一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片，属于微生物耐 药性检测领域。
【背景技术】
[0002] 微生物在抗生素等外部环境压力下的响应特征，对生态安全性评估等十分重要， 一直受到人们的关注。在响应特性中，最受关注的是微生物的耐药性，因此人们开发和应用 了各种快速检测的方法，用于测定半抑制浓度（ic5(l)或者最小抑制浓度（MIC)。
[0003] 传统方法采用摇瓶或者平板培养的方式，在培养基中添加不同浓度的抗生素，通 过观察光密度值或菌落计数来评估抑制特性。这种方法的优点是定量准确，操作简单，缺点 是耗时较长，一般培养需要过夜，样品或试剂消耗量较大。此外，还可以采用多孔板方法进 行细菌培养，达到并行筛选，快速检测OD的目的。该方法优点是可以节约药剂、缩短实验时 间、并行获取数据等，缺点是仪器价格昂贵、对于生长缓慢和OD值较低的细菌难以观察，限 制了广泛应用。目前被广泛应用的是E-test抑菌试纸条，通过在试纸条上固定浓度梯度的 抗生素，结合平板培养方法，通过抑菌圈与纸条交点直接读出MIC值。优点是简便快速，工 作量小，不足之处是试纸比较昂贵、培养时间较长、只能测定MIC值、不适合研宄抗生素的 混合作用等。
[0004] 由于上述原因和不足，人们开始采用微流控芯片来进行细菌的抗生素敏感性测 试。通过在芯片内建立被测物质的浓度梯度，可以避免人为配制的不准确和费时费力。 建立梯度的方法之一是在微流控芯片的通道中或芯片下方加入多孔介质，如琼脂糖层 等，通过高低浓度之间的扩散形成梯度。琼脂糖是一种凝胶性物质且对微生物没有毒害 作用，且具有大孔扩散的性能，因此比较合适微生物的固定和培养。比如Cheng等（Lab Chip，2007, 7(6) : 763-769)在芯片的琼脂糖层中设置三个通道，两边通道分别持续通入高 浓度溶液和空白液体，中间通道放入细菌。高浓度物质通过琼脂糖层向空白方向扩散，从而 在中间通道形成稳定的浓度梯度；Si等（LabChip, 2012, 12(7) : 1389-1394)在芯片通道中 间滴入液态琼脂糖，待凝固后可将通道两侧分离，在一侧滴入目标物质后可通过琼脂糖结 构慢慢扩散，从而在另一侧形成浓度梯度。Ahmed等（NanoLett，2010, 10 (9): 3379-3385) 设计了三种不同结构的微流控芯片，都是通过琼脂糖层的扩散在测试通道可形成线性及非 线性的浓度梯度。
[0005] 上述方法可以在数个小时之内快速获得抑制特征，得到MIC值，从而克服传统方 法的不足。但上述方法也存在不足之处，主要包括：（1)微生物一般都标记荧光便于检测， 但在实际测试中细菌一般都难以标记荧光；（2)在芯片上完成测试需要精密控制的注射 泵，而在普通实验室或移动野外操作中难以满足要求；（3) -般只能得到MIC值，而难以获 得IC5Q值或者整条抑制曲线。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速检测微生物耐药性的方法及专用微流控芯片，该微 流控芯片可实现微生物的原位培养、梯度暴露和实时观察，不需要注射泵，芯片的关键部件 可以重复使用；微生物不需要有荧光，普通微生物即可。利用该微流控芯片，能够实时观察 到微生物在不同药物浓度下的生长状态，从而快速获得药物对微生物的抑制特征。
[0007] 本发明提供的微流控芯片，它由依次叠加的聚二甲基硅氧烷层（PDMS层）、琼脂糖 层和透明板组成；
[0008] 所述聚二甲基硅氧烷层设有两个通孔；
[0009] 所述琼脂糖层由琼脂糖和分散于其中的微生物组成，由所述透明板支撑。
[0010] 上述微流控芯片中，两个所述通孔分别用于储存药物和所述微生物的培养基，所 述通孔的孔径为5?8mm，两个所述通孔的中心距离为6?10mm，以保证在两个所述通孔之 间形成合适范围的浓度梯度和便于显微镜定位观察。
