专利名称：源于梨孢菌的控制真菌附着胞成熟与致病力的基因MgPTH12及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病理学、农药学和微生物基因工程领域。本发明通过插入突变、基因互补和基因敲除证明了一个源于梨孢菌的控制附着胞成熟和致病力的MgPth12基因。该基因可能编码一个转录因子，其缺失导致梨孢菌对水稻的致病力显著降低。因此，该基因及其编码的功能蛋白的表达可以作为靶位点用于抗真菌药剂的筛选与设计中。
背景技术：
梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亚门的真菌，能侵染水稻、小麦、大麦、粟以及其它多种禾本科植物，导致瘟病。尤其是该菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各个栽培稻区每年均有发生，危害广泛、严重。一般情况下，稻瘟病的危害可使水稻减产5-10％，重病田可导致水稻绝收。稻瘟病在我国曾多次流行，也是我国水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我国发生大流行，在全面防治的情况下仍然减产上百亿斤。2004年，重庆和四川等省市暴发大面积的稻瘟病，仅重庆的合川市(县级市)就有2万亩水稻严重发生稻瘟病，其中近5000亩水稻绝收。梨孢菌还可侵染钝叶草、狗牙草、假俭草等属的草坪草，造成大面积枯死，是草坪草常见病害。
许多植物病原真菌的侵染过程包括分生孢子与寄主表面的接触、孢子萌发、附着胞和侵染性钉形成、侵染菌丝扩展等环节。其中，附着胞是梨孢菌等许多植物病原真菌致病过程中形成的一种侵染必需的结构。梨孢菌附着胞是一种呈半球状、四周沉积着黑色素的侵染结构。黑色素的沉积使得附着胞能承受病菌侵染时由于甘油累积产生的巨大的膨压(8.0Mpas或1161Psi；Howard，1991)，从而驱使侵染钉主动刺破寄主表皮，然后分化出泡状初生侵染菌丝和次生侵染菌丝，在寄主细胞内和细胞间隙蔓延。缺少黑色素沉积的附着胞丧失侵入能力，病原菌从而丧失致病性。
附着胞的发育与成熟是一个极其复杂的过程。目前已克隆的与梨孢菌附着胞形成有关的基因，包括MPG1(Talbot et.al.1993)、CPKA(Mitchel and Dean，1995)、MAGB(Liu and Dean.1997)、PMK1(Xu and Hamer 1996)、ACR1(Lau and Hamer，1998)、MAC1(Chaoi and Dean 1997)；PTH11(DeZwaan et.al.1999)和CBP1(Kamakura et.al.2002)。其中MPG1、MAGB、PTH11和CBP1等基因产物的功能是感知外界信号，MPG1编码的疏水蛋白与稻叶表面的信号分子互作，将产生的信号传递给MagB编码的异源三聚体G蛋白上的α亚基，G蛋白α亚基激活由MAC1编码的腺苷酸环化酶，从而激活了cAMP信号传导途径(Liu and Dean，1997；Choi andDean，1997)。cAMP结合PKA的调节亚基，使其释放催化亚基，催化亚基磷酸化下游的目标蛋白。Δcpka突变体的附着胞形成推迟，没有致病性，但能从伤口侵入，引起发病。由PTH11编码的PTH11p也在附着胞形成途径的上游起作用，PTH11p可能刺激细胞内脂类的降解，释放甘油二酯，甘油二酯作为信号分子刺激附着胞的形态建成(DeZwaan et al.，1999)。ACR1缺失突变体的附着胞形成率降低(Lau andHamer，1998)。PMK1调节附着胞分化的起始，Δpmkl在任何接触面上都不能形成附着胞，直接把孢子注射水稻组织也没有致病性；外源cAMP虽然能使突变体形成附着胞早期的钩状结构，但不能形成成熟的附着胞，也不产生膨压，因而丧失了致病性(Xu and Hamer 1996)。
此外，还有一些附着胞形成受影响的遗传位点得以鉴定，但基因还未克隆，如CON1 and CON7(Shi and Leung 1995)；APF1(Silue et.al.1998)；APP1，APP2 andAPP3(Zhu et.al.1996)；APP5(Chun and Lee 1999)。尽管如此，梨孢菌附着胞分化和形成机制仍不十分明晰。
本发明通过插入突变途径克隆了梨孢菌中一个控制附着胞成熟和致病力的新基因MgPTH2。该基因的缺失导致梨孢菌不能形成正常形态和黑化的附着胞，且显著降低了侵染钉的形成能力，并在感病水稻品种上的致病力显著降低。因此，该基因及其编码蛋白的表达和修饰可作为设计、筛选抗真菌药物的靶标。此外，本发明还发现，小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberellamoniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等植物病原真菌中也存在与梨孢菌MGPTH12在氨基酸序列一致性高于40％以上的同源蛋白，可能具有相似的生物学功能，因此这些真菌中同源蛋白的表达和修饰也可作为靶标筛选抗真菌药物。
发明内容
本发明的旨在以梨孢菌为模式，提供一个新的控制真菌附着胞成熟和致病力的基因。该基因在梨孢菌命名为MgPTH12，其特征为如SEQ ID NO1所示的的第1位到第5526位的核苷酸序列。该基因的特征还在于其编码的cDNA和蛋白质分别具有SEQ ID NO2所示的的第1位到第2164位的核苷酸序列和SEQ ID NO3所示的的第1位到第470位的氨基酸序列。该基因的启动子如SEQ ID NO1所示的的第1位到第1940位的核苷酸序列。MgPTH12编码的蛋白MGPTH12具有Homeobox，但与目前已知功能的蛋白在氨基酸水平上没有明显的相似性。因此，MgPTH12是一个新的基因。
本发明所提供的基因MgPTH12是通过插入突变途径从梨孢菌中克隆的。具体过程包括首先，通过筛选梨孢菌REMI转化体库获得致病力降低的突变体；然后，通过遗传杂交和Southrn杂交分析确定突变体的致病力降低突变表型与插入标记的遗传共分离情况；进一步，通过质粒拯救获得共分离突变体中插入标记的侧翼序列，并以该侧翼序列为探针筛选基因组TAC文库和适当的酶切获得含有目的基因的DNA片段；最后，采用互补实验、敲除实验和分离的cDNA来进行目的基因的功能验证和注释。本发明通过筛选从梨孢菌REMI转化体库获得了一个突变体X3073。
本发明所涉及的梨孢菌REMI转化体库是指通过限制性内切酶介导的质粒整合技术(Restrict Enzyme Mediated Integration，REMI)构建的、含有几万个独立转化体的梨孢菌菌株群体。
本发明所涉及的突变体筛选主要包括两个方面一是将孢子接种于洋葱内表皮上，观察其侵染过程；另一个方面是将孢子接种于感病水稻叶片上，观察其在水稻品种上的致病力。对这两方面的测定，本发明都采用了常规的喷雾接种的方法。本发明所获得的突变体X3073在附着胞形成率、侵染钉形成率和致病力上与野生型相比，具有明显的缺陷。
本发明中的遗传共分离分析是指分析突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离情况。所采用的方法是遗传杂交的方法。即将突变体与一个不具有突变表型和潮霉素抗性的、并且交配型相反的菌株进行杂交，分析其子囊孢子后代的孢子萌发率、附着胞形成率、侵染钉形成率、致病力与潮霉素抗性。如果其中所有不具有潮霉素抗性的后代均为野生型，则说明该突变体的突变表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的，即该突变体为插入突变体。本发明所获得的突变体X3073在附着胞形成率、侵染钉形成率和致病力上的缺陷表型与插入标记是共分离的。
