专利名称：一个源于梨孢菌的真菌致病力新基因MgKIN17及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病理学、农药学和微生物基因工程领域，提供了一个来源于梨孢菌的、在侵染器官形成与致病力中起重要作用的新基因MgKIN17的启动子与编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。本发明提供的核苷酸序列和氨基酸序列可以作为靶位点应用于抗真菌药剂的筛选与设计中，也可以利用该核苷酸序列的某一区段作为探针应用于梨孢菌及其它真菌的与该序列具有一定同源性的基因的克隆中。
背景技术：
由梨孢菌(Magnaporthe grisea)引起的稻瘟病是世界性的水稻病害，也是我国水稻的主要病害之一，重病田可导致水稻绝收。该病在我国部分省市几乎每年都有大发生，在全国范围也曾数次大流行。最近的一次全国大面积流行是1993年。当年在全面防治的情况下，稻瘟病仍然导致稻谷减产上百亿斤。2004年，重庆和四川等省市暴发大面积的稻瘟病，仅重庆的合川市(县级市)就有2万亩水稻发生稻瘟病，其中近5000亩水稻绝收，曾作为重要农业问题被报道。除水稻之外，梨孢菌还能侵染包括小麦、大麦以及一些草坪草在内的50多种禾本科植物，导致瘟病。同时，该菌具有许多重要作物的病原真菌所共有的侵染过程，包括分生孢子产生与萌发、附着胞形成、侵入、侵染菌丝的扩展。此外，梨孢菌可进行遗传杂交和转化。为此，许多发达国家的研究者将梨孢菌作为模式病原真菌，正在全面、深入地开展植物病原真菌致病性和致病型变异的分子机理研究，期望通过此类研究来寻找真菌特异性靶标以设计新型农药。
梨孢菌的侵染过程始于分生孢子与寄主表面的接触。在湿润条件下，分生孢子尖端释放尖端粘液(STM)，将分生孢子与基质牢固地连在一起。在适宜的温度下发芽，随后的芽管生长和分化依赖于其所接触表面的理化性质如疏水性、表面硬度、角质单体、蜡质和极性脂类，稻叶表面的这些性质都能诱导附着胞的形成(Dean，1997)。附着胞是芽管特化膨大的半球型侵染结构，附着胞进一步分化产生侵染钉。其中，黑色素在附着胞内外周的沉积和甘油的产生使得附着胞具有巨大的膨压(8.0Mpas或1161Psi；Howard，1991)，从而驱使侵染钉主动刺破寄主表皮，侵入后再从侵染钉上分化出泡状初生侵染菌丝和次生侵染菌丝，在寄主细胞间隙和细胞内蔓延。功能性附着胞的形成是包括梨孢菌在内的许多植物病原真菌侵入植物寄主表皮所必需的，在对病原真菌的致病性中起着决定性作用。
附着胞的发育是一个复杂的分子过程。目前已克隆了不少与梨孢菌附着胞形成有关的基因，包括MPG1(Talbot et.al.1993)、CPKA(Mitchel and Dean，1995)、MAGB(Liuand Dean.1997)、PMK1(Xu and Hamer 1996)、ACR1(Lau and Hamer，1998)、MAC1(Chaoiand Dean 1997)；PTH11(DeZwaan et.al.1999)和CBP1(Kamakura et.al.2002)。其中MPG1、MAGB、PTH11和CBP1等基因产物的功能是感知外界信号，MPG1编码的疏水蛋白与稻叶表面的信号分子互作，将产生的信号传递给MagB编码的异源三聚体G蛋白上的α亚基，G蛋白α亚基激活由MAC1编码的腺苷酸环化酶，从而激活了cAMP信号传导途径(Liu and Dean，1997；Choi and Dean，1997)。cAMP结合PKA的调节亚基，使其释放催化亚基，催化亚基磷酸化下游的目标蛋白。Δcpka突变体的附着胞形成推迟，没有致病性，但能从伤口侵入，引起发病。由PTH11编码的PTH11p也在附着胞形成途径的上游起作用，PTH11p可能刺激细胞内脂类的降解，释放甘油二酯，甘油二酯作为信号分子刺激附着胞的形态建成(DeZwaan et al.，1999)。ACR1缺失突变体的附着胞形成率降低(Lau and Hamer，1998)，PMK1调节附着胞分化的起始(Xu and Hamer 1996)。
此外，还有一些附着胞形成受影响的遗传位点得以鉴定，但基因还未克隆，如CON1and CON7(Shi and Leung 1995)；APF1(Silue et.al.1998)；APP1，APP2 and APP3(Zhuet.al.1996)；APP5(Chun and Lee 1999)。尽管如此，附着胞分化和形成机制仍不明晰。
鉴定、克隆植物病原真菌的致病性和致病力基因，尤其是在侵染器官形成中起重要作用的基因，可为设计、筛选抗真菌药物提供有用的靶标位点(Smith et al，1990；Pollastroet al.，1996；Babiychuk et al.，1995；Vahlensieck et al.，1995；Nistelrooy et al.，1995；Thompson et al.；1997)。目前在有些真菌上已经证明了一些药物的靶位，例如，Botryotiniafuckeliana的Mbc1和Daf1基因产物分别是杀菌剂benzimidazoles和dicarboximide的作用靶点(Pollastro et al.，1996)；S.cerevisiae中的ACC1基因产物乙酰辅酶A羧化酶和Penicillium italicum中的CYP51基因产物脱甲基酶是多肽杀菌剂sorphen A的作用位点(Vahlensieck et al.，1995；Nistelrooy et al.，1995)。三环唑是用于稻瘟病防治的重要杀菌剂，该药剂以梨孢菌的三羟萘还原酶为作用靶位点(Thompson et al.，1997)，抑制功能性附着胞中黑色素的形成。因此，进一步通过分子遗传学研究鉴定、克隆新的在梨孢菌附着胞形成和致病性/致病力中发挥重要作用的基因，可为设计、筛选新型药物提供丰富的靶标。同时，对于其它类似病原真菌的致病机制研究、乃至设计、筛选抗其它真菌的新型杀菌剂亦具很好的参考价值。为此，本发明采用插入突变和基因互补证明了梨孢菌中一个对分生孢子发芽、附着胞和侵染钉形成以及致病力有显著影响的新基因MgKIN17。该基因基因的启动子、编码蛋白的表达和修饰可作为靶标位点，用于新农药的设计和筛选。
发明内容
