专利名称：源于梨孢菌的控制真菌次生分生孢子梗分化的新基因MgCON2及其蛋白的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物基因工程和植物保护领域中真菌控制分生孢子梗成熟和分生孢子产生的编码基因及其相关蛋白应用。
背景技术：
在自然界大多数真菌中，无性孢子的产生是进行无性繁殖的一种最普遍的模式，这种无性孢子称之为分生孢子。在很多植物病原真菌中，病菌的侵染起始于分生孢子的产生。研究分生孢子产生的分子生物学机制有助于寻找控制病害的靶标，从而阻断病原的初侵染。
由梨孢菌(Magnaporthe grisea)引起的水稻稻瘟病是世界水稻产区广泛发生的的水稻病害，也是水稻病害中最重要的病害之一。梨孢菌是单倍体、异宗配合的子囊真菌。能侵染包括水稻在内的50多种禾本科植物，导致水稻稻瘟病及杂草的草瘟病。
梨孢菌以分生孢子作为侵染寄主植物的初侵染源和再侵染源。梨孢菌的一部分菌丝在生长过程中分化为分生孢子梗。分生孢子梗顶端细胞膨大形成呈梨形的第一个分生孢子，此后，顶端的极性向一边偏移进而产生另外的分生孢子，每个成熟的分生孢子梗着生三至五个分生孢子。分生孢子成熟释放后，在分生孢子梗上留下屈膝状的疤痕。释放后的分生孢子吸附到叶片上，萌发后产生芽管，芽管顶端膨大形成附着胞，进而产生侵染钉。侵染钉顶端细胞在植物组织间扩展成侵染性菌丝。在病部有些侵染性菌丝穿透植物组织向空气中分化形成分生孢子梗，再进一步形成分生孢子，引起再侵染。梨孢菌从分生孢子附着到分生孢子再产生的周期一般所需时间为3-5天；在植物的生长季节，如果条件适宜，能够多次侵染，对寄主植物造成严重危害。因此，稻瘟菌的分生孢子在稻瘟病侵染循环中起着重要作用。已有研究表明，稻瘟病的严重度与稻瘟菌形成分生孢子的多少直接相关(Teng et al.1991)。因此，研究稻瘟菌分生孢子梗和分生孢子的形成的分子机理不仅有助于揭示稻瘟菌致病性的分子机制，而且对于研发稻瘟病防治的新途径也具有重要意义。
丝状真菌曲霉菌(Aspergillus nidulans)是研究真菌产孢的模式真菌，目前有关真菌分生孢子梗和分生孢子形成方面的报道大多集中在该菌上。
有关梨孢菌的分生孢子梗和分生孢子形态建成研究方面Hamer等报道了Smo-突变体(Hamer，J.E.et al.1989)，是在分生孢子形态变异方面较早的报道。这个突变体是他们在运用Teflon膜来筛选和获得在附着胞形成上有缺陷的稻瘟菌突变体的过程中获得的，这一类型的突变体不能形成正常形态的分生孢子和子囊，但是能形成正常形态的子囊孢子。Smo-突变并不影响菌株正常的营养生长、形成分生孢子、减数分裂以及对寄主植物的侵染。
1993年Shi和Leung报道他们用电激处理的Guy11菌株的发芽孢子，从生存下来的群体中分离了con1-突变体，并找到了一个与con1-相距7.2cM紧密连锁的RAPD标记(Shi，Z.X.and Hei Leung，1994)。该突变体每一个分生孢子梗上，只产生一个端生的由三个细胞组成的伸长的分生孢子。进一步，同一作者应用化学诱变和REMI方法获得了一系列与分生孢子形成有关的突变体Con2-Con7-(S(Shi，Z.X.and Hei Leung，1995；Shi，Z.X et.al 1998)。其中，突变体con5-完全丧失分生孢子梗产生能力，con6-能形成分生孢子梗、但没有分生孢子形成能力。con1-、con2-、con4-和con7-作用于con5-和con6-的下游影响产孢能力和分生孢子的发育。con4-和con7-产孢量减少约35％，con1-和con7-不能形成附着胞，因而丧失了对水稻的致病性，con2-和con4-附着胞形成率明显减少，因而致病性明显减弱。Con1-和con4-相互作用减少菌丝生长和分生孢子的产生，con1-和con7-相互作用抑制分生孢子产生但不影响菌丝生长。通过它们之间的遗传关系分析表明，Con1和Con2连锁，Con5和Con6连锁。
尽管如此，目前参与梨孢菌分生孢子形成的有关基因的克隆与分子机理的研究报道仍然较少。本发明通过插入突变途径克隆了梨孢菌中一个控制分生孢子梗成熟和分生孢子形成的基因MgCON2，该基因突变可使梨孢菌分生孢子梗成熟度降低，产生分生孢子能力显著下降。该基因编码蛋白的表达与调控可作为靶标用于抗真菌药物的设计和筛选。此外，该基因在其他植物病原真菌如小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Giberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)中均具有一个氨基酸序列一致性在40％以上的同源蛋白，可能具有与MGCON2相似的生物学功能，因而，这些同源蛋白的表达及修饰也可作为设计、筛选抗真菌药物的靶标。
发明内容
本发明旨在提供真菌控制次生分生孢子梗分化的一个基因及其蛋白的用途。本发明所提供的真菌控制次生分生孢子梗分化的基因来自梨孢菌，其名称为MgCON2，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中SEQ ID №1的DNA序列由2940个碱基组成，其编码区位于SEQ ID №1的5′端第1501位至2462位碱基之间。自SEQ ID №1的5′端第1位至1500位碱基为启动子序列。
MgCON2编码的蛋白MGCON2也属于本发明的保护范围，是具有下述特征之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3所示氨基酸残基序列的蛋白质。
2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与真菌分生孢子产生相关的蛋白质。
利用MgCON2基因、cDNA以及启动子构建的表达载体及其转化获得的细胞系、宿主菌均属于本发明的保护范围。其cDNA以及启动子序列分别如SEQ ID №2和SEQID №4所示。