本发明所涉及的Southern杂交分析，是指以插入质粒中的选择标记(在本发明中为潮霉素抗性基因)为探针对所获插入突变体进行基因组Southern杂交，以分析插入质粒在梨孢菌基因组中的插入位点数和拷贝数等整合情况。经分析，本发明所获得的突变体X3073在MgPTH12上具有多拷贝的选择标记的串联插入。
本发明所涉及的目的基因克隆，首先是根据遗传共分离分析和Southern杂交分析结果对目标插入位点进行质粒拯救。首先，选取适当的限制性内切酶消化突变体基因组DNA，对含有插入质粒和部分侧翼序列的DNA片段进行自身环化、连接，并转化大肠杆菌，以获得并测定在插入位点侧端的基因组序列。进一步，用所获侧翼序列为探针筛选梨孢菌的基因组文库。本发明中所用的基因组文库为梨孢菌野生型菌株Y34的TAC文库，其平均克隆片段大小为50kb，共覆盖全基因组的16-18倍。本发明中，以侧端序列进行筛库，得到6个阳性克隆，它们都含有如SEQ ID NO1所示的第1位到第5526位的核苷酸序列。
本发明所涉及的基因功能确认通过互补实验和敲除实验进行，具体包括互补载体、敲除载体的构建以及将载体导入梨孢菌中，得到梨孢菌的重组转化体。互补载体的构建是指将所克隆的含有功能性目标基因全长序列的DNA片断与一个带有新的选择标记(在本发明中为新霉素抗性基因)的载体相连。在本发明中，将外源载体导入梨孢菌优选方法是原生质体转化。在本发明中，互补载体所导入的梨孢菌菌株是本发明所得到的插入突变体X3073。基因敲除载体的构建是指将PCR扩增所得的预测的该基因的两侧翼序列定向连入一个载体中，该载体事先已连入一个新霉素抗性基因，在两侧翼序列之间连入潮霉素抗性基因。基因敲除载体所导入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131，基因敲除载体通过基因两侧的侧翼序列与野生型菌株基因组的相应序列发生同源重组，从而将基因组中相应位点MgPTH12的编码区基因序列与潮霉素基因置换。本发明通过基因互补证明MgPTH12在突变体X3073基因组中的异位整合使该突变体的突变表型恢复正常；同时，基因敲除也证明MgPTH12的编码区基因序列与潮霉素基因序列的置换导致MgPTH12敲除体所产生的附着胞的形态具有与上述突变体X3073一样的表型缺陷。
本发明所提供的控制真菌附着胞成熟与致病力的基因MgPTH12，其特征为具有如SEQ ID NO1所示序列或与SEQ ID NO1具有70％以上序列一致性并具有相似功能的DNA序列，该基因可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本发明还提供了MgPTH12基因的cDNA，其具有如SEQ ID NO2所示序列或与SEQ ID NO2具有70％以上序列一致性并具有相似功能的DNA序列，该基因可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本发明还根据MgPTH12基因的cDNA序列，提供了控制真菌附着胞成熟与致病力基因所编码的蛋白，其特征在于具有如SEQ ID NO3所示序列或与SEQ ID NO3在氨基酸序列上具有40％以上一致性并具有相似功能的蛋白，该蛋白可以源于梨孢菌，也可以源于其它植物病原真菌。
本发明所涉及的基因其插入突变导致梨孢菌不能形成正常形态且黑化的附着胞，并且在感病水稻品种上的致病力显著减弱。因此，本发明最重要的用途是应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物；或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰或阻断其进行细胞定位的化合物；从而开发新型的抗真菌的药物。或者以上述所克隆基因及其编码蛋白的表达为报告基因或蛋白，设计、筛选相关化合物，阻断该基因及其蛋白参与的信号途径，从而开发新型的抗真菌的药物；或者以具有如SEQ ID NO3所示序列或与SEQ ID NO3具有40％以上序列一致性并具有相似功能的蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下蛋白的表达，均属于本发明的保护范围之内。此外，本发明的用途还包括以该基因的DNA或cDNA的某一区段作为探针、或根据该基因的DNA或cDNA的序列设计引物通过PCR在梨孢菌中再分离该基因，或者在其它真菌中分离的、与该基因具有一定序列同源性的序列。
本发明还涉及源于小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等植物病原真菌的、与梨孢菌MgPth12在氨基酸序列上具有高于40％一致性的同源蛋白，它们可能与梨孢菌MgPTH12具有相同的生物学功能。因此，这些同源蛋白及其编码基因的启动子也可作为靶位点，用于设计和筛选抗这些真菌的药物。
以下通过
以更进一步理解本发明。
附图1。野生型菌株P131与突变体X3073、互补转化体CX8、敲除转化体K75附着胞形态比较。图示说明A为P131，B为X3073，C为CX8，D为K75。接种孢子浓度为5×105个/毫升，接种后12小时显微拍照，放大400倍。图示中标尺长度为20微米。
附图2.梨孢菌野生型菌株P131与其突变体X3073在洋葱表皮上不同时间段的附着胞形成率比较。图示说明接种孢子浓度为5×105个/毫升。
附图3.梨孢菌野生型菌株P131与其突变体X3073对水稻的致病力比较。图示说明左为野生型P131，右为突变体X3073。接种孢子浓度为5×105个/毫升，接种后72小时拍照。
附图4.互补载体构建示意图。在PCR正向引物设计酶切SmaI酶切位点5′-GAGCCCGGGATCCATTACAAAA-3′，反向引物设计酶切EcoRI酶切位点为5′-GCAGAATTCAATCGTCAGCAGTAT-3′，从野生菌P131中扩增出5.5kb包含MgPTH12编码区核苷酸序列，连接KN载体，构成互补载体。
附图5.梨孢菌野生型菌株P131与其突变体X3073的互补转化体CX8在洋葱表皮上不同时间段的附着胞形成率比较。图示说明接种孢子浓度为5×105个/毫升。
附图6.梨孢菌野生型菌株P131与其突变体X3073的互补转化体CX8对水稻的致病力比较。图示说明左为野生型P131，右为互补转化体CX8。接种孢子浓度为5×105个/毫升，接种后72小时拍照。
附图7梨孢菌水稻野生型菌株P131 MgPth12基因敲除体的载体构建与证明。左臂正向引物5′-GCGGAATTCTTTGGTATGTG-3′，其5’带有EcoRI酶切位点，反向引物为5′-GTCAAGCTTATCGGAACAGG-3′，其5’端带有HindIII酶切位点；右臂正向引物5′-TAAGTCGACCGATGTTGCTG-3’其5’带有XhoI酶切位点，反向引物为5′-TAGACCGTGCTGCAGATTG-3′，分别连接KN载体，最后在SalI位点连接潮霉素基因，构成敲除载体。下图为敲除体的Southern杂交确认图，左下图为以MgPth12为探针的Southern杂交图，右下图为以置换的潮霉素抗性基因为探针的Southern杂交图。
附图8.梨孢菌野生型菌株P131与其MgPTH12敲除体K75在洋葱表皮上不同时间段的附着胞形成率比较。图示说明接种孢子浓度为5×105个/毫升。