本发明的目的在于提供一个新的、对梨孢菌等真菌的分生孢子发芽、功能性附着胞和侵染钉的形成以及致病力有重要影响的基因MgKIN17，其特征为如SEQ ID NO1所示的的第1位到第3544位的核苷酸序列。该基因的特征还在于其编码的cDNA和蛋白质分别具有SEQ ID NO2所示的的第1位到第987位的核苷酸序列和SEQ ID NO3所示的的第1位到第328位的氨基酸序列。该基因的启动子特征在于SEQ ID NO4所示的的第1位到第1519位的核苷酸序列。
本发明所提供的基因MgKIN17是所通过插入突变途径从梨孢菌中克隆的。具体过程包括首先，通过筛选梨孢菌REMI转化体库获得致病力降低的突变体；然后，通过遗传杂交和Southrn杂交分析突变表型与插入标记的遗传共分离情况；进一步，通过质粒拯救获得被插入标记破坏的目标基因的侧翼序列，并以该侧翼序列为探针筛选基因组TAC文库获得含有目的基因的克隆；最后，通过适当酶切从TAC克隆中分离目的基因。目标基因的验证和注释分别采用通过互补实验和分离的cDNA来完成。基因启动子测定是将含有推定启动子的全长基因与报告基因GFP连接并转化梨孢菌，通过观察GFP在侵染各个阶段的表达来进行的。
本发明所涉及的梨孢菌REMI转化体库是指通过限制性内切酶介导的质粒整合技术(Restrict Enzyme Mediated Integration，REMI)构建的、含有若干独立转化体的梨孢菌菌株群体。
本发明所涉及的突变体筛选主要通过两个途径来实施的。一是将孢子接种于洋葱表皮上，观察其侵染过程；另一个方面是将孢子接种于水稻叶片上，观察其在感病水稻品种上的致病性的有无或者致病力强弱。对这两方面的测定，本发明都采用了常规的喷雾接种的方法。本发明所获得的突变体在孢子萌发率、附着胞形成率、侵染钉形成率和致病力上与野生型相比，具有明显的缺陷。
本发明中的遗传共分离分析是指分析突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离情况。所采用的方法是遗传杂交的方法。即将此突变体与一个不具有突变表型和潮霉素抗性的、并且交配型相反的菌株进行杂交，分析其各个子囊孢子后代的孢子萌发率、附着胞形成率、侵染钉形成率、致病力与潮霉素抗性。如果其中所有不具潮霉素抗性的后代均为野生型，则说明该突变体的突变表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的，即为插入突变体。
本发明所涉及的Southern杂交分析，是指以插入质粒中的选择标记(在本发明中为潮霉素抗性基因)为探针对所获插入突变体进行基因组Southern杂交，以分析插入质粒在梨孢菌基因组中的插入位点数和拷贝数等整合情况。
本发明所涉及的目的基因克隆，首先是根据遗传共分离分析和Southern杂交分析结果进行目标插入位点进行质粒拯救。具体地，选取适当的限制性内切酶消化突变体基因组DNA，对含有插入质粒和部分侧翼序列的DNA片段进行自身环化、连接，并转化大肠杆菌，以获得并测定在插入位点侧端的基因组序列。进一步，以所获侧翼序列为探针筛选梨孢菌的基因组文库。本发明中所用的基因组文库为梨孢菌的TAC文库，其平均克隆片段大小为50kb，共覆盖全基因组的16-18倍。本发明中，以侧端序列进行筛库，得到8个阳性克隆，它们都含有如SEQ ID NO1所示的第1位到第3544位的核苷酸序列。
本发明所涉及的MgKIN17的基因功能确认通过互补实验进行的，具体包括互补载体的构建以及将载体导入梨孢菌中，得到梨孢菌的重组转化体。互补载体的构建是指将所克隆的含有目标基因全长的DNA片断与一个带有不同的选择标记(在本发明中为新霉素抗性基因)的载体相连。在本发明中，将外源载体导入梨孢菌优选方法是原生质体转化，实验者也可以根据自己的熟练程度灵活地选用其他的转化方法。在本发明中，互补载体所导入的梨孢菌菌株是本发明所得到的插入突变体，互补载体在该突变体基因组中的异位整合使该突变体的突变表现恢复正常。
本发明还提供了MgKIN17的cDNA克隆。该cDNA克隆过程包括提取含有目标基因MgKIN17的一段基因组核苷酸序列，利用FGENESH(http//www.softberry.com/berry.phtml)和GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行编码区、启动子和加尾位点的预测。根据预测的编码区序列，设计引物(图7)，并通过PCR从梨孢菌侵染的水稻叶片的cDNA文库扩增获得，其序列如SEQ ID NO2所示。
本发明还提供了MgKIN17所编码的蛋白质，其具有如SEQ ID NO3所示序列或与SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的氨基酸序列。该蛋白可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。本发明提供了小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Giberella monilliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)中与MgKIN17具有40％氨基酸序列一致性的同源蛋白质的氨基酸序列。
本发明所涉及的基因其插入突变导致梨孢菌分生孢子萌发率、附着胞形成率和侵染钉形成率降低，并且在感病水稻品种上的致病力显著减弱。因此，本发明最重要的用途是应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物；或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰或阻断其的核定位的化合物；从而开发新型的抗真菌的药物。此外，本发明的用途还包括以该基因的DNA或cDNA的某一区段作为探针、或根据该基因的DNA或cDNA的序列设计引物通过PCR在梨孢菌中再分离该基因，或者在其它真菌中分离的、与该基因具有一定序列同源性的序列。
以上述所克隆基因编码蛋白的表达、修饰为靶标，设计、筛选新型抗真菌药物，或者以具有如SEQ ID NO3所示序列或与SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下蛋白的表达，均属于本发明的保护范围之内。
以上述所克隆基因的启动子为靶标，设计和筛选新型抗真菌药物，也属于本发明的保护范围之内。
以下通过
以更进一步理解本发明。
附图1.野生菌株P131与突变体H680及互补转化体在水稻感病品种梅雨明上的致病性比较。图示说明左为互补转化体HC2，中为野生型P131，右为突变体H680。接种孢子浓度为5×105/ml，接种后96小时拍照。