以MgCON2基因中任一区域的核苷酸序列设计引物，并通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下该基因的表达也属于本发明的保护范围之内。以MGCON2或与其有40％或以上一致性的同源蛋白中任一区域的氨基酸序列设计多肽，并制备抗体用于检测在化合物处理状况下MGCON2蛋白的表达也属于本发明的保护范围之内。
本发明证明MgCON2基因的突变可导致梨孢菌分生孢子成熟度降低，分生孢子产量显著下降。因此，本发明最重要的用途是应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因表达、剪切及其编码蛋白的表达的化合物；或设计和筛选能对MGCON2的氨基酸序列进行修饰或阻断MGCON2进行正常细胞定位的化合物；或设计和筛选能阻断与MgCON2启动子的核苷酸序列结合蛋白结合的化合物；从而开发新型的抗真菌的药物。此外，本发明的用途还包括以MgCON2启动子的核苷酸序列或MgCON2基因的DNA或cDNA的某一区段作为探针在梨孢菌中再分离的DNA序列，或者在其它真菌中分离的、与该基因具有一定序列同源性的序列。
本发明还涉及源于小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Gibereliamoniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等植物病原真菌与梨孢菌MgCON2在氨基酸序列上具有高于40％一致性的同源蛋白，它们可能与梨孢菌MgCON2具有相同的生物学功能。因此，这些同源蛋白及其编码基因的启动子也可作为靶位点，用于设计和筛选抗这些真菌的药物。
上述利用MgCON2及其同源蛋白的表达为靶标、开展抗真菌药剂的筛选和设计等用途也属于本发明的保护范围之内。
本发明证明MgCON2基因的突变可导致梨孢菌分生孢子成熟度降低，分生孢子产量显著下降。筛选能够破坏掉该基因的表达、剪切及其产物的表达、修饰与定位的化合物作为药物，是本发明的一个重要用途。MgCON2的核苷酸序列和MGCON2的氨基酸序列可以作为靶位点应用于抗真菌药剂(特别是抗梨孢菌药剂)的筛选和设计中，也可以以该核苷酸序列的某一区段作为探针在梨孢菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。
以下通过附图进一步说明本发明。
附图1，野生菌株P131与插入突变体S3514的分生孢子梗着生分生孢子方式比较。图示说明上图为野生型P131，下图为突变体S3514。
附图2，野生菌株P131与插入突变体S3514的分生孢子产量比较。
附图3，梨孢菌水稻MgCON2基因的插入突变菌株S3514，质粒pUCATPH的插入方式示意图和Southern杂交确认图。图示说明上图质粒插入方式示意图；下图为以pUCATPH为探针，质粒插入方式的Southern杂交确认图。
附图4，MgCON2互补载体KNP的示意图。图示说明首先将新霉素抗性基因(Neo)连入pBluscript KS(+)载体的XbaI位点，作为选择标记；然后，将目标基因的DNA片段连入到KpnI和SpeI位点，形成互补载体KNP。
附图5.互补转化体的Southern杂交分析。图示说明图中C15、C3-2、C7-1、C2-1、C6-2、C10-2、C5-1和C1-1分别为独立的互补转化体，P131为野生型，S3514为突变体，杂交探针为用ApaI和KpnI双酶切互补载体KNP所得的、包含质粒插入位点的2600bp片段。
附图6，互补转化体C10与野生菌株P131的分生孢子梗着生分生孢子方式比较。
图示说明上图为野生型P131，下图为互补转化体C10-2。
附图7，野生型、插入突变体和互补转化体分生孢子产量比较。图示说明P131为野生型，S3514为MgCON2的插入突变体，C2-1、C5-1、C6-2和C7-1为互补转化体。
附图8，MgCON2基因启动子驱动GFP报告基因表达载体构建示意图。图示说明启动子区域为通过PCR方法扩增获得的1500 bp DNA片段，两端分别添加KpnI和HindIII酶切位点。
附图9，MGCON2在菌丝、分生孢子、附着胞、侵染钉及侵染性菌丝中的表达图。
图示说明左列为明视场所拍摄，中间列为暗视场蓝光下所拍摄，右列为明暗视场所拍摄照片叠加图。
附图10，MGCON2与其他植物病原真菌中同源蛋白的亲缘关系比较。图示说明GMCON2为玉米茎腐病菌(Giberella moniliformis)中的同源蛋白；GZCON2为小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)中的同源蛋白；SSCON2为核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)中的同源蛋白；BCCON2灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)中的同源蛋白；PNCON2为小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)中的同源蛋白，聚类分析利用Clastalw软件完成。
具体实施例方式
为了更好的理解本发明，以下通过实施例予以进一步地说明，但并非对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、突变体的筛选与鉴定1、分生孢子的制备将梨孢菌菌株P131的各REMI转化体的菌丝充分打断，均匀地涂布到西红柿汁燕麦片培养基(每升含150ml西红柿汁、40克燕麦片煮沸30分钟过滤取滤液、20克琼脂)平板上，26℃-28℃培养，当肉眼可见新生菌丝长出培养基表面时，用棉签轻轻将菌丝洗下，并用水冲洗干净，盖上单层纱布，于26℃-28℃光照培养48小时，在培养基表面即可见大量的梨孢菌孢子。
2、分生孢子产孢量降低突变体的筛选将各REMI转化体通过上述方法制备的分生孢子用30ml水洗、收集，利用血球记数板在显微镜下测定其分生孢子数；筛选、获得了突变菌株S3514，与野生型菌株P131相比，该突变体产孢量显著降低，进一步在显微镜下观察、记载野生型和突变体的产胞量，野生型和突变体各观察6皿(直径9厘米)，每皿的平均产孢量如表1和附图2所示。同时发现该突变体分生孢子梗上不产生分生孢子或每个分生孢子梗只着生一个分生孢子(附图1)。