附图9.梨孢菌野生型菌株P131与其MgPTH12敲除体K75对水稻的致病力比较。图示说明左为野生型P131，右为敲除体K75。接种孢子浓度为5×105个/毫升，接种后72小时拍照。
附图10.源于梨孢菌(Magnaporthe grisea，Mg)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae，Gz)、玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformis，Gm)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum，Ss)的PTH12类蛋白的亲缘关系。
具体实施例方式
为了更好的理解本发明，以下通过实施例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。
实施例1突变体的筛选与鉴定。
1、分生孢子的制备将梨孢菌菌株P131的各REMI转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、30-50克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时，在培养基表面即可见大量的梨孢菌孢子。
2.孢子悬浮液制备将1所述的孢子洗下后用双层擦镜纸过滤于50ml的离心管中，4000rpm室温离心5分钟收集孢子，然后悬浮于0.25％的吐温20中。
3.附着胞形态变异突变体的筛选及致病性的测定分别将野生型菌株和突变体的孢子悬浮液均匀地喷雾接种于五叶一心期水稻幼苗的叶片正面，黑暗、保湿培养36小时后连续光照，于接种后72小时统计单位长度叶片的感病病斑数。用同样的方法制备分生孢子的悬浮液，调整分生孢子浓度到每毫升5×105孢子，均匀地喷雾接种于新鲜的洋葱内表皮的正面，共约喷雾5-10ml孢子悬浮液，于显微镜下观察分生孢子的萌发，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成等过程，并计算分生孢子的萌发率，附着胞、侵染钉及侵染性菌丝的形成率。
在放大倍数为10×20的显微镜下观察、比较梨孢菌野生型菌株与REMI转化体的附着胞的形态差异，获得了一个在洋葱表皮上附着胞、侵染钉和侵染性菌丝的比率比野生型的明显降低的突变体X3073。见附图1，其中野生型P131和突变体X3073在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率表1所示。
表1.P131和X3073在接种洋葱表皮后24、36和48小时形成侵染钉和扩展性侵染菌丝的比率
同时，在水稻亲和品种丽江新团黑谷上，突变体的致病力也比野生型的低，野生菌株P131与突变体3073在亲和性水稻丽江新团黑谷叶片上形成病斑情况如图3所示。
实施例2 突变体表型变化与插入标记共分离分析用遗传杂交的方法对突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离进行分析，将突变体与一个不具有突变表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株S1528进行杂交，分析其子囊孢子后代的附着胞形态及潮霉素抗性情况，具体方法如下将上述突变体X3073与不具有潮霉素抗性、附着胞形态正常的梨孢菌菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至菌落边缘即将接到一起，然后将其移至20℃光照培养，约20天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊内子囊孢子萌发的单根菌丝于西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和附着胞形态。结果如表2所示，表明在测定的子囊孢子后代中，附着胞形态正常的后代都不具有潮霉素抗性，说明这个突变体的附着胞形状突变的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。杂交后代中，抗潮霉素的后代全是突变表型，说明突变体X3073中插入标记潮霉素抗性基因只插入在基因组的一个位点。
表2突变体与S1528的杂交后代的表形及潮霉素抗性
实施例3控制梨孢菌附着胞成熟及形态变异的基因MgPTH12的克隆。
1.质粒拯救通过对突变体中插入质粒的拯救，获得了相应的插入位点侧端的基因组序列，并确定了突变体中质粒的插入位置。具体方法如下选取插入质粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Taggedmutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophus by restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中pUC18部分没有酶切位点的限制性内切酶XhoI完全消解突变体X3073的基因组。乙醇沉淀精制后用T4DNA连接酶进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞JM109。提取转化体的质粒，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，还含有部分插入位点侧端的基因组的序列。对鉴定正确的质粒进行测序然后到数据库中检索，分析插入位点附近的基因的范围和可能的外显子。结果表明，在突变体X3073中，质粒插入在对应于SEQ ID NO.1中的第174和1678位，中间部分可能缺失。将获得的侧端序列与国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因组数据库比较，这两个插入位点分别位于第I号染色体的contig2.1168，2.1169上。
2、基因组TAC文库的筛选以这两个位点之间的一段621bp的DNA片断(SEQ ID NO.4)为探针，筛选梨孢菌P131的基因组TAC文库，获得6个阳性克隆，它们都包括MgPTH12的基因组基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第5526位的核苷酸序列)。
质粒拯救过程中涉及到的限制性内切酶和T4DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
实施例4MgPTH12生物功能确认包括互补实验和基因敲除实验。
1、互补载体和敲除载体的构建a.互补载体的构建首先合成带有限制性内切酶XbaI识别序列的引物从克隆质粒载体pS65T-C1(gi1019893)中扩增出新霉素磷酸转移酶基因连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的质粒载体命名为KN。然后将PCR扩增所得的预测的该基因的全长序列连入KN中。构建过程中涉及到的限制性内切酶和连接酶，末端补平酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
b.敲除载体(基因置换载体)的构建。
参照FGENESH中预测的基因组基因的外显子-内含子的结构，将PCR扩增所得的预测的该基因的两侧翼序列定向连入一个载体中，该载体事先已连入一个新霉素抗性基因，在两侧翼序列之间连入潮霉素抗性基因。