附图2.野生菌株P131与突变体H680在载玻片上的附着胞形成率的比较。图示说明右为突变体H680，左为野生型P131。
附图3.互补载体pKN3.5构建示意图。
附图4.野生菌株P131与突变体H680及互补转化体HC3在洋葱内表皮上同期附着胞形成比较。图示说明左上，野生型P131；左下，互补转化体HC3；右，突变体H680。
附图5.互补转化体HC2、突变体H680与P131在洋葱表皮上的的孢子萌发率、附着胞形成率和侵染钉形成率的比较。图示说明上，接种后2-24hr的分生孢子萌发率；中，接种后4-48hr的附着胞形成率；下，接种后4-72hr的侵染钉形成率；调查孢子总数为100。
附图6.质粒插入破坏MgKIN17位置示意图。黑线表示MgKIN17基因，红线表示插入质粒pUCATPH，REMI转化的介导酶为HindIII，质粒插入的位置为1345bp。
附图7.cDNA扩增示意图。图示说明上为扩增引物；下为各引物在DNA片段上的匹配位置，绿色部分为cDNA区域。
附图8.MgKIN17基因编码蛋白的核定位分析。图示说明左列为明视场所拍摄，中间列为暗视场蓝光下所拍摄，右列为明暗视场所拍摄照片叠加图。
附图9.MgKIN17在侵染过程中的表达情况上排为明视场所拍摄，下排为暗视场蓝光下所拍摄。
附图10.几种病原真菌中KIN17蛋白的序列比较。图示说明MgKIN17、GzKIN17、GmKIN17、SsKIN17、BcKIN17和PnKIN17分别为来自梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Giberella monilliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)中的KIN17蛋白。
具体实施方案为了更好的理解本发明，以下通过实施例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。
实施例1突变体的筛选与鉴定。
a.分生孢子的制备将充分打断的梨孢菌菌丝均匀地涂布到燕麦片培养基平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，单层纱布盖上于26℃-28℃光照培养48小时左右。
b.孢子悬浮液制备将(1)所述的孢子洗下后用双层擦镜纸过滤于50ml的离心管中，4000rpm室温离心5分钟收集孢子，然后悬浮于0.25‰的吐温20中。利用血球计数板和显微镜，调整分生孢子浓度至每毫升104孢子。
c.致病性的测定分别将野生型菌株和突变体的孢子悬浮液均匀地喷雾接种于五叶一心期水稻幼苗(各20株)的叶片正面，黑暗、保湿培养36后连续光照，于接种96小时后，统计每个叶片5cm长度内的感病病斑数，结果如表1。用同样的方法制备分生孢子的悬浮液，调整分生孢子浓度到每毫升5×105孢子，均匀地喷雾接种于新鲜的洋葱内表皮的正面，共约喷雾5-10ml孢子悬浮液，于显微镜下观察分生孢子的萌发、附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成等过程，并计算分生孢子的萌发率，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成率(结果见附图4和5)。
表1 突变体H680与野生型P131在水稻叶片上形成的病斑数比较
实施例2.突变体表型变化与插入标记共分离分析。
将上述突变体H680与不具有潮霉素抗性，致病性正常的菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至菌落边缘即将接到一起，然后将其移至20℃光照培养，约20天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊内子囊孢子萌发的单根菌丝于西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和洋葱表皮上观察记载孢子萌发率和附着胞、侵染钉和侵染菌丝形成率。结果如表2所示，所有对HygB敏感的21个子囊孢子后代均表现野生型表型，相对应的是，所有8抗潮霉素的子囊孢子后代均表现为突变体表型，由此推测，H680的突变表型与HygB抗性共分离，而且是质粒单位点插入造成的。
表2 突变体H680的突变表型与HygB抗性共分离分析
注HygBr抗HygB；HygBs不抗HygB；实施例3 与梨孢菌附着胞形成有关的基因的克隆。
1.质粒拯救。选取插入质粒pUCATPH中没有酶切位点的限制性内切酶完全消解突变体的基因组，乙醇沉淀精制后进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞。酶切鉴定重组转化体的质粒，该质粒中除含有pUCATPH的序列外，其两侧还带有部分基因组的序列。将这两段毗邻插入位点的序列与梨孢菌数据库比较，判断被破坏的基因(图6)。
2.基因组TAC文库的筛选用所拯救质粒中带有的部分基因组序列为探针，筛选梨孢菌的基因组TAC文库获得8个阳性克隆，它们都包括所需基因的全长，其序列如SEQ ID NO1所示。
3.MgKIN17cDNA的克隆取保存于4℃的梨孢菌侵染的感病水稻叶片cDNA文库，吸取5ml抽提λDNA，异丙醇沉淀精制，根据预测的基因序列合成引物，扩增基因ORF。其序列如SEQ ID NO2所示。
实施例4互补载体转化梨孢菌与互补转化体的致病性测定梨孢菌的转化采用原生质体转化。采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将互补载体线性化，转化梨孢菌的原生质体。原生质体的制备和转化方法如下1.原生质体的制备。500ml三角瓶装入150mlCM培养基(Yeast extract 0.1％，Caseinenzymatic hydrolysate 0.05％，Casein acidic hydrolysate 0.05％，glucose 1％，CaNO3·4H2O0.1％，KH2PO40.02％，MgSO4·7H2O 0.025％，NaCl 0.015％)，接入约106个分生孢子，在26-28℃、100rpm条件下摇培30-32h，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7MNaCl溶液洗涤后转移至灭菌的50ml离心管中，每1g菌丝加入1ml的酶渗透液(含20mg/ml driselase，用0.7M NaCl配制)，26-28℃、100rpm条件下酶解3～4h后，用0.7M NaCl洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000rpm离心15min，先用25ml STC(1.2M Sorbitol，10mM Tris-pH 7.5，50mM CaCl2)洗涤原生质体一次，然后分别用10ml STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5～1×108个/ml。