表1.突变体与野生型菌分生孢子产量的区别
实施例2、突变体表型变化与插入标记共分离分析为了确定上述突变体是否为插入突变体，用遗传杂交的方法对突变体中插入标记潮霉素抗性基因与突变表型的共分离进行分析，将此突变体分别与一个不具有突变表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株S1528进行杂交，分析其子囊孢子后代的分生孢子形状及潮霉素抗性情况，具体方法如下将上述突变体S3514分别与不具有潮霉素抗性，产孢正常的梨孢菌菌株S1528在西红柿燕麦片培养基上进行对峙培养。首先于25℃培养至菌落边缘即将接到一起，然后将其移至20℃光照培养，约20天左右在菌落的交界处形成黑色突起的子囊壳。挑取成熟的子囊壳，于无菌水中轻轻挤破，释放壳内的子囊，将子囊悬浮液涂在水琼脂平板上，24小时后挑取子囊内子囊孢子萌发的单根菌丝于西红柿燕麦片培养基上培养。统计这些子囊孢子后代的潮霉素抗性和分生孢子产生情况。结果如表2所示，表明在测定的子囊孢子后代中，对潮霉素敏感的后代都能正常产生分生孢子，抗潮霉素的后代都不形成分生孢子，说明此突变体的失去产孢能力的表型与插入标记潮霉素抗性基因是共分离的。
表2.S1528与突变体杂交后代的潮霉素抗性与突变性状分析共分离分析
实施例3、目标基因的克隆首先通过对突变体S3514中插入质粒的拯救，获得了相应的插入位点侧端的基因组序列，并确定了突变体中质粒的插入位置。具体方法如下选取插入质粒pUCATPH(Lu，S.，Lyngholm，L，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophusby restriction enzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA911264-12653)中pUC18部分没有酶切位点的限制性内切酶HindIII完全消解突变体的基因组，乙醇沉淀精制后用T4DNA连接酶进行自连接，转化大肠杆菌的感受态细胞JM109。提取转化体的质粒，并进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒中除含有pUCATPH中pUC18部分的序列外，还含有部分插入位点侧端的基因组的序列。对鉴定正确的质粒进行测序，然后到数据库中检索，分析插入位点附近的基因的范围和可能的外显子。结果表明在突变体S3514中，质粒插入在一个限制型内切酶SacI的酶切位点处。将该位点两侧的基因组序列利用软件GENESCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)和FGENESH(http://sunl.softberry.com/berry.phtml)进行预测，同时结合国际稻瘟菌基因组协会的官方网站(http://www.riceblast.org/)中对梨孢菌基因组中基因的预测，确认质粒的插入位点位于一个预测的基因(本发明中称为MgCON2)中。质粒插入位点示意如附图3。
进一步，以拯救的侧翼DNA片断为探针，筛选梨孢菌Y34的基因组TAC文库(其平均克隆片段大小为50kb，共覆盖全基因组的16-18倍，魏士平等，Construction andEvaluation of a TAC Library of Magnaporthe grisea，植物病理学报，2003，3357-62)，获得五个阳性克隆。然后，根据预测包含目标基因(本发明中称为MgCON2)的基因组序列，设计PCR引物，引物两端分别设计KpnI、SpeI酶切位点，以上述5个阳性克隆为模板进行扩增，结果表明它们都包括MgCON2的基因组基因。MgCON2基因长度为2940 bp(如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)，包含起始密码子前1500bp的启动子区域，及终止密码子后488 bp的序列片段。扩增片段克隆到pMD-18-T载体上。
质粒拯救过程中涉及到的限制性内切酶和T4DNA连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
实施例4、MGCON2及其编码基因功能的确认本发明中采用互补实验来验证MGCON2及其编码基因的功能。在这部分内容中包括互补载体的构建以及将上述载体导入梨孢菌中，得到梨孢菌的互补转化体。互补载体的构建是指将MgCON2基因与一个带有新霉素抗性基因的载体相连。在这里新霉素抗性基因并不是对本发明的限制，其他能导致抗生素抗性的基因，即潮霉素抗性基因之外的导致真菌抗性的基因都可以达到同样的效果。互补载体所导入的梨孢菌受体菌株是突变体菌株。
1、互补载体的构建首先合成带有限制性内切酶XbaI识别序列的引物从克隆质粒载体pS65T-C1(gi1019893)中扩增出新霉素磷酸转移酶基因连入pBlueScriptKS(+)的限制性内切酶切位点XbaI间，得到的质粒载体命名为KN。然后将上述克隆到pMD-18-T载体上的MgCON2基因用限制性内切酶KpnI、SpeI酶切，回收目标片段与用同样酶切的KN连接，得到包含MgCON2基因和选择标记新霉素磷酸转移酶基因的互补载体KNP(图4、5)。
构建过程中涉及到的限制性内切酶和连接酶由宝生物工程(大连)有限公司生产，参照使用说明书使用。
2、梨孢菌的转化。