2、梨孢菌的转化。
梨孢菌的转化采用原生质体转化。采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将互补载体线性化，转化梨孢菌的原生质体。原生质体的制备和转化方法如下a.原生质体的制备500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，分别接入梨孢菌P131、X3073的1×106个分生孢子，在26-28℃、100转/分条件下摇培30-32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×108个/毫升。
b.梨孢菌转化分别将梨孢菌P131、X3073原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管150微升，分别加入等体积的线性化的载体(约2微克，梨孢菌P131的离心管中加入用限制性内切酶KpnI线性化的基因置换载体pKO8，梨孢菌X3073的离心管中分别加用限制性内切酶EcoRI线性化的互补载体pXC5.5)和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000转/分、4℃离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室温静置培养12-13小时后，转入培养皿，加入12毫升冷却至50℃的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7％上层琼脂(冷却至50℃，含400微克/毫升的G418(互补实验)或300微克/毫升的潮霉素(美国Roche公司生产，基因置换试验)。28℃培养4-6天，将出现的转化体(梨孢菌突变体X3073的互补转化体分别为CX8；梨孢菌P131的基因置换转化体K75)转至固体CM培养基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％琼脂)(含400微克/毫升的G418(互补实验)或250微克/毫升的潮霉素(基因置换试验)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。
互补实验的结果表明互补载体在梨孢菌突变体X3073基因组中的异位整合使突变体的附着胞恢复野生形态。突变体的互补转化体CX8的附着胞与野生型菌P131在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率比较如表3所示表3.P131，CX8在洋葱表皮上形成侵染钉和侵染性菌丝的比率
在亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片上形成病斑情况如附图7所示。
基因敲除试验的结果表明，MgPTH12基因的部分基因组序列与潮霉素基因序列的置换导致转化体K75所产生的附着胞的形状具有与本发明中的突变体X3073一样的变异。MgPTH12的编码区基因序列与潮霉素基因序列的置换也导致转化体的致病力减弱，包括在洋葱表皮上的侵染钉和侵染性菌丝的形成率(见表4)，以及在亲和性水稻品种丽江新团黑谷叶片上形成病斑的数量(如附图11所示)。
表4.基因敲除转化体K75与野生型菌P131在接种后24小时、36小时和48小时形成侵染钉和侵染性菌丝的比率
实施例5MgPTH12的cDNA克隆1、MgPTH12 cDNA的预测用互补实验基因核苷酸序列到Softberry(http://www.softberry.com/)进行预测，结果预测为一个cDNA长度为1344核苷酸，编码447个蛋白质的ORF。
2、预测MgPTH12 cDNA的RT-PCR。通过异硫氰酸胍(GT)法抽取总RNA，首先根据预测的全长ORF设计两端引物进行RT-PCR。然后，用3’-Full RACE Core Set和5’-Full RACE Core Set进行两端RACE，并分别进行序列测定。最后，再根据两端RACE结果，设计引物全长cDNA，并进行测序，所获的全长序列见SEQ ID NO2。通过软件分析，可能的ORF长度为1410个核苷酸，编码470个氨基酸的蛋白质。
RT-PCR试剂、RACE试剂盒等由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
实施例6植物病原真菌基因组中控制附着胞成熟与致病力蛋白PTH12的生物信息学分析。
首先，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索、分析，在小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)等重要的病原真菌已有的基因组数据中可能存在的蛋白进行分析、预测。结果发现梨孢菌中MGPTH12蛋白在这几种病原菌中均具有一个对应的、氨基酸序列一致性高于40％的同源蛋白。梨孢菌中该基因编码的蛋白由470个氨基酸组成，其它真菌病原中的同源蛋白则分别命名为GzPTH12、GmPTH12、SsPTH12。几种植物病原真菌中PTH12蛋白的亲缘关系如附图12所示。
序列表<110>中国农业大学<120>源于梨孢菌的控制真菌附着胞成熟与致病力的基因MgPTH12及其用途<160>7<210>1<211>5526<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1TATTATACTG TATACCTTTA CCGCATTTTG CAGATCAGTG TCTGCCTCTG GCCCTTGTCC60ATTTTCGTCT TCCGAACTCC TTTACCAGGA AGCACGCTGT TCGGCACCAA GGAGTGAGTT120CCTGCTGTAC AGTACCGTAG GTAGAGTGGT AAGGTAGTTG ATCAGATCCT GGAGCTCCAG180GTCCCGAATG AATTGGATCT CTTGGGGAAA GCTTTCGTAC GGTTTGGTTG AGAAGGGGGG240GGGGCAGCTC TAGAGCAAGC AATTAGCAGT CATTCAGAGA CAAGCAAGCC ACACACGCCA300CAGCCCGGCT AGCAGTAGCG TATTTGCTTT GTCCCTTTTT TTCTTGGGCT TTTTTTTTTT360TTTTTTTTTT TTTTTTTTTG ACGGCCGTTG TCAACGGCTG CATTTCCAGC GTGGTTGAGT420TGGCAGGATA CTGTACTCAT GTCCAACAAC CTTAGAGCTT CCACGGACTC GTAGCACGCA480CGCACTCACA CCTGCACGCA CACTCCTCTT TCGTCTCGCT CTCTTACTAG CAAACCAGAC540TGTCCCACTG GCCCCCTACC GATACCAACC ATTCAATCGA CAAGTACGGT ACGATGTACT600GCGTACAATG TGCAACCAAC CTTGTTGATT CTCATATATC CCTGCATGCT TGTGGGTCTC660GAGTCGACGG GGACTTGCCC ACATCCATAA CCAACTGCAT CCCTGACCGA TGCAGGAATC720GACACAGTAC CAGATTGCAT CTGCTATGTA TGTCATCCTT ACCAAACCCT