2.梨孢菌转化将原生质体分装于灭菌的50ml离心管中，每管150μl，加入等体积的线性化的载体(约2ug)和STC混合液，冰上放置20min，然后逐滴缓慢加入2ml/管PTC溶液(60％Polyethylene glycol 3350，10mM Tris-pH 7.5，CaCl250mM)，冰上静止20min，加入25ml/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000rpm、4℃离心15min，去上清，然后每管加入3ml的LR培养基(0.1％Yeast extract，0.1％Casein enzymatic hydrolysate，1MSucrose)，室温静置培养12～13h后，转入培养皿，加入约12ml冷却至50℃左右的SR(LR+1.6％agar)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12ml的0.7％Top agar(冷却至50℃左右，含400μg/ml的Neomycin)。28℃培养4～6天，将出现的转化体转至CM培养基(含350μg/ml的Neomycin)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。
3、致病性测定分别将野生型菌株、突变体和互补转化体的孢子悬浮液均匀地喷雾接种于五叶一心期水稻幼苗的叶片正面(每菌株接种20株)，黑暗、保湿培养36后连续光照，于接种96小时后，统计每个叶片5cm长度内的感病病斑数，结果如表3。用同样的方法制备分生孢子的悬浮液，调整分生孢子浓度到每毫升5×105孢子，均匀地喷雾接种于新鲜的洋葱内表皮的正面，共约喷雾5-10ml孢子悬浮液，于显微镜下观察分生孢子的萌发，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成等过程，并计算分生孢子的萌发率，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成率(结果见图5)表3 突变体H680、互补转化体HC3和野生型P131在水稻叶片上形成病斑数比较
实施例5MgKIN17的亚细胞定位将GFP基因的完整阅读框连接于MgKIN17基因的编码框的下游，构建融合基因并导入到带有新霉素磷酸转移酶基因的载体中。按实施例4中所述转化方法，采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将此载体线性化，转化梨孢菌野生型菌株P131的原生质体。挑取具有新霉素抗性的转化子在荧光显微镜下观察MgKIN17-GFP融合蛋白在梨孢菌分生孢子中亚细胞定位，结果表明MgKIN17定位于细胞核内(附图8)。
实施例6MgKIN17的启动子界定与表达动态分析为确定MgKIN17基因的启动子区域和表达动态，将推定的含有启动子的完整MgKIN17基因去掉翻译终止密码子(2504bp)以后的DNA序列并与-GFP报告基因融合，然后连入到带有新霉素磷酸转移酶基因的载体中。按实施例4中所述转化方法，采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将此载体线性化，转化梨孢菌野生型菌株P131的原生质体。挑取具有新霉素抗性的转化子接种洋葱内表皮，接种后不同时间连续观察GFP蛋白的表达情况。结果证明在翻译起始位点上游1519bp长度的DNA片段具有驱动MgKIN17-GFP融和基因在分生孢子、成熟但未褐色化的附着胞、侵染钉以及初生侵染菌丝中的表达(附图8和附图9)。MgKIN17基因启动子序列如SEQ ID NO4所示。
实施例7病原真菌中KIN17蛋白的生物信息学分析为明确KIN17蛋白在病原真菌中是否保守，针对下述病原真菌玉米茎腐病菌(Giberella monilliformis)、小麦赤霉菌(Giberella zeae)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)，将MgKIN17蛋白的氨基酸序列对这些真菌基因组序列进行tBLAST检索，获得与之同源的DNA片段。进而通过序列拼接、软件预测，分别得到其在上述真菌中同源蛋白的氨基酸序列，其序列分别如SEQ ID NO5、6、7、8和9所示，并将对应的KIN17蛋白分别命名为GmKIN17、GzKIN17、PnKIN17、SsKIN17和BcKIN17。序列比较分析表明上述真菌中的KIN17蛋白在氨基酸序列上与MgKIN17的一致性分别达到60％、61％、42％、56％和50％。利用ClustalW，绘制的上述真菌的KIN17蛋白的同源性关系见附图10。
序列表<110>中国农业大学<120>一种源于梨孢菌的真菌致病力新基因MgKIN17及其用途<130>彭友良2003-2<160>9<210>1<211>3354<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>1agctcctcgt acttgttctg gatggccgtg cccgtcaagc cgatgcgaca gagtgcgttg 60acctcagtca ttgcttttgt gatctcggat cgtcgctcct tgatattatg acattcgtcg 120acaaccacgg catcccagct gaccgtgttt acgcgctctt tctgcagcct gtacgtggcc 180ggggtcgtaa gcatgacctc aagccgacct gactttgcgg tgtcaagcac atcgtctttg 240ccgggtccat gataggactc gaccttccac cagccccatc gcgccagttc ttgtctccag 300ttctccatta cggagctggg gcagacaacc