在本发明中，梨孢菌的转化选用PEG介导的转化真菌原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法如下1)原生质体的制备500毫升三角瓶装入150毫升液体CM培养基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸钙0.1％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.025％，氯化钠0.015％)，分别接入梨孢菌S3514的1×106个分生孢子，在26-28℃、100转/分条件下摇培32小时，三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50毫升离心管中，每1克菌丝加入1毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，26-28℃、100转/分条件下酶解3-4小时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(1.2M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH 7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用STC将原生质体浓度调至0.5-1×108个/毫升。
2)梨孢菌转化将梨孢菌突变体S3514原生质体分装于灭菌的50毫升离心管中，每管150微升，加入等体积的线性化的载体(约2微克，梨孢菌S3514的离心管中分别加用限制性内切酶KpnI线性化的互补载体KNP)和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-pH 7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4,000转/分、4℃离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室温静置培养12-13小时后，转入培养皿，加入12毫升冷却至50℃的SR(LR+1.6％琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7％上层琼脂(冷却至50℃，含400微克/毫升的新霉素(美国Roche公司生产)。28℃培养4-6天，将出现的互补转化体转至固体CM培养基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％琼脂)(含400微克/毫升的新霉素)上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片番茄培养基上培养，并进行单孢分离。
将各互补转化体及野生型通过前述方法制备分生孢子，即用30ml水洗、收集，利用血球记数板在显微镜下测定其分生孢子数，分别观察了野生型与4个互补转化体各3皿(直径9厘米)的分生孢子产生量(如表3和附图7所示)。结果表明，各互补转化体的分生孢子产生量恢复到与野生型P131一致的水平。同时，在体式显微镜下观察互补转化体的分生孢子梗形态和分生孢子着生方式，结果如图6所示，表明互补转化体的分生孢子梗成熟能力及产生分生孢子表型均恢复到野生表型。
表3.互补转化体与野生型菌分生孢子产量的区别
实施例5基因的表达时期分析1、载体的构建将基因的启动子通过PCR扩增与GFP基因相连连入带有新霉素磷酸转移酶基因的载体中，如图8所示。
2、表达载体转化梨孢菌按实施例2中所述转化方法，采用不破坏载体内基因的限制性内切酶将载体线性化，转化梨孢菌的原生质体。挑取具有新霉素抗性的转化子在荧光显微镜下观察，发现该基因在分生孢子、分生孢子梗和附着胞中有表达；在菌丝、侵染钉及侵染性菌丝阶段没有表达(图9)。
实施例5、其它植物病原真菌中MGCON2同源蛋白的生物信息学分析对梨孢菌MGCON2的氨基酸序列进行tBLAST检索分析，发现该蛋白在小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Giberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)等植物病原真菌基因组中存在与MGCON2同源的蛋白质。进一步，分别提取该同源蛋白的基因组DNA序列，通过FGENESH和GENSCAN软件进行基因预测，获得上述病原真菌中MGCON2的同源蛋白，分别命名为GZCON2、GMCON2SSCON2、BCCON2和PNCON2，其序列分别如SEQ ID NO5、6、7、8、9所示。GZCON2、GMCON2、BCCON2、SSCON2和PNCON2与MGCON2在氨基酸序列上的一致性分别为61％、64％、60％、63％和42％，6种同源蛋白的亲缘关系如图10所示。
序列表<110>中国农业大学<120>源于梨孢菌的控制真菌次生分生孢子梗分化的新基因MgCON2及其蛋白的用途<130>彭友良2003-2<160>9<210>1<211>2940<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1aggtttttga agagaattgt cgtagcatcg tacctcaggt gtatgaagtg ctctactgga 60ctggcgtgta gaagagcctg gagacaccgg gaaattaccg tcagttgctc atgccccatt 120gaccccggca tcttgtcctt gttcatctcc ttccaacgca ggattaccca acatagtgcg 180tcttcaatta tatagtgagg ggaccacgac cgaatggatg ggaatatagc ctccagcagt 240cgcggcgtga gttcggggca tgttgtgagt gtattaagca ctatcgctcg cagttcttgt 300tttgtgatct gctcgccagc gatgagccgg ttccattctt ctcggatctc tggtattgtt 360ttctgaagta ttaagtggtt gagtatctcg ggtgggttgg agctggtagg cagaacagag 420cgatacatcc actctttcgc acgaaagata gacgttttcc acaagataaa atccagcttt 480tcgcgacgga tttctgattg agattcgatt ccgacaatcc ggcgctcaat ctggtaatcc 540tcgtagcgac caagaacata atccgttcta tgcgttttga attcttcctc tgtcacgaac 