CGACCCATGT780TCATATTTCC TGTCCCCTAC CCTTGAATTT TGAATAATAA TAATAATGAT AATATTAAAT840AAATTCTCAT TTATTATTTC GTGCTCGCGT CCTCAGGCTA CTTTCGGATT AGTTTCTAGC900TTTACCCCCG GTAGACCGTG CTGCAGATTG TATAAACTGC TTTTTTACCT ACCTGCTCCT960TCCGCAATTC TCCCGCGCCT GGGGTACCTG GACTTGTGTT TTTCTTTGGT CAGTCATTCC1020GCAACGGCCT CTCCAAGAAA AAAACGAAGA AGAAAAAAGC AAACCAAGTC CTTCCGCTAG1080AGCTACGGCG GTAGCAGTTT CACCTAGCAC ATCGTCGTGC TGAAGAACTG TCCTAATTCT1140TTTTGACTCG GGCCTGTTTA CACATGCTCC CCCAAGTCTA CTAGAACTTC CCTTTTTGGC1200CACAACATCT GTGCACCTTG CCCGTTGGAT TCCCACACCA CGAACTAGGT CATCCATCCT1260ACCCCATCCG CATACAGAGA GGGTCCCGGC ACTTGCGTTT CTACAAAAGA ACACCATCAC1320CCTCACCCCA TTCGACGTTG CAGCACTCGT CTTATTCCTA ACCCATCTCT TGATCAACAC1380CAAAGTGCCA GGTTGCTGTC AACTTTTGGT CCTCCCTTTC ACTTCTTGTT TTTCTTTTAT1440
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<221>CDS<222>(333)..(1745)<400>2CGTCCTCGAC AAACTGCAGG AAGACATTCG CTTCTTGCTA TAACGCAACA CCAGCAGTGG60TCAGGAGGTA CTCAGCATCG ACTCGACCGC CATTACGCAT TCCCGCCGCC TCGGTTCATT120GACCGACACT AGGGCTGAAC CATTCGACGC TGTTCATAAT CCTGTCAGCT GGAGGCCAAC180GCCAGCTACA TTTTGCCATT CGCCGCCGGA CGCGTTACTA GTTGGGACAC AAACCCCCAC240ACAACCTTTC GTTAACAACA AGCTGCCTTC TTTTTAAACT ATTTGTAACT GAGCTGGCGC300TGCTACTCCG TCAACTTCCA CTCGAATAGG GCATGGAATA TACCTTGCCA AACCACCGTT360ACTCTCACAG CAACATCGGT CAACGAAGCA ATTCACCCAC AATGTCCACA CTCGCGATGG420CTGCACCATC CCCGCATGCT CCTTTCAAGA AGGAGTACTT CTCCAACTGG GACGACCGCC480GGCAAGCGGA TTATGCTCCT TCCAGGCCAA GGAGTGATCC CGAGAGGATA GCGCTACCCT540CGATTCGCCA GGCTTTCCCC GATCTCCTTC GCCTCCGTGT TATCCCCCAA GATGGCCAAA600CCAGCACACC ATCCTCCACC ACATCACCGA TATCAGGACC ACCTGGCACC CTGACACCAC660CCGAATATGT TCACTCCCCG ACCAGCCAGA ACAAGCGCAG GAGGTTATCG TTCGGTGACG720ACCAGGAGGA AAGGGTCAGC CAGGTTCCAA GGCTCTACAC CAGCCAGTCC CAGGCATACC780AACGACGTGA CAACCGTCCT CTTTCTCCAG TCACCCTAAG TGGCGGGCCC CGTTCTAGCA840CCTCCGATAG CTGGGCTGGA TCCTCCCGAA CGAGCCCGTT CCTTCCTGGT ACCAGCACTT900CGACCTTGAG ATCACCGGCT GCTATTGAGC AAAACGACCC AATGGACAGG CAGCGCCCGA960CGCTACCAAG CCTTCCTCAT CTGAACTTCG ACAGGTCACC AATGGAATCC CAGTCTCACA1020TGCACCACCA CCATCAACAG CACCCTCACC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAC AGCCACCACG1080TGAGGGCAAT GTCTGGGGAC GAGTACATGA TGGAGCAGCA CCGCGGAATG GTCCAGCAGC1140
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65 70 75 80Leu Arg Val Ile Pro Gln Asp Gly Gln Thr Ser Thr Pro Ser Ser Thr85 90 95Thr Ser pro Ile Ser Gly Pro pro Gly Thr Leu Thr Pro pro Glu Tyr100 105 110Val His Ser Pro Thr Ser Gln Asn Lys Arg Arg Arg Leu Ser phe Gly115 120 125Asp Asp Gln Glu Glu Arg Val Ser Gln Val Pro Arg Leu Tyr Thr Ser130 135 140Gln Ser Gln Ala Tyr Gln Arg Arg Asp Asn Arg Pro Leu Ser Pro Val145 150155 160Thr Leu Ser Gly Gly Pro Arg Ser Ser Thr Ser Asp Ser Trp Ala Gly165170175Ser Ser Arg Thr Ser Pro Phe Leu Pro Gly Thr Ser Thr Ser Thr Leu180 185 190Arg Ser Pro Ala Ala Ile Glu Gln Asn Asp Pro Met Asp Arg Gln Arg195200 205Pro Thr Leu Pro Ser Leu Pro His Leu Asn Phe Asp Arg Ser Pro Met210215 220Glu Ser Gln Ser His Met His His His His Gln Gln His Pro His Gln225 230 235240Gln Gln Gln Gln Gln His Ser His His Val Arg Ala Met Ser Gly Asp245 250 255Glu Tyr Met Met Glu Gln His Arg Gly Met Val Gln Gln His Pro His260265270Ser Ala Val Glu Pro Gly Tyr Arg Gln Pro Ala Pro Ser Gly Tyr Pro275280285Tyr Pro Tyr His His Pro Leu Arg Ser Gln Ser Leu Ser Ile Gly Ala290 295 300Met Pro Pro Met Asp Arg Met Pro Phe Ser pro Ser Gly Tyr Ser Ala305 310 315320Tyr His Gly Asp Tyr Met Arg Met Gly Asp Met Gly Gly Met Gly Phe325 330 335