agcactttgt agtaccggcg acccagcctc 360ttgaccttgc gcatccgctt cgagtcacga aaatcaccgg ttttcccgaa tgcagctgtc 420aggaacgcag caacctgaac cgtcttgccc agtcccatgt catcgccgag aatgcatccc 480ctctggtaga cgaatgcctc atgcatgaaa gaaacgccgt cgacctgata atcacgtagg 540tactgggcta ttggtgccgg tatgatacct gctgaccttt ctagctcgac gtcctcatac 600ggtcgacatg gcttgattct atcgccaaactgtggtcgga cctctcgtcg ctggccatca 660tcttcatcat cagtgaagtc aatgtccgtg tagtccggtg gaagaagcaa cccggcttct 720tggagagttg cgcggtcccg gttgaactgc ctcttgcggt gctttaaata ctctgggata 780tcagcatgga cgttgtcctc tggcgccgta tcctcgccga gatccctaat cgcttcggcc 840aaggaacgtg cgtttcgtcg tccatgattg gtaatagcgt ttccaggttc agacttgatg 900cttttctttt tcttcgcact acgtcttccc tttgcttgtt tcttctcagt ccgttccttc 960tcggcctcct cctccgagtc cgtccacgga atagtctcaa ttggcggggg cacaggctcg 1020gctttgcgct taccaagtgc cgtcttggaa catcggtcgg caccaaggcc cttgccttct 1080gattccgaac tgtctatcac gactaattcc gcaggcattg ttatgcatga ttgttgatat 1140gaacgcgggg tagacgaaac caaatgaggg atgacgcgtc tatcgtttaa ttgaaaacac 1200gcgagagcag gtgagcgcgc gaaagttcgg ttggtcgcat cggtgagacc cactgattca 1260cccgcattag tggggctacg tcggttttgc ctgcaacgga acctccgccg ttccctttgt 1320gtcttgtcgc cgcaactttg gctcaagctt gcagccacga tctattgcaa ggcgtcctga 1380caaccaagtt tccggaatct gaaatcgaca ccatcgtaaa cgccaccaca gacgcattgg 1440
tcaactttgt ccttgccaga acctctatca atcccactcg tctatcccga aaaaagaaaa 1500ccagacccag tcacccaaaa tggggaaagc agagttcggc acgaccaagc atctgagcaa 1560ccagatgaag gccaaaggcc ttcagcggct tcgcttctac tgcacgccat gccagcgtca 1620gatgcgcgac gacaacgcct tcaagcagca ctgcatgagc gagtctcacg tgcgcaacat 1680gctcattgtg ggcgaggacc cgaagaagta catccgcgag tacagcgagg ccttcctcaa 1740ggactttgtc aacctgctca agacgggcca ccgcgacaag caggtccaga tcaaccactt 1800ctaccaagag tacatagcca acaaggagca cgtccacatg aacagtaccc agtggtccag 1860tctgacagag tttgccaaat accttggtaa ggagggcata tgtcgcgttg aggagaacga 1920gaagggcatc cacatatcct ggatcgacga ctcgcccgag gcgctcaaga ggcaggaggc 1980gcttaagcgg aaagaggcgc aggacagggg cgacgaggag cgagagcagc gcttgctgaa 2040ggagcagata aagcgcgcgc agaaggatgc cgccgctcga gcggccgggg agaatggcgc 2100atcaacagag caagaccagg aggacaaggg gttgcgacgg gaagaaggcg agaagatcaa 2160actgtctatt ggggttaagc ctgcagccag caaaccggaa cccgcaccgg tagagcagcc 2220cgcagctgca actcttgacg aagaaacccc agcaactgga gaggccaagt tggcggaagc 2280gactacagat tccaagcctg tatcgctgaa gtttggagcc aaaccagctg ccaagaatgt 2340ctttgcctcc aagaaaaacg ctttttcaag cggcgcaaag aaagttaaga ttgagcagcc 2400caaaaagata agtgaggcag agaggataat gcgcgaggag atggggcgca agaggtcaag 2460agagttttct ggttcagggg gccctagtaa acgccaaagg atgtaaagtc tttctttttt 2520ttcgtaacgg tttttatagg cctggagtct ggcggcgtta atattctcag ttctataccc 2580atgggcgcct ctcgcggggt ttgtatggtc caaccaaagt tatatagagg ggaaggaaga 2640taagacatga caatgaaaag cataatcata atcatatcac ctgcgagcgc aaatcttgaa 2700tgttgacgag tcaaattgaa