600tggccacgac ccgtcggttt cacaggagac ctccagaagc cttgtatcga tcggtttgat 660gaagggaaca aggtctcaag cctttcatct tgagcattgc gtcgtgactc ttcggagagc 720tgtacactgt ctccgatgtg ttctggcgtt tggtcactga tgtgaggaat tttggcgtgt 780tgtatttgaa gcaatggcga cacatcctcc acctctgatc gcagagtatg ggtgaatccg 840ctggcccacg agcgacgtaa tgtggaatgt atttgcgact ggtgttcagt cgtccgtatt 900ccgacaagac gcgggcttat gcatcgcagg agcgggaggc tcgtgtgccg ccatcgctgc 960atctggcgtg gaagagcaac ggtcatgaat gagcatggca actataaggt gcccagaaga 1020aatattagga ggccatgcca tagggccagt tgaccattat aataccagtc caaataggag 1080caaagccaaa cttgaaactc tttgcaagta ggtgaacgtt gacaagggcg tggtgggtca 1140cagatcactt ggctcttaca tcgtaaagga gcatgcaaaa tttcccaacc agatgcgtta 1200tcgataagaa caaaccagct gcagcgtcgc gtcgaccgtg gtatgggatt caaggtccac 1260ccatctgcag ctacctacct acctaccaac ctgatcagtc tcgctcagca tctttgagac 1320caaaaagaga gaatcaaaca agcccaacac caggaatcaa agagctctag acgggcagca 1380gagttctagg tccccgccca aaaagaactc agtacatcaa aaaatttact tgcgacaggc 1440ttaggcctcc ttcagcattg tggagggaca tctacgaccc accccccatc tccaagactt 1500
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Val Glu Arg Pro Cys Val Ser Ala Ser Leu Leu Leu Lys Gly Leu Arg210 215 220Leu Leu Ser Leu Gly Ala Pro Ser Leu Arg Asp Glu Arg Leu Asp Arg225 230 235 240Glu Gly Asp Ala Cys Leu Phe Val Ser Gly Leu Glu Cys245 250<210>4<211>1500<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>4aggtttttga agagaattgt cgtagcatcg tacctcaggt gtatgaagtg ctctactgga 60ctggcgtgta gaagagcctg gagacaccgg gaaattaccg tcagttgctc atgccccatt 120gaccccggca tcttgtcctt gttcatctcc ttccaacgca ggattaccca acatagtgcg 180tcttcaatta tatagtgagg ggaccacgac cgaatggatg ggaatatagc ctccagcagt 240cgcggcgtga gttcggggca tgttgtgagt gtattaagca ctatcgctcg cagttcttgt 300tttgtgatct gctcgccagc gatgagccgg ttccattctt ctcggatctc tggtattgtt 360ttctgaagta ttaagtggtt gagtatctcg ggtgggttgg agctggtagg cagaacagag 420cgatacatcc actctttcgc acgaaagata gacgttttcc acaagataaa atccagcttt 480tcgcgacgga tttctgattg agattcgatt ccgacaatcc ggcgctcaat ctggtaatcc 540tcgtagcgac caagaacata atccgttcta tgcgttttga attcttcctc tgtcacgaac 600tggccacgac ccgtcggttt cacaggagac ctccagaagc cttgtatcga tcggtttgat 660gaagggaaca aggtctcaag cctttcatct tgagcattgc gtcgtgactc ttcggagagc 720tgtacactgt ctccgatgtg ttctggcgtt tggtcactga tgtgaggaat tttggcgtgt 780tgtatttgaa gcaatggcga cacatcctcc acctctgatc gcagagtatg ggtgaatccg 840ctggcccacg agcgacgtaa tgtggaatgt atttgcgact ggtgttcagt cgtccgtatt 900ccgacaagac gcgggcttat gcatcgcagg agcgggaggc tcgtgtgccg ccatcgctgc 960atctggcgtg gaagagcaac ggtcatgaat gagcatggca actataaggt gcccagaaga 1020aatattagga ggccatgcca tagggccagt tgaccattat aataccagtc caaataggag 1080caaagccaaa