Asn Gly Asp Asn Lys Gln Arg Lys Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Glu340 345 350Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ala Trp Phe Leu Ala His Leu Ser His Pro355360 365Tyr Pro Thr Glu Asp Glu Lys Gln Glu Leu Met Arg Gln Thr Gly Leu370 375 380Gln Met Asn Gln Ile Ser Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln385 390 395 400Leu Pro Ala Met Ile Asn Asn Ala Arg Ala Glu Ser Asp Ala Leu Ala405 410415Gln Gly Arg Gly Leu Ser Asp Gly Ser Lys Ile Leu Leu Ser Thr Glu420 425 430Arg Ser Asp Tyr Asp Ser Asp Lys Arg Gly Ser Pro Ile Ser Asp Asp435 440 445Gly Ala Ser His Leu Tyr His Asp Asp Met His Arg Arg Ala Val Gly450455 460Met Lys Arg Gly Ser Val<210>4<211>621<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)CTGCAGATTG TATAAACTGC TTTTTTACCT ACCTGCTCCT TCCGCAATTC TCCCGCGCCT60GGGGTACCTG GACTTGTGTT TTTCTTTGGT CAGTCATTCC GCAACGGCCT CTCCAAGAAA120AAAACGAAGA AGAAAAAAGC AAACCAAGTC CTTCCGCTAG AGCTACGGCG GTAGCAGTTT180CACCTAGCAC ATCGTCGTGC TGAAGAACTG TCCTAATTCT TTTTGACTCG GGCCTGTTTA240CACATGCTCC CCCAAGTCTA CTAGAACTTC CCTTTTTGGC CACAACATCT GTGCACCTTG300CCCGTTGGAT TCCCACACCA CGAACTAGGT CATCCATCCT ACCCCATCCG CATACAGAGA360GGGTCCCGGC ACTTGCGTTT CTACAAAAGA ACACCATCAC CCTCACCCCA TTCGACGTTG420
CAGCACTCGT CTTATTCCTA ACCCATCTCT TGATCAACAC CAAAGTGCCA GGTTGCTGTC480AACTTTTGGT CCTCCCTTTC ACTTCTTGTT TTTCTTTTAT TTGCGTGAAA TACGGATAGA540CTTCACTCTC TCGTGACCGA CCTCGTCCAC CATTTGGCAC TCGCAACATC TTAAATCTTT600AGCGTCCTCG ACAAACTGCA G 621<210>5<211>453<212>PRT<213>玉米茎腐病菌(串珠赤霉菌，Gibberella moniliformis)<400>5Met Ser Met Leu Ala Thr Ala Ser Pro Ser Pro His Pro Ser Ser Phe1 5 10 15Gly Met Pro Arg Pro Trp Glu Thr Asn Arg Cys Pro Asp Tyr Ser Leu20 25 30Arg Pro Arg Thr Glu Asn Asp Lys Val Ala Leu Pro Ser Ile Arg Gln35 40 45Val His Asn Ile Asp Ser Thr Ser Lys Pro Leu Cys Leu Ala Asn Ile50 55 60Thr Gln Ala Phe Pro Glu Leu Gln Leu Gln Thr Gln Pro Pro His Asp65 70 75 80Leu Asn Thr Lys pro Pro Ser Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ala Pro Pro85 90 95Leu Pro Ala Ala Ser Pro Gln Tyr Ile His Ser Pro Asn Ser Asn Lys100 105 110Arg Arg Arg Leu Ser Ile Glu Arg Glu Val Glu Met Glu Arg Val Arg115 120 125Gln Val Pro Arg Arg Tyr Ser pro Asp Arg Ala Ser Pro Arg Gln Ile130 135 140Ser Pro His Leu Pro Ile Gln Gly Gly Ser Gln Glu Asn Trp Ala Ala145 150 155 160Pro Thr Arg Thr Ser Pro phe Leu Thr Asn Gly Ser Asn Ser His Ser165 170 175Val Ser Ile Glu Val Ser Glu Arg Ala Glu Ser Arg Ser Thr Leu Pro180 185 190Ser Leu Pro pro Pro Arg Ser Leu Glu Arg Glu Leu Pro Val Gly Arg195 200 205Gly Thr Ala Pro Ala Asp Gly Tyr Arg Pro Pro Gln Gln Ser Met Pro210 215 220His Ser Arg Thr Pro Ile Ser Glu Pro Gly Val Ser Pro Tyr Arg Glu225 230 235 240Asn Gly Tyr Gly Tyr Pro Tyr His His Pro Thr Arg Tyr Gln Ser Leu
