一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用
【专利说明】一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防 中的应用 发明领域
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，具体的说，本发明涉及一种交织枝顶孢菌及其在 番茄根结线虫病生防中的应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 番茄根结线虫病是一种严重危害番茄品质和产量的土传性病害。根结线虫主要侵 染番茄根部，尤其侧根受害多。根上形成很多近球状瘤状物，似念珠状相互连接，初表面白 色，后变褐色或黑色，地上部表现萎缩或黄化。线虫以成虫或卵在病组织里或以幼虫在土壤 中越冬。病土和病肥是发病主要来源。该线虫发育适温25-3CTC，幼虫遇低温失去活动能 力，48-60°C经5分钟致死，在土中存活一年，2年即全部死亡。番茄根部被破坏，影响正常的 吸收机能，所以地上部生长发育受阻，轻者症状不明显，重者生长缓慢，植株比较矮小，生育 不良，结果小而且少。在中午气温较高时，地上部植株呈萎蔫状态；早晚气温较低或浇水充 足时，暂时萎蔫又可恢复正常。随着病情的发展，植株逐渐枯死。
[0003] 根结线虫防治以化学防治为主，不仅破坏土壤生态环境，还对人体健康造成影 响。化学防治带来的环境污染和农药残留问题严重制约我国番茄产业的发展，生物防治 具有环境相容性、绿色环保性特点，具有广阔的应用前景。近年来，番茄根结线虫生防 菌的筛选受到关注。人们分离到多种根结线虫生防菌，如厚垣孢普可尼亚菌（Pochonia chlamydosporia)、尖抱枝抱(Cladosporiumoxysporum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和绿色木霉（Trichodermaviride)等。这些生防菌通过寄生线虫或卵块、分泌 杀线虫活性物质来抑制根结线虫，但在田防效不佳，主要由于这些生防菌不能在土壤中定 殖。植物内生真菌可产生杀线虫活性的次生代谢产物直接作用于线虫。内生真菌能定殖于 植物体内，在与其他土壤微生物竞争中具有优势，能够以"守株待兔"的方式防治线虫，具有 靶向性，极具开发潜力。
【发明内容】
[0004] 针对现有根结线虫生物防治技术未有良好生防菌的现状，本发明旨在提供一种番 茄内生真菌交织枝顶孢及其作为番茄根结线虫生防菌的应用。通过试验验证，采用本发明 提供的交织枝顶孢对防治番茄根结线虫具有良好效果。这对于进一步减少农药用量，提高 番茄品质，促进我国的番茄产业向着绿色无公害方向发展具有重要意义。
[0005] 本发明的技术方案：通过从多年种植番茄大棚内感染根结线虫的番茄根结中分离 内生真菌，获得较强抑制根结线虫活性的菌株，经过进一步筛选，获得一株编号为TEF。通过 对菌株进行形态特征和18SrDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分离地位；同时 对该菌株的发酵液对根结线虫二龄幼虫致死率，菌株孢子悬浮液对番茄根结数量、土壤中 根结线虫虫口数量以及田间防效等进行了全面系统研究，为番茄根结线虫的生物防治提 供了新选择，其拮抗作用对于番茄根结线虫的解决具有突出的技术效果。
[0006] 本发明提供的一种作为番爺根结线虫生防菌的交织枝顶孢（Acremonium implicatum)。通过在北京顺义地区种植番茄的大棚内番茄根结中分离、筛选和培养，获得 一批作为番爺根结线虫拮抗菌的微生物菌株。从中筛选出一株编号为TEF的菌株，对于番 茄根结线虫具有稳定而显著的拮抗效果，经微生物学分类与鉴定，属于交织枝顶孢菌。
[0007] 具体的，本发明提供的一种作为番茄根结线虫生防菌交织枝顶孢，命名为TEF。该 菌株已于申请日前保藏于约布达佩斯条微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮编：100101。保藏日期2013. 10. 9,保藏号是CGMCCN0. 8300。经微生物学鉴定为交织 枝顶孢。该菌株最适生长条件为：温度25°C，培养基（PDA)为马铃薯粉0.6% (w/v)，葡萄 糖1.5-2%(?八)，琼脂1.5-2%(￥八)，口117.0-7.2，1211：灭菌20分钟。在？0六培养基平板 上，25°C，培养7天后，菌株TEF菌落直径为18-25mm，菌丝白色，菌落中央产生气生菌丝，瓶 梗长度5-10ym，基部宽1. 5?2. 0ym，顶部宽0? 5?1ym。分生孢子串生于瓶梗上，形成 长链。分生孢子单胞，椭圆，平滑，大小4. 4?5. 2X1. 4?2.Oilm。未见厚垣孢子。依照 《真菌鉴定手册》对菌株TEF形态进行测定，确定该菌株为枝顶孢属（Acremonium)成员。通 过BLAST同源比对，TEF菌株的 18SrDNA序列与Acremoniumimplicatum的 18SrDNA序 列相似性最高，因此将TEF菌株确定为交织枝顶孢（Acremoniumimplicatum)。
[0008] 进一步，本发明一种交织枝顶孢（Acremoniumimplicatum)作为番爺根结线虫生 防菌的应用。
[0009] 本发明进一步提供了菌种的保存条件，采用培养基（PDA)成分：马铃薯粉0.6% (w/v)，葡萄糖 1.5-2% (w/v)，琼脂 1.5-2% ^八），口117.0-7.2，1211：灭菌20分钟。在？0八 培养基斜面上25°C条件下，培养3天，采用10%灭菌甘油作为保护剂，真空冷冻干燥后低温 保存；平时使用保存在PDA培养基斜面上，4°C冰箱保存备用。
[0010] 通过实施本发明具体的
【发明内容】
，可以达到以下有益效果：本发明提供的交织枝 顶孢（Acremoniumimplicatum)是一种根结线虫生防菌，在番爺根结线虫防治方面有较高 的应用价值，尤其是该菌是番茄内生菌，能够持续对根结线虫起作用，克服了一般生防菌不 能在土壤中定殖而造成防效低的缺陷，所以防治效果较好。
