一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法
【专利说明】
[0001]技术领域本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法。
【背景技术】
[0002]本发明公开了亚心形扁藻和球等鞭金藻混合串联培养和快速收集方法。亚心形扁藻Platymonas subcordiformis是一种海洋单细胞微藻，大量出现在沿海池沼和风浪平静的港湾，隶属绿藻门、绿藻纲、团藻目、衣藻科。藻体扁压，细胞前面观呈广卵形，前端较宽阔，中间有一浅的凹陷，鞭毛4条，由凹处伸出。细胞内有一大型杯状绿色色素体。藻体后端有一蛋白核，核附近有一红色眼点。长11-16微米，宽7-9微米，厚3.5-5微米。无性繁殖，当环境不良时形成休眠孢子，椭圆形，一或两个，没发现有性生殖。盐度适应范围广，为8-80%。，最适30-40%。。对温度适应范围也很广，7°C _30°C均能生长繁殖，最适20°C -28°C,33°C以上生长繁殖受抑制，出现黄萎，35°C大量死亡，故南方夏季培养较困难。光度强度1000-200001ux能生长繁殖，最适光强5000-100001ux。在最适光强下，表现趋光性。适应pH值6-9，最适7.5-8.5。该藻适应能力强，生长繁殖迅速，易培养，是许多贝类如扇贝、贻贝、毛蚶、魁蚶、缢蛏幼体(特别是后期幼体)良好饵料。若和等鞭金藻配合使用，能取得更好育苗效果。用来饲喂动物性饵料轮虫、裸腹蚤、丰年虫也有良好营养强化作用。
[0003]球等鞭金藻Isochrysis galbana Parke分类上属金藻门Chrysophyta，金藻纲Chrysophyceae,等鞭金藻目Isochrysidales，等鞭金藻科Isochrysidaceae，等鞭金藻属Isochrysis Parke，是一种无壁单细胞微藻，营光合自养生活，胞内脂肪酸含量高。细胞裸露，形状多变，多椭圆形，幼细胞背腹面略扁平，侧面观为长椭圆或长方形。细胞前端生出两条等长尾鞭型鞭毛，鞭毛平滑，长度为细胞1-2倍。鞭毛基部有液泡。胞内具2个大而伸长侧生色素体，形状和位置随体形而变。一暗红色、卵圆形眼点位于细胞中央，偶有靠近前端。细胞核一个，常位于细胞中间。贮藏物是油滴和白糖素，油滴分布在胞质，白糖素位于细胞后端，为2-5个小块。细胞长4.4-7.1微米，宽2.7-4.4微米，厚2.4-3微米，行二分裂繁殖。适应盐度范围14-40%。，最适30%。，最适温度20-25°C，最适光照1500_60001ux，适宜pH 8左右。该藻无胞壁，大小适口，营养丰富，易被动物幼虫消化吸收，已广泛用于饲喂贻贝、牡蛎、泥蚶等，被认为是海产双壳类动物幼虫的理想饵料。
[0004]目前，亚心形扁藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长。关于海洋微藻的培养方法，过去张卫曾公开了一种亚心形扁藻高密度培养与产氢一体化的制氢方法(申请号CN200810229976)。该发明微藻产氢是将低密度微藻接种于反应器中，利用富加二氧化碳培养方式，经短期培养即可达到产氢所需的生物量，然后再经暗诱导，即可进入连续光照产氢阶段。该发明首次将微藻培养和产氢两段工艺相结合并利用燃料电池将氢转化为电能，为规模化微藻产氢提供了可靠技术支持。但该法基建投资大，工艺繁杂，技术要求高，普通工人难以掌握。韩笑天公开了一种海洋微藻及其培养方法和应用(申请号CN201010515598)，海洋微藻为球等鞭金藻(Isochrysis sp.CCMM5001)，于 2010 年 6 月 7 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M2010138。其培养方法为分离出金藻单个藻细胞，获得的纯种细胞于实验室条件下进行扩大培养；待球等鞭金藻生长的平台期后第四天离心、干燥即得到藻粉。所述球等鞭金藻可作为生物柴油的原料。微藻的培养是利用工业废气中的二氧化碳，缓解温室气体排放，也可吸收工业废气中氮氧化合物，减少环境污染，但该藻株抗逆性差，不耐低温，盐度适应范围狭窄，难以大规模推广。杨海麟发明了一种自养产油微藻的高密度培养工艺(申请号CN201010509643)，采用分割法与二步法相耦合的发酵方法，以火电厂排放的CO2废气为碳源，以过滤除杂菌或杂藻后的市政污水作为培养基，高密度培养产油微藻，较佳地，在市政污水中添加海盐模拟海水，使其渗透压增大防止杂菌或杂藻污染，产油微藻选自小球藻、微拟球藻、布朗葡萄藻、纤细角毛藻、海绿球藻、球等鞭金藻、新月菱形藻、三角褐指藻、杜氏藻和菱形藻的一种或几种，该发明能实现氮、磷及CO2高去除效率且藻浓度、油脂及蛋白含量高，达到保护环境和生产生物资源双重效果，成本低，无污染，综合效益高，但该法工艺流程长，操作麻烦，费时费力，效率低下。传统上收集藻细胞有物理和化学两种方法，物理方法包括离心法、重力沉降法、遮光法、降温法、超声波沉降法、电流沉淀法；化学浓缩法即使用明矾、氢氧化钠、高锰酸钾等试剂沉淀浓缩，常用试剂是明矾。这些收集方法或者耗电多，耗资巨大，或者沉淀效果差，沉淀时间长且沉淀不彻底。
[0005]为了克服传统技术的不足，本发明公开了一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法。本技术的创造性和新颖性表现在:I)摒弃传统的海洋微藻单种养殖的做法，采用对环境因素要求相近的两种微藻-亚心形扁藻和球等鞭金藻混合养殖，优势互补，相互促进，充分利用营养盐和光谱，减少了资源浪费；2)采用三个三角烧瓶串联养殖，通入的气体得到三次利用，节约了能量和资源，且三角烧瓶透光性好，洗刷方便，操作容易，易于观察，不易污染；3)尊重藻细胞的生长规律，根据藻类不同生长阶段对环境条件的特定要求，在培养的早、中、晚期提供不同的光照强度、光照时间和温度，早期给予较低的光照强度和温度，避免强光对微藻的光伤害，有利于生长，晚期提供较高的光照和温度，有利于细胞中EPA、DHA等高不饱和脂肪酸大量积累；4)培养液成分的改革。在传统的f/2培养液基础上补充了NaHCO3, NH4NO3,尿素，人尿，Na2S13,牛粪浸出液，磷酸妈，土壤浸出液，海泥抽取液，NiS14,NH4VO3, Co (NO3) 2，Na2WO2等营养盐，营养更全面均衡，有利于细胞快速生长；5)微藻收集方法的创新。本发明将培养后的藻液加入复合沉淀剂后，将藻液置于5°C低温且黑暗环境，由于沉淀剂的絮凝作用和温度、光照的大幅降低，藻细胞迅速休克，继而沉淀，收集速度快且沉淀彻底，细胞不破碎，营养成分散失少，花钱少，操作简单，实用性强。