[0011] 上述微流控芯片中，所述聚二甲基硅氧烷层的厚度为5?8mm;所述琼脂糖层的厚 度为0. 03?0. 05mm，微生物接近单层生长。
[0012] 上述微流控芯片中，所述微生物为细菌。
[0013] 上述微流控芯片中，所述透明板可为玻璃板、石英玻璃板或者透明塑料板，具体可 为盖玻片，便于观察。
[0014] 上述微流控芯片在使用时，在所述PDMS层上方还可设有一所述透明板，具体操作 为在两个所述通孔中分别加入所述微生物的培养基和药物，然后在所述PDMS层上方覆盖 所述透明板，以避免空气中微生物进入所述通孔内及液体（培养基）的蒸发；
[0015] 所述透明板可为玻璃板、石英玻璃板或者透明塑料板，具体可为盖玻片。
[0016] 本发明进一步提供了上述微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
[0017] (1)在所述聚二甲基硅氧烷层上打孔得到所述通孔；
[0018] (2)将所述微生物分散于所述琼脂糖中，制得琼脂糖和微生物的混合液；
[0019] (3)将所述琼脂糖和微生物的混合液滴加到所述透明板上，用步骤⑴得到的聚 二甲基硅氧烷层按压后粘合，经凝固即可得到所述微流控芯片。
[0020] 上述制备方法，步骤（2)中，所述微生物以微生物悬浊液的形式添加，所述微生物 处于对数期；
[0021] 所述琼脂糖以琼脂糖水溶液的形式添加，所述琼脂糖水溶液形成的薄层溶液在室 温下保持20min后即凝固为多孔胶体，可用于固定微生物；所述琼脂糖为低熔点琼脂糖，其 熔点可为60?70°C;所述琼脂糖水溶液在使用前灭菌；
[0022] 所述微生物悬浊液与所述琼脂糖水溶液的体积比可为1 :1?2,具体可为1 :1 ;
[0023] 所述微生物悬浊液的0D6(J直可为0. 2?0. 4,具体可为0. 2 ;所述琼脂糖水溶液中 琼脂糖的质量百分含量可为2?4%，具体可为3%。
[0024] 本发明进一步提供了一种利用上述微流控芯片快速检测微生物耐药性的方法，包 括如下步骤：
[0025] (1)在两个所述通孔中，分别加入药物和所述微生物的培养基；
[0026] (2)在步骤⑴后的0?6小时内，拍摄所述观察区域内不同位置处所述微生物的 照片，得所述观察区域内不同位置处所述微生物随时间变化的生长情况；
[0027] 取2?6小时中某一时刻所述观察区域内不同位置处所述微生物的照片，具体可 在步骤（1)后的4小时这一时刻观察所述微生物的形态，采用图像软件计算所述观察区域 内不同位置处所述微生物的群落大小，根据所述药物的浓度和所述微生物的群落大小即可 对所述微生物的耐药性进行检测；
[0028] 所述观察区域为两个所述通孔的边缘之间的最短连线处所述药物在所述琼脂糖 层内扩散形成的区域。
[0029] 上述方法中，所述药物以溶液的形式进行添加，所述药物的溶液为将所述药物溶 于所述微生物的培养基中得到。
[0030] 上述快速检测微生物耐药性的方法还包括采用荧光素模拟所述药物，即根据所述 观察区域内不同位置处所述荧光素的浓度，得所述观察区域内不同位置处所述药物的浓度 的步骤：
[0031] (1)在两个所述通孔中，加入相同浓度的荧光素的水溶液，加入20?30min后，具 体可在30min后，用荧光显微镜拍摄所述观察区域内的照片，利用图像软件计算得到该浓 度下的荧光强度，取出该浓度的荧光素的水溶液，加入更高浓度的荧光素的水溶液，得不同 浓度的荧光素水溶液的荧光强度，以所述荧光素的浓度为横坐标，以荧光素的荧光强度为 纵坐标，建立标准曲线；
[0032] 所述荧光素水溶液的浓度为OmM?20mM;
[0033] (2)在两个所述通孔中，分别加荧光素的水溶液和水，扩散0?6h时，