tgccaactag gtttattcgc taagcactta aatcccagac 2760ccagactcct tgccgatccc ataaaaaaac accatctcaa acacttaaac gtctgcctct 2820gtggcacttc catcacggct aaagattgaa aatagcgtta gcaggtacct ccagcaacat 2880taaacaaaac aagtaggaca gtcgacaaac atacgggatg tactgtatcc tatactcgtc 2940ctcgatcgta gccctaacat catccggcag ctggccagag accttgatgg cataaacccc 3000cctgacgtag ccgtccagcc gctgccactt tgcgacccaa gactttgtcg ggtcggccag 3060cgagatcagg ccctcgaaaa cctgcgacgt gcagctctcg atctggtccg tcgagccctg 3120aaggtgcagg aagtcttcac agttggggca cccctcatcg tagaagcgct acgtggcaaa 3180aggtcagcga ctgggttctg ttctgtgcct ggttgttcga cgggtggttg ttttgcgcgc 3240gtgaacaaaa ccgttggcgc ggttgtttat cgacaaggtc aataaaaccg ggcaacctta 3300ccttttggtg aacaacaatc gagcagacca tgcatgcgcg taaatggcgc tgatctctgg 3360gtgcgacgta gctctcggac atggcgatgg tgttgctctt gtggttttgc gacaacccgg 3420aaatgctaaa tgcgacaact tgggaaaacg agtgaaagtg gtttggggaa cgaatcttaa 3480cgatgctggc agcttcaagg aatcttgact acatatggat cgaatgatgg ctggtggggc 3540tagc 3544
<210>2<211>987<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>2atggggaaag cagagttcgg cacgaccaag catctgagca accagatgaa ggccaaaggc60cttcagcggc ttcgcttcta ctgcacgcca tgccagcgtc agatgcgcga cgacaacgcc 120ttcaagcagc actgcatgag cgagtctcac gtgcgcaaca tgctcattgt gggcgaggac 180ccgaagaagt acatccgcga gtacagcgag gccttcctca aggactttgt caacctgctc 240aagacgggcc accgcgacaa gcaggtccag atcaaccact tctaccaaga gtacatagcc 300aacaaggagc acgtccacat gaacagtacc cagtggtcca gtctgacaga gtttgccaaa 360taccttggta aggagggcat atgtcgcgtt gaggagaacg agaagggcat ccacatatcc 420tggatcgacg actcgcccga ggcgctcaag aggcaggagg cgcttaagcg gaaagaggcg 480caggacaggg gcgacgagga gcgagagcag cgcttgctga aggagcagat aaagcgcgcg 540cagaaggatg ccgccgctcg agcggccggg gagaatggcg catcaacaga gcaagaccag 600gaggacaagg ggttgcgacg ggaagaaggc gagaagatca aactgtctat tggggttaag 660cctgcagcca gcaaaccgga acccgcaccg gtagagcagc ccgcagctgc aactcttgac 720gaagaaaccc cagcaactgg agaggccaag ttggcggaag cgactacaga ttccaagcct 780gtatcgctga agtttggagc caaaccagct gccaagaatg tctttgcctc caagaaaaac 840gctttttcaa gcggcgcaaa gaaagttaag attgagcagc ccaaaaagat aagtgaggca 900gagaggataa tgcgcgagga gatggggcgc aagaggtcaa gagagttttc tggttcaggg 960ggccctagta aacgccaaag gatgtaa 987<210>3<211>328<212>PRT<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>3Met Gly Lys Ala Glu Phe Gly Thr Thr Lys His Leu Ser Asn Gln Met1 5 10 15Lys Ala Lys Gly Leu Gln Arg Leu Arg Phe Tyr Cys Thr Pro Cys Gln20 25 30