【发明内容】
[0006]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法，具体方法如下:
[0007]步骤I培养液的制备
[0008]培养液成分配方！NaHCO3I份，NH4NO30.2份，尿素0.1份，人尿0.5份，Na2S130.005份，f/2微量元素溶液I份，f/2维生素溶液I份，磷酸钙0.2份，牛粪浸出液I份，土壤浸出液 0.8 份，海泥抽取液 0.5 份，NiS14.6H20 0.02 份，NH4VO30.001 份，Co (NO3) 2.6Η200.05份，Na2WO2.2Η20 0.03份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):ZnSO4.4Η20 23 毫克，MnCl2.4Η20 178 毫克，CuSO4.5Η20 10 毫克，FeC6H5O7.5Η203.9克，Na2MoO4.2Η20 7.3 毫克，CoCl2.6Η20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，纯水 1000 毫升；f/2 维生素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):维生素B120.5毫克，维生素B110毫克，维生素H 0.5晕克，纯水1000晕升。
[0009]步骤2接种培养
[0010]取三个5000毫升洁净三角烧瓶，加入步骤I所述培养液2500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的亚心形扁藻和球等鞭金藻藻种分别接种，接种密度亚心形扁藻2.5万个细胞/毫升藻液，球等鞭金藻8万个细胞/毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。用橡皮塞塞住瓶口，塞子上打上2个孔，孔的直径为9毫米，插入两根玻璃管，管的直径为8毫米，一根为充气管，另一根为排气管，第2个瓶的充气管与第一个瓶的排气管相连，第3个瓶的充气管与第2个瓶的排气管相连，这样充入的气体依次经过三个瓶子，可得到3次利用。第一个桶的充气管上端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98% +纯CO2L 5% + —氧化氮0.3% +硫化氢0.2%，每天24小时不间断充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；将这3个三角烧瓶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前3天调节温度至22°C，光照强度45001UX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；第4-6天，调节温度至24°C，光照强度60001uX，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第7天，调节温度至26°C，光照强度SOOOlux，每天24小时连续光照，没有黑暗，每个瓶子补加蒸馏水500毫升。到第9天，亚心形扁藻细胞密度可达600万/毫升藻液，球等鞭金藻藻细胞密度可达到1800万/毫升藻液，即可收集；
[0011]步骤3藻细胞收集
[0012]取硫酸亚铁，甲壳素，氯化铝各1000g，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过200目筛絹为宜)，按硫酸亚铁I份，甲壳素3份，氯化铝2份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合均匀，制成复合沉淀剂，取培养了 9天的藻液1000份，加入所述复合沉淀剂0.4份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，将藻液置于5°C冷柜中(保持黑暗)静置、沉淀24小时，由于沉淀剂的沉淀和温度的突然降低，藻细胞迅速休克且下沉到瓶底，弃上清液，取底部粘稠牙膏状藻泥，藻细胞收集完毕。
[0013]有益结果
[0014]传统上，海洋微藻常采用光生物反应器或开放水泥池培养，基建投资大，工艺繁杂，技术要求高，普通工人难以掌握，成本高，易污染，操作麻烦，费时费力，效率低下。为了克服传统技术的不足，本发明公开了一种海洋微藻的串联培养和快速收集方法。本技术的创造性和新颖性表现在:1)摒弃传统的海洋微藻单种养殖的做法，采用对环境因素要求相近的两种微藻-亚心形扁藻和球等鞭金藻混合养殖，优势互补，相互促进，充分利用营养盐和光谱，减少了资源浪费；2)采用三个三角烧瓶串联养殖，通入的气体得到三次利用，节约了能量和资源，且三角烧瓶透光性好，洗刷方便，操作容易，易于观察，不易污染；3)尊重藻细胞的生长规律，根据藻类不同生长阶段对生态条件的特定要求，在培养的早、中、晚期提供不同的光照强度、光照时间和温度，早期给予较低的光照强度和温度，避免强光对微藻的光伤害，有利于生长，晚期提供较高的光照和温度，促进了细胞中EPA、DHA等高不饱和脂肪酸的大量积累；4)培养液成分的改革。在原来的f/2培养液基础上补充了 NaHCO3,NH4NO3,尿素，人尿，Na2S13,牛粪浸出液，磷酸妈，土壤浸出液，海泥抽取液，Ni