245 250 255Ser Thr Gly Ser Ala His Ser Tyr Asp Arg Thr Pro Phe Thr Pro Gly260 265 270Thr Tyr Asn Thr Pro Tyr Gln Asp Phe Val Arg Phe Gly Asp Met Ser275 280 285Ser Ala Ser Leu Ser Gly Asp Asn Lys Gln Arg Lys Arg Arg Gly Asn290 295 300Leu Pro Lys Glu Thr Thr Asp Lys Leu Arg Ala Trp Phe Val Ala His305 310 315 320Leu Gln His Pro Tyr Pro Thr Glu Asp Glu Lys Gln Asp Leu Met Arg325 330 335Gln Thr Gly Leu Gln Met Ser Lys Phe Gly Arg Thr Lys Pro Arg Thr340 345 350Glu Lys Pro Ser Gln Asn Trp Lys Leu Thr Cys Pro Pro Thr Asp Gln355 360 365Ile Ser Asn Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln Leu Pro Ala Met370 375 380Ile Asn Asn Ala Arg Ala Glu Thr Asp Ala Met Thr Gly Ala Arg Gly385 390 395 400Gly Asp Leu Lys Val Leu Ala Thr Thr Glu Arg Gly Asp Phe Asp His405 410 415Ser Lys Arg Glu Pro Ala Gly Pro Leu Ser Asp Gly Glu Gly Ala Thr420 425 430Tyr Asp Glu Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Arg Arg Pro Gly Thr Ile435 440 445Gly Arg Gly Ser Val450<210>6<211>463<212>PRT<213>小麦赤霉菌(Gibberella zeae)<400>6Met Glu Asp Ser Arg Ser Leu Ser Lys Gln Ser Asp Thr Lys Leu Gln1 5 10 15Gln Pro Ala Ser Gln Leu Pro Asn Met Ser Met Ile Ala Thr Ala Ser20 25 30Pro Ser Pro His Pro Ser Ser Phe Gly Met Pro Arg Pro Trp Glu Thr35 40 45Asn Arg Cys Pro Asp Tyr Ser Leu Arg Pro Arg Thr Glu Asn Asp Lys50 55 60Val Ala Leu Pro Ser Ile Arg Gln Ala Phe Pro Glu Leu Gln Leu Gln65 70 75 80Thr Gln Pro Pro His Asp Leu Asn Thr Lys Pro Leu Val Thr Gly Pro
85 90 95Pro Leu Gly Thr Ala Pro Leu Ala Ala Ala Ser Pro Gln Tyr Val His100 105 110Ser Pro Asn Ser Ser Lys Arg Arg Arg Leu Ser Met Glu Arg Glu Met115 120 125Glu Ser Glu Arg Val Arg Gln Val Pro Arg Leu Cys Tyr Ser Pro Asp130 135 140Arg Glu Ser Pro Arg Gln Ile Ser Pro Asn Leu Ala Ile Gln Ala Gly145 150 155 160Thr Arg Glu Asn Trp Thr Ala Pro Thr Arg Thr Ser Pro Tyr Leu Thr165 170 175Asn Gly Ala Thr His His Ser Val Pro Met Glu Val Gly Glu Arg Leu180 185 190Glu Ala Arg Pro Ala Leu Pro Ser Leu Pro Pro Pro Arg Ser Leu Glu195 200 205Arg Glu Ala Val Leu Val Ser Arg Gly Pro Ala Pro Ala Pro Val Pro210 215 220Thr Pro Val Pro Thr Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ile Pro Ala Ser225 230 235240Val Ser Ala Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Glu Gly Tyr Arg Ser245 250 255Ser His Gln Pro Met Ser His Ser Arg Thr Pro Ile Pro Glu Ser Gly260 265 270Val Ser Pro Tyr Arg Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Pro Tyr His His Pro275 280 285Thr Arg Tyr Gln Ser Leu Ser Ala Gly Ser Ala His Ser Phe Asp Arg290 295 300Thr Pro Phe Thr Pro Gly Ala Tyr Asn Ala Pro Tyr Gln Asp Phe Val305 310 315 320Arg Phe Gly Glu Met Gly Pro Ala Ser Leu Ser Gly Asp Asn Lys Gln325 330 335Arg Lys Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Glu Thr Thr Asp Lys Leu Arg340 345 350Ala Trp Phe Val Ala His Leu Gln His Pro Tyr Pro Thr Glu Asp Glu355 360 365Lys Gln Asp Leu Met Arg Gln Thr Gly Leu Gln Met Asn Gln Ile Ser370 375 380Asr Trp Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Gln Leu Pro Thr Met Ile Asn385 390 395 400Asn Ala Arg Ala Glu Thr Asp Ala Met Ser Ser Ala Arg Gly Gly Asp405 410 415Met Lys Val Leu Ala Thr Thr Glu Arg Gly Asp Phe Asp His Gly Lys420 425 430Arg Glu Pro Val Gly Pro Leu Ser Asp Gly Glu Gly Ala Thr Tyr Glu435 440 445Glu Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Arg Arg Pro Gly Thr Met Gly Arg