Arg Gln Met Arg Asp Asp Asn Ala Phe Lys Gln His Cys Met Ser Glu35 40 45Ser His Val Arg Asn Met Leu Ile Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Arg Glu Tyr Ser Glu Ala Phe Leu Lys Asp Phe Val Asn Leu Leu65 70 75 80Lys Thr Gly His Arg Asp Lys Gln Val Gln Ile Asn His Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ala Asn Lys Glu His Val His Met Asn Ser Thr Gln Trp100 105 110Ser Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys Tyr Leu Gly Lys Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Asn Glu Lys Gly Ile His Ile Ser Trp Ile Asp Asp130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Lys Arg Gln Glu Ala Leu Lys Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Arg Gly Asp Glu Glu Arg Glu Gln Arg Leu Leu Lys Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Lys Asp Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gly Glu Asn180 185 190Gly Ala Ser Thr Glu Gln Asp Gln Glu Asp Lys Gly Leu Arg Arg Glu195 200 205Glu Gly Glu Lys Ile Lys Leu Ser Ile Gly Val Lys Pro Ala Ala Ser
210 215 220Lys Pro Glu Pro Ala Pro Val Glu Gln Pro Ala Ala Ala Thr Leu Asp225 230 235 240Glu Glu Thr Pro Ala Thr Gly Glu Ala Lys Leu Ala Glu Ala Thr Thr245 250 255Asp Ser Lys Pro Val Ser Leu Lys Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Lys260 265 270Asn Val Phe Ala Ser Lys Lys Asn Ala Phe Ser Ser Gly Ala Lys Lys275 280 285Val Lys Ile Glu Gln Pro Lys Lys Ile Ser Glu Ala Glu Arg Ile Met290 295 300Arg Glu Glu Met Gly Arg Lys Arg Ser Arg Glu Phe Ser Gly Ser Gly305 310 315 320Gly Pro Ser Lys Arg Gln Arg Met325<210>4<211>1519<212>DNA<213>Magnaporthe grisea<400>4agctcctcgt acttgttctg gatggccgtg cccgtcaagc cgatgcgaca gagtgcgttg60acctcagtca ttgcttttgt gatctcggat cgtcgctcct tgatattatg acattcgtcg 120acaaccacgg catcccagct gaccgtgttt acgcgctctt tctgcagcct gtacgtggcc 180ggggtcgtaa gcatgacctc aagccgacct gactttgcgg tgtcaagcac atcgtctttg 240ccgggtccat gataggactc gaccttccac cagccccatc gcgccagttc ttgtctccag 300ttctccatta cggagctggg gcagacaacc agcactttgt agtaccggcg acccagcctc 360ttgaccttgc gcatccgctt cgagtcacga aaatcaccgg ttttcccgaa tgcagctgtc 420
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Ser His Val Arg Gln Met Leu Leu Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Lys Ser Tyr Thr Gln Gln Phe Gln Ser Asp Phe Leu Gln Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Gly His Gly Glu Lys Gln Val His Ile Asn Gln Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Arg Asn Lys Glu His Ile His Met Asn Ala Thr Ser Phe100 105 110Ala Ser Leu Thr Glu Phe Ala Lys His Leu Gly Arg Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Asn Asp Lys Gly Ile His Ile Ala Trp Ile Asp Arg130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Glu Ala Leu Arg Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Gln Gly Asn Glu Glu Ile Glu Gln Arg Met Ile Arg Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Ala Thr Ala Gly Ser Arg Glu Glu Glu Lys Glu180 185 190Glu Asp Asn Glu Ala Arg Glu Leu Lys Arg Gln Glu Gly Glu Lys Ile195 200 205Lys Leu Ser Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Ser Glu Thr Lys Ser Ser210 215 220Glu Ser Pro Ala Leu Asp Met Thr Ala Pro Glu Ala Glu Ser Ser Lys