【附图说明】
[0011] 图1所示为交织枝顶孢（Acremoniumimplicatum)Tef的菌落形态图。图中，A:菌 落形态，B:瓶梗C:分生孢子，D:分生孢子串生。
[0012] 图2所不为交织枝顶抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA片段PCR扩增 结果图，图中，M指标准DNA序列片段大小。
[0013] 图3所不为交织枝顶抱（Acremoniumimplicatum)Tef的18SrDNA系统发育树图。 图中，Tef指交织枝顶抱（Acremoniumimplicatum)Tef菌株。
[0014] 图4所示为交织枝顶孢（Acremoniumimplicatum)Tef对根结线虫抑制的盆栽效 果图。图中，A为对照，B为交织枝顶孢菌液处理。
【具体实施方式】
[0015] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不局限于下述的实施例。
[0016]本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂盒仪器设备：供试南方根结线虫 (Meloidogyneincongnita)由中国农业科学院蔬菜花舟研究所病害组提供；番爺样品采自 北京市顺义区杨镇蔬菜基地，取番茄根结后，在实验室进行表面消毒，然后分离根结内生真 菌。分离采用马铃薯葡糖培养基（PDA) ;MSSPx-250生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅， 单人双面净化工作台，PCR仪Eppendorf，AllegraX-15R台式冷冻离心机，电泳仪Bio-Rad Mode，凝胶成像仪United-BioGK-330C，真菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技有限公 司），Sigma-Aldrich公司的ReadyMix?TaqPCRReactionMix(含有MgCl2)，其余试剂为 分析纯。
[0017] 本发明中选用的所有原辅材料、试剂盒仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知 的一些试剂盒设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
[0018]实施例一：交织枝顶孢（Acremoniumimplicatum)的分离、筛选及鉴定 [0019] (1)拮抗菌的分离和筛选
[0020] 根结内生真菌分离：取番茄根结组织，用自来水冲洗掉根结表面泥土，然后用无菌 水冲洗3次，75%酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将根结剪成0.5X0. 5cm小块，置于PDA培养基上培养。PDA培养基中含有75yg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长。将 培养基置于25°C培养，待根结小块长出菌落后，分别挑取菌落边缘菌丝到另一PDA平板上， 纯化。最后将纯化的菌株保存备用。
[0021] 菌株发酵液对根结线虫致死活性测定：将菌株接种于含有马铃薯葡糖培养液的三 角瓶中，25°C，震荡培养7天。将发酵液800rmp/min离心2分钟，去除菌丝和孢子，再经细 菌过滤器过滤，得到无菌的发酵液。取根结线虫2龄幼虫虫悬液lml(约含有500头线虫） 加入到4ml发酵液中，25°C静置48小时后，将线虫转移至无菌水中复苏2小时，身体僵直不 活动的线虫为死亡线虫。统计线虫总数量和死亡线虫数量。马铃薯葡萄糖液体培养基作为 对照。计算测试菌株对根结线虫的致死率，筛选致死率高的菌株进行后续试验。
[0022] 根结线虫致死率公式：
【主权项】
1. 一种从番茄根结中分离的，可作为番茄根结线虫生防菌菌株TEF，为交织枝顶孢 (Acremonium implicatum)，2013年10月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号 为 CGMCC NO. 8300。 2?如权利要求1所述的交织枝顶抱（Acremonium implicatum)CGMCC NO. 8300在作为 番茄根结线虫生防菌的应用。
3.如权利要求2所述的交织枝顶孢在防治番茄根结线虫的使用方法，其特征在于： 1) 将交织枝顶孢接种于含有马铃薯葡糖培养液的三角瓶中，25°C，震荡培养7天。 2) 用无菌纱布过滤掉菌丝，留下孢子，用无菌水将孢子配置成孢子悬浮液，浓度为 lX106CFU/ml。 3) 将孢子悬浮液用灭菌草炭进行吸附，制备成菌剂，比例为1000g草炭吸附500ml孢子 悬浮液。 4) 田间施用菌剂采用沟施或穴施，使用量为每垄1000g，垄长10m，垄宽0.6m，种植20 棵番爺植株。
【专利摘要】本发明涉及一种番茄内生真菌交织枝顶孢(Acremonium implicatum)CGMCC NO.8300及其作为番茄根结线虫生防菌的应用，属于生物防治领域。该菌株的发酵液对根结线虫二龄幼虫具有良好的致死活性。菌株孢子悬浮液(浓度为1×106CFU/ml)用灭菌草炭吸附后作为菌剂，比例为1000g草炭吸附500ml孢子悬浮液。移栽番茄前，菌剂沟施或穴施于种植穴。菌剂对番茄根结线虫具有较高的田间防效，达到72.8％。该菌株对于解决番茄根结线虫生物防治具有突出的技术效果，具有广泛的应用领域。CGMCC NO830020131009
【IPC分类】A01N63-04, C12N1-14, A01P5-00, C12R1-645
【公开号】CN104593266
【申请号】CN201310533051
【发明人】谢丙炎, 田雪亮, 姚玉荣, 陈国华, 茆振川
【申请人】中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 河南科技学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年11月4日