平板。
3.根据权利要求I所述的快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，其特征在于步骤(2)中，所述振荡在室温、150rpm的条件下进行。
4.根据权利要求I或3所述的快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，其特征在于步骤(2)中，浸泡时间为30min，振荡时间为30min。
5.根据权利要求I所述的快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，其特征在于步骤(3)中，采用10倍数梯度稀释，同一稀释度制作3个重复样品。
全文摘要
本发明公开了一种快速测定真菌微生物农药中活孢子含量的方法，包括(1)在真菌培养基中加入以重量计0.25‰～5‰的脱氧胆酸钠并制备成平板；(2)将真菌微生物农药样品在含吐温20或聚乙二醇辛基苯基醚的灭菌水中浸泡、振荡；(3)进行倍数梯度稀释，分别将不同稀释度的样品均匀涂布在平板上，室温下培养48～120h；(4)统计菌落数，菌落数在30个～300个的平板为有效计数平板；(5)活孢子的含量为C＝T×N×10，式中C是真菌农药活孢子含量，单位为CFU/g；T是统计平板对应的稀释倍数；N是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数。本发明可以简便快速测定真菌微生物农药的活孢子含量，检测准确度高。
文档编号C12Q1/06GK102899386SQ20121043484
公开日2013年1月30日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者袁善奎, 姜辉, 崔晓岚, 王一喆, 林荣华, 瞿唯钢, 胡承勇, 曲甍甍, 周艳明 申请人:农业部农药检定所