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35 40 45Ser His Val Arg Gln Met Leu Leu Val Gly Glu Asp Pro Lys Lys Tyr50 55 60Ile Asn Asp Tyr Thr Lys Gln Phe Leu Ser Asp Phe Ile Leu Leu Leu65 70 75 80Arg Thr Gly His Gly Glu Lys Gln Val His Ile Asn Arg Phe Tyr Gln85 90 95Glu Tyr Ile Ala Asn Lys Glu His Ile His Met Asn Ser Thr Lys Phe100 105 110Gly Ser Leu Thr Glu Leu Ala Lys His Leu Gly Arg Glu Gly Ile Cys115 120 125Arg Val Glu Glu Thr Glu Lys Gly Ile His Ile Ser Trp Ile Asp Lys130 135 140Ser Pro Glu Ala Leu Arg Arg Gln Asp Ala Leu Arg Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gln Asp Gln Gly Asn Glu Glu Leu Glu Gln Arg Met Ile Arg Glu Gln165 170 175Ile Lys Arg Ala Gln Ala Ala Ala Gly Asn Asp Glu Glu Lys Glu Glu180 185 190Asp Pro Glu Ala Arg Glu Leu Lys Arg Gln Glu Gly Glu Lys Ile Lys195 200 205Leu Ser Phe Gly Ala Lys Pro Ala Ala Pro Asp Thr Lys Ala Ser Glu210 215 220
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Leu Glu Thr Ala Lys Asp Glu Asp Lys Leu Ser Glu Ile Pro Ala Thr225 230 235 240Gly Asp Asp Arg Thr Thr Glu Ser Thr Asn Pro Glu Ala Ala Pro Pro245 250 255Ala Pro Ala Lys Val Ser Leu Lys Met Gly Phe Gln Ser Lys Pro Lys260 265 270Asn Val Phe Ala Ala Ala Lys Lys Asn Ala Leu Gly Gly Lys Lys Ala275 280 285Pro Ala Phe Glu Pro Pro Lys Lys Met Ser Glu Ala Glu Arg Ile Met290 295 300Lys Ala Thr Arg Asn30权利要求
1.一个在梨孢菌致病力中起重要作用的基因MgKIN17，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO1所示的第1位至第3544位的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其cDNA序列为SEQ ID NO2所示的第1位至第987位的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的cDNA序列，它编码具有SEQ ID NO3所示的第1位到第328位的氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的核苷酸序列，其启动子的其核苷酸序列为SEQ IDNO4所示的第1位至第1519位的核苷酸序列
5.根据权利要求1和2所述的对梨孢菌致病力有重要影响的基因MgKIN17及其cDNA的全长核苷酸为探针或根据其设计引物通过PCR分离源于其它植物病原真菌的具有相同功能的基因。
6.利用权利要求3所述的对梨孢菌致病力有重要影响的蛋白MgKIN17，分离源于其它植物病原真菌的具有相同功能的蛋白。
7.权利要求5和6所述的真菌包括小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等。
8.利用权利要求1至4所述的对梨孢菌致病力有重要影响的基因MgKIN17构建的表达载体、细胞系和宿主菌。
9.权利要求1所述对梨孢菌致病力有重要影响的基因MgKIN17的表达作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的应用
10.权利要求3所述的对梨孢菌致病力有重要影响的MgKIN17蛋白的表达与修饰作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的应用
11.权利要求4所述MgKIN17基因的启动子及其结合蛋白作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的应用。
12.权利要求9至11所述的抗真菌药剂包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的药剂。
全文摘要
本发提供了一个源于梨孢菌的新基因MgKIN17，其特征是具有SEQ ID NO1所示的第1位到第3544位的核苷酸序列，其cDNA和启动子的特征是具有SEQ ID NO2和NO4分别所示的核苷酸序列。该基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。本发明通过插入突变和基因互补证明该基因的破坏导致梨孢菌侵染器官形成和在水稻上形成病斑的能力显著降低。小麦赤霉菌、玉米茎腐病菌、油菜菌核病菌、灰葡萄孢菌、小麦颖枯病菌等病原真菌具有与MgKIN17一致性高于40％的同源蛋白，可能具有相似的生物学功能。本发明所提供的基因及其蛋白质的表达和修饰可作为靶位点用于设计和筛选抗真菌药剂。
文档编号C07K14/37GK1821409SQ20051010254
公开日2006年8月23日 申请日期2005年9月12日 优先权日2005年9月12日
发明者彭友良, 丁胜利, 黄俊丽, 魏士平, 赵文生 申请人:中国农业大学