cttgaaactc tttgcaagta ggtgaacgtt gacaagggcg tggtgggtca 1140cagatcactt ggctcttaca tcgtaaagga gcatgcaaaa tttcccaacc agatgcgtta 1200tcgataagaa caaaccagct gcagcgtcgc gtcgaccgtg gtatgggatt caaggtccac 1260ccatctgcag ctacctacct acctaccaac ctgatcagtc tcgctcagca tctttgagac 1320caaaaagaga gaatcaaaca agcccaacac caggaatcaa agagctctag acgggcagca 1380gagttctagg tccccgccca aaaagaactc agtacatcaa aaaatttact tgcgacaggc 1440ttaggcctcc ttcagcattg tggagggaca tctacgaccc accccccatc tccaagactt 1500
<210>5<211>208<212>PRT<213>小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)<400>5Met Ser Ser Ser His Ala Ser Leu Ser Ala Ala Ser Asp Asp Arg Lys1 510 15Ala Arg Leu Ala Lys Leu Lys Asn Leu Lys Arg Lys Gln Pro Ala Asp20 25 30Glu Ile Val Ala Pro Glu Ser Glu Arg Ala Ala Ser Pro Pro Thr Glu35 40 45Pro Asp Val Ser Arg Leu His Leu Ser Gly Arg Asn Tyr Asp Pro Glu50 55 60Thr Arg Gly Pro Lys Leu Gly Phe Glu Gln Asp Pro Ser Leu Ser Leu65 70 7580Glu Thr Pro Thr Leu Glu Glu Gln Ala Ala Glu Val Glu Ala Glu Ile8590 95Lys Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Gln Asp Asp Lys Gly Val Asp Leu100 105 110Phe Lys Leu Gln Pro Lys Lys Pro Asn Trp Asp Leu Lys Arg Glu Leu115 120 125Asp Thr Lys Met Glu Val Leu Asn Val Arg Thr Asp Asn Ala Ile Ala130 135140Arg Leu Val Arg Asp Arg Ile Thr Gly Ala Gln Lys Ala Ala Lys Lys145 150 155 160Asp Arg Ala Val Asp Asp Ala Gln Gly Thr Gly Glu Ala Thr Gly Met165 170175Asp Gly Val Ala Leu Val Glu Gly Leu Arg Val Arg Glu Lys Glu Asp180 185 190Glu Asp Glu Glu Arg Arg Glu Arg Glu Glu Glu Ala Ala Leu Gly Ala195 200 205<210>6<211>253<212>PRT
<213>玉米茎腐病菌(Gibberella moniliformiis)<400>6Met Ser Ser Ser His Ala Ser Leu Ser Ala Ala Ser Asp Asp Arg Lys1 510 15Ala Arg Leu Ala Lys Leu Lys Asn Leu Lys Arg Lys Gln Pro Gly Asp20 25 30Glu Ile Val Ala Pro Glu Ser Glu Arg Ala Gln Ser Pro Pro Val Glu35 4045Pro Asp Val Ser Arg Leu His Val Ser Gly Arg Asn Tyr Asp Pro Glu50 55 60Thr Arg Gly Pro Lys Leu Gly Phe Glu Gln Asp Pro Thr Leu Asn Leu65 70 75 80Asp Lys Pro Thr Leu Glu Glu Gln Ala Ala Glu Val Glu Ala Glu Val85 90 95Lys Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Gln Asp Asp Gln Gly Val Asp Leu100 105 110Phe Lys Leu Gln Pro Lys Lys Pro Asn Trp Asp Leu Lys Arg Glu Leu115 120 125Asp Arg Lys Met Glu Gly Leu Asn Val Arg Thr Asp Asn Ala Ile Ala130 135 140Arg Leu Val Arg Asp Pro Ser Phe Ser Cys Leu Ile Leu Arg Thr Arg145 150 155 160Thr Ser Val Pro Met Ser Ser Val Ile Lys Pro Ser Thr Arg Trp Gln165 170 175Ser Leu Thr Val Val Pro Asn Pro Gly Ser Ile Arg Ser Leu Ile Lys180 185 190Ser Ala Ser Arg Leu Gly Arg Pro Trp Ala Pro Arg Thr Ser Thr Thr195 200 205Lys Ala Met Trp Ala Pro Arg Phe Arg Trp Ile Leu Pro Arg Met Pro210 215 220Arg Trp Arg Asp Pro Phe Asp Arg Arg Thr Ala Thr Ala Ala Ala Thr225 230 235 240Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ile Asn Ser Pro Ala Thr Leu245 250<210>7