450 455 460Gly Ser Val<210>7<211>329<212>PRT<213>油菜菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)<400>7Met Thr Glu Arg Thr Tyr Asn Thr Ser Pro Glu Ser Asn Lys Arg Arg1 5 10 15Ile Ser Ser Asn Ser Ser Tyr Asp Asp Glu Ile Gln Gln Gln Arg Gly20 25 30Arg Tyr Gln Ser Val Ser Ser Ser Arg Ser Pro Met Thr Tyr His His35 40 45Asp Ser Gly Ala Ala Ser Pro Val Gly Pro Ile Ala Arg Arg Glu Ser50 55 60Leu Arg Ser Ile Pro Glu Arg Arg Ala Pro Phe Ser Asp His Thr Ser65 70 75 80Arg Pro Pro Phe His Ser Pro Ile Ser Glu Pro Ser Ser Thr Ile Tyr85 90 95Arg Gln Asn Leu Pro Gly Val Ala Thr Lys Asp Arg Ser Tyr Asp Arg100 105 110Pro Tyr His Gln Ile Pro Ala Gly His Ser His Asp Tyr Pro Arg Ser115 120 125Glu Tyr Ser Leu Glu Ala Cys Arg Pro Tyr Gln Gln His Asn Tyr Ala130 135 140Pro Ala His Asp Thr Ser Tyr Ala Pro Ser Gln Ser Asp Tyr Gly Tyr145 150 155 160Gln Gln Pro Arg Asn Gln Ala Tyr Pro Gly His Pro Pro Tyr Gln Leu165 170 175Asn Gln Gly Gln Thr Pro Phe Thr Glu Gly His His Ser Gly Asn Tyr180 185 190Ser Ser Ala Ala Tyr Gln Ala Gln Asp Met Asp Ser Lys Pro Arg Lys195 200 205Arg Arg Gly Asn Leu Pro Lys Pro Thr Thr Asp Ile Leu Thr Thr Trp210 215 220Phe Ile Asn His Leu Glu His Pro Tyr Pro Asn Glu Glu Glu Lys Gln225 230 235 240Leu Leu Met Val Gln Thr Gly Leu His Leu Asn Gln Ile Ser Asn Trp245 250 255Phe Ile Asn Ala Arg Arg Arg Lys Leu Pro Ala Leu Gln Asn Asn Ala260 265 270Arg Ala Glu Asn Ala Ala Arg Ser His His Asn Arg Met His Ser Ala
275 280 285Asp Asp Glu Gln Ser Pro Met Ser Leu Cys Asn Ser Asp Ala Gly Leu290 295 300Ser Pro Arg Asp Ala Ser Thr Phe Asn Glu Gly Trp Ser Ser Arg Gln305 310 315 320Glu Glu Arg His Asn Gln His His Tyr32权利要求
1.真菌中一种控制附着胞成熟和致病力的蛋白，在梨孢菌中命名为MGPTH12，其特征是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且控制真菌附着胞形成和致病力的蛋白质。3)与序列表中的SEQ ID №3具有氨基酸序列一致性高于40％的如玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformis)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)等病原真菌的蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID №5，6，7。
2.权利要求1所述的真菌控制附着胞成熟和致病力的蛋白的编码基因。该基因的特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上一致性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
3.权利要求2所述的控制真菌控制附着胞成熟和致病力的蛋白的基因的cDNA，其特征在于可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.权利要求3所述的控制真菌控制附着胞成熟和致病力的蛋白的基因的cDNA，其特征还在于编码区的序列为SEQ ID №2的5′端第333位至1745位碱基。
5.利用权利要求2、3、4所述的控制真菌控制附着胞成熟和致病力的蛋白的基因及其cDNA构建的表达载体，细胞系和宿主菌。
6.权利要求2所述控制真菌附着胞成熟与致病力蛋白的编码基因MgPTH12的启动子，具有自序列SEQ ID №1的5′端第1位至1940位碱基的核苷酸序列。
7.权利要求1所述的真菌控制附着胞成熟与致病力蛋白的MGPTH12及其一致高于40％同源蛋白的表达作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。
8.权利要求1所述的真菌控制附着胞成熟与致病力蛋白的MGPTH12及其一致高于40％同源蛋白的修饰作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。
9.权利要求2所述的真菌控制附着胞成熟与致病力蛋白的基因MgPTH12的转录产物的剪切作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。
10.权利要求6所述的控制真菌附着胞成熟与致病力蛋白的编码基因MgPTH12的启动子及其结合蛋白作为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的利用。
11.权利要求7、8、9、10所述的抗真菌药剂为抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉菌(Gibberella zeae)、玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotirum)等病原真菌的药剂。
全文摘要
本发明提供了梨孢菌附着胞成熟和致病力所必需的一个新基因MgPTH12基因及其用途。该基因及其cDNA、编码产物分别具有序列表中SEQ ID №1、№2和№3的序列。该基因编码的蛋白质具有homeo结构域，但与已知功能蛋白没有显著的相似性。该基因的敲除导致梨孢菌不能形成正常和成熟的附着胞，侵染钉和扩展性侵染菌丝的形成频率显著下降，并且对水稻几乎无致病能力。本发明还发现该基因的同源基因在植物病原真菌中广泛存在，在致病过程可能具有相同的功能。因此，MgPTH12编码蛋白的表达、转录物的剪切、修饰与定位以及该基因参与的信号途径可作为重要候选靶标，用于设计和筛选抗真菌的新型药剂。
文档编号A61P31/10GK1951957SQ20051010944
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者彭友良, 张凯, 赵文生, 张裕君, 时涛 申请人:中国农业大学