<211>207<212>PRT<213>油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)<400>7Met Ser Ser Thr His Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ala Asp Glu Arg Lys1510 15Ala Arg Leu Ala Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Lys Gln Pro Ala Asp20 25 30Glu Ile Val Ala Pro Glu Ser Thr Arg Ser Pro Ser Pro Pro Ala Ser35 40 45Pro Asp Val Ala Lys Leu His Leu Ser Gly Arg Asn Tyr Asp Ala Glu50 55 60Ala Lys Gly Pro Lys Leu Gly Phe Glu Ala Pro Pro Thr Leu Ala Leu65 70 75 80Glu Lys Pro Thr Leu Glu Gln Gln Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Ile85 9095Arg Arg Lys Ala Glu Glu Glu Glu Gln Asp Asp Lys Gly Val Asp Leu100 105 110Phe Lys Leu Gln Pro Lys Lys Pro Asn Trp Asp Leu Lys Arg Asp Leu115 120 125Glu Lys Lys Leu Gly Val Leu Asn Val Arg Thr Glu Asn Ala Ile Ala130 135 140Arg Leu Val Arg Glu Arg Ile Glu Ser Ala Gln Lys Ala Ala Arg Met145 150 155 160Lys Asp Gly Lys Gly Ala Ile Asn Ala Thr Glu Asp Gly Glu Glu Met165 170 175Gly Met Glu Gly Val Ala Leu Val Glu Gly Val Lys Leu Arg Glu Lys180 185 190Glu Glu Glu Glu Glu Arg Arg Glu Lys Glu Asp Glu Asp Leu Gln195 200 205<210>8<211>208<212>PRT<213>灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)<400>8Met Ser Ser Thr His Ala Thr Leu Gly Ala Ala Ala Asp Glu Arg Lys
1510 15Ala Arg Leu Ala Lys Leu Lys Ser Leu Lys Arg Lys Gln Pro Ala Asp20 25 30Glu Ile Val Ala Pro Glu Ser Thr Arg Ser Pro Ser Pro Pro Ala Ser35 40 45Pro Asp Val Ala Lys Leu His Leu Ser Gly Arg Asn Tyr Asp Pro Glu50 55 60Thr Lys Gly Pro Lys Leu Gly Phe Glu Ala Pro Pro Thr Leu Ala Leu65 70 75 80Glu Thr Pro Thr Leu Glu Gln Gln Ala Ala Glu Val Glu Glu Glu Ile85 90 95Arg Lys Lys Ala Glu Glu Glu Glu Gln Asp Asp Lys Gly Ile Asp Leu100 105 110Phe Lys Leu Gln Pro Lys Lys Pro Asn Trp Asp Leu Lys Arg Asp Leu115 120 125Glu Lys Lys Met Glu Val Leu Asn Val Arg Thr Glu Asn Ala Ile Ala130 135 140Arg Leu Val Arg Glu Arg Ile Glu Ser Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr145 150 155160Lys Gly Gly Lys Gly Ala Ile Ser Ala Ser Glu Gly Gly Glu Glu Val165 170 175Gly Met Glu Gly Val Ala Leu Val Glu Gly Val Lys Leu Arg Glu Lys180 185 190Glu Glu Glu Glu Glu Glu Arg Arg Glu Lys Glu Asp Glu Asp Leu Gln195 200 205<210>9<211>236<212>PRT<213>小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)<400>9Met Cys Gly Ala Thr Tyr Lys Leu Ser Ser Thr Phe Ala Pro Asp Pro15 10 15Pro Cys Pro Pro Thr Lys Ser Ser Leu Pro Pro Arg Thr Thr Ala Lys20 25 30Arg Ala Ser His Ser Ser Asn Pro Ser Ser Gly Asn Lys Pro Pro Thr
35 40 45Thr Asp Glu Ala Asp Asn Glu Ser Pro Ala Gln Ser Glu Asn Ala Ser50 55 60Thr Leu Thr Thr Thr Asp Ala Ser Ile Asp Asn Thr Val Thr Lys Thr65 70 75 80Tyr Leu Ser Gly Arg Asn Phe Asp Pro Ser Thr Arg Asn Val Lys Leu85 90 95Gly Phe Glu Asn Gln Pro Ile Ser Asp Pro Thr Ser Thr Leu Glu Tyr100 105 110Lys Ala Gln Gln Leu Ala Ile Glu Thr Lys Ala Gln Gln Asp Ala Glu115 120 125Lys Ala Asp Glu Asn Lys Gly Leu Asp Leu Phe Lys Leu Gln Pro Lys130 135 140Lys Pro Asn Trp Asp Leu Lys Arg Asp Leu Glu Gln Lys Ile Lys Pro145 150 155 160Leu Asp Val Gln Thr Glu Asn Ala Ile Ala Arg Leu Val Arg Glu Arg165 170 175Ile Glu Ala Gln Lys Gln Glu Gly Val Lys Gln Val Ala Gly Ala Gly180 185 190Arg Gly Asn Glu Asn Gln Gly Asp Gly Glu Glu Val Gly Met Glu Gly195 200 205Thr Glu Leu Val Glu Ala Met His Leu Lys Glu Gln Glu Glu Glu Arg210 215 220Glu Arg Arg Arg Asp Glu Glu Asp Glu Asp Val Ser225 230 23权利要求
1.真菌中控制次级分生孢子梗分化的基因，梨孢菌中该基因为MgCON2。阻止梨孢菌中该基因的表达导致次生分生孢子梗不能形成，从而分生孢子产生量显著降低。MgCON2的特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列或与其一致性高于40％的蛋白质的多核苷酸。
2.权利要求1所述的真菌控制次级分生孢子梗分化的基因，在梨孢菌中编码的蛋白为MGCON2。该蛋白的特征在于具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №3；2)将序列表中SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并控制次级分生孢子梗分化和分生孢子产量。
3.与序列表中SEQ ID №3具有一致性高于40％的病原真菌小麦赤霉菌(Giberellazeae)、玉米茎腐病菌(Giberelia moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaerianodorum)的同源蛋白质，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID № 5，6，7，8，9。
4.根据权利要求1所述的基因，其特征在于以其为模版合成控制次级分生孢子梗分化所必需蛋白MGCON2的cDNA。该cDNA可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.利用权利要求1所述的控制次级分生孢子梗分化基因MgCON2构建的表达载体、细胞系和宿主菌。
6.根据权利要求1所述的基因，其特征在于具有SEQ ID №4所示核苷酸序列的启动子。该启动子驱动MgCON2在分生孢子梗、分生孢子以及附着胞中特异高水平表达，从而控制次级分生孢子梗分化和分生孢子的产量。
7.权利要求2、3所述的控制次级分生孢子梗分化和分生孢子的产量所需MGCON2蛋白的表达与修饰作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的利用。
8.权利要求1所述MgCON2的基因转录产物的剪切作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的利用
9.权利要求6所述MgCON2基因的启动子及其结合蛋白作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中的应用。
10.权利要求7、8、9所述的抗真菌药剂为抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麦赤霉菌(Giberella zeae)、玉米茎腐病菌(Giberella moniliformis)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的药剂。
全文摘要
本发明从梨孢菌中克隆了一个新基因MgCON2。该基因及其cDNA、编码的蛋白质和启动子分别具有序列表中SEQ ID №1、№2、№3和№4的核苷酸或氨基酸序列。MgCON2在分生孢子梗和分生孢子等中特异表达，其表达破坏导致梨孢菌不能形成次生孢子梗，从而分生孢子产量显著降低。本发明还发现玉米茎腐菌、小麦赤霉菌、油菜菌核菌等病原菌中存在与MGCON2一致性高于40％的蛋白，可能具有相同功能。植物真菌病害的传播和严重度与分生孢子产量呈显著正相关，因此，MGCON2及其同源蛋白的表达与修饰、参与的信号途径及其基因产物的剪切可作为作为重要候选靶标，用于设计和筛选新型抗真菌药剂。
文档编号A01N63/00GK1952149SQ20051010944
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月20日 优先权日2005年10月20日
发明者彭友良, 王维香, 孙静, 赵文生 